Белки как инфекционные агенты

Стенли Прузинер (Stanley B.Prusiner) родился 28 мая 1942 г. в США. В 1964 г. окончил университет штата Пенсильвания, а через четыре года там же получил степень доктора медицины. В 1968 г. начал работать в Калифорнийском университете, где и трудится поныне. С 1984 г. - профессор. Обладатель 11 почетных наград, полученных от научных фондов разных стран в 1991 - 1996 гг.

Немаловажным обстоятельством, повлиявшим на выбор Нобелевского комитета, вероятно, послужил и тот общественный резонанс, который получила проблема прионных заболеваний в последнее время. Что же такое прионы, в чем их уникальность и каково их значение? Ответы на эти вопросы помогут понять, почему исследования прионов удостоены Нобелевской премии.

Прионы отличаются от всех прочих инфекционных патогенов (вирусов, бактерий и др.) тем, что у них отсутствует какой-либо геном, т.е. ДНК или РНК. Предполагается, что именно такие инфекционные агенты вызывают группу неизлечимых дегенеративных заболеваний центральной нервной системы человека и животных. Наиболее известные из них у человека - это болезнь Крейцфельда - Якоба (БКЯ) и синдром Гертсмана - Штраусслера - Шейнкера (ГШШ), а у животных - скрeйпи овец и губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, называемые иногда в средствах массовой информации чесоткой овец и коровьим бешенством или губчатым энцефалитом. Эти заболевания, независимо от того, у кого они возникли - у человека или животных, сопровождаются морфологическими изменениями тканей мозга и появлением в них амилоидоподобных бляшек, содержащих палочкообразные белковые агрегаты. Уникальная особенность этих заболеваний состоит в том, что они возникают не только в результате инфекции: известны спорадические и наследственные формы БКЯ и ГШШ, причем вне зависимости от своего происхождения болезнь может передаваться далее инфекционным путем.

Заболевания, ныне относимые к прионным, известны у животных более 200 лет, а у людей - с начала века, однако их активные исследования стали возможны лишь в последние 50 лет. В 60-х годах работы К.Гайдушека (D.C.Gajdusek), удостоенного в 1976 г. Нобелевской премии, показали, что заболевания, ныне относящиеся к прионным, инфекционны1. Первое наблюдение инфекционности скрейпи в 1946 г. было случайным: стадо овец иммунизировали вакциной, выделенной из животного, которое, как оказалось впоследствии, было больно скрейпи. Несмотря на то, что эту вакцину обработали формалином, около 10% привитых животных заболели скрейпи. Впоследствии удалось подтвердить, что ткани мозга больных овец действительно содержат инфекционный агент, который при инъекции здоровому животному может вызвать скрейпи. У человека болезни этого типа также отнесли к инфекционным, поскольку мозг людей, умерших от БКЯ, содержал инфекционное начало, способное заразить человекообразных обезьян. Веским аргументом в пользу гипотезы о заразности такого заболевания для человека стали и эпидемилогические исследования на о-вах Новой Гвинеи. До 70-х годов нашего века коренное население островов страдало от эпидемии болезни, называемой там "куру". Длительные исследования позволили установить, что передача данного заболевания связана с обычаем ритуального каннибализма, при котором в знак уважения к умершим родственникам их полагалось съедать. С прекращением этой традиции исчезла и эпидемия куру. В сумме подобные исследования привели к выводу об инфекционности данного класса нейродегенеративных заболеваний человека и животных.

Дальнейший прогресс в изучении прионов связан с введением в обиход модельных животных - мышей и хомячков, что позволило сократить длительность экспериментов по передаче скрейпи с нескольких лет до нескольких месяцев. Выяснилось, что агент скрeйпи свободно проходит через фильтры, задерживающие одноклеточные патогены (бактерии, грибы и т.д.), вследствие чего некоторое время скрейпи считали особым, "медленным" вирусом. Однако затем обнаружилось, что этот агент устойчив к воздействиям, убивающим вирусы и любые живые клетки (обработка формалином, ультрафиолетовое облучение). В то же время инфекционный агент был чувствителен к протеазам и воздействиям, денатурирующим белок. Таким образом, получалось, будто данный патоген представляет собой инфекционный белок, что находилось в серьезном противоречии с основными постулатами молекулярной биологии. Чтобы разрешить этот парадокс, математик Дж.Гриффит (J.S.Griffith) предположил, что данный вирус имеет совершенно необычную природу - не содержит никакого генетического материала, а представляет собой особую измененную форму одного из клеточных белков, способную воспроизводить свои свойства за счет автокаталитического механизма. В то время эта гипотеза была лишь одной из многих, и лишь последующие труды Прузинера и других исследователей показали, что она верна.

Исследования прионов, принесшие впоследствии широкое признание, Прузинер, медик по образованию, начал в 1972 г., после гибели одного из своих пациентов от деменции, вызванной БКЯ. В 1982 г. он вместе с коллегами выделил агент скрейпи и показал, что это белок. Прузинер назвал этот агент прионом (PROtein INfectious agent), а белок - PrP (Prion Protein). Определение аминокислотной последовательности PrP позволило в 1985 г. идентифицировать кодирующий его ген Prnp. Этот ген обнаружили в геномах всех млекопитающих, а также у птиц. Получение антител к PrP позволило определить его тканеспецифическую экспрессию и субклеточную локализацию - он оказался мембранным белком, экспрессирующимся независимо от прионной инфекции. Функция белка PrP неясна, однако он не является жизненно важным. Удаление гена Prnp делало животных невосприимчивыми к прионной инфекции, что подтвердило ключевую роль PrP. Прионная форма PrP (PrPSc) отличается от нормальной клеточной формы (PrPC) повышенной гидрофобностью и склонностью к агрегации, а также гораздо более высокой устойчивостью к протеазам. Поиск первопричины этих отличий обнаружил, что прионная форма PrP не отличается какими-либо ковалентными модификациями, но имеет измененную конформацию с повышенным содержанием бета-складчатой структуры. Эти результаты составляют основу современного знания о прионах. Конечно, Прузинер и его лаборатория не были единственными, кто получил все описанные результаты, однако его лидирующая роль несомненна. В настоящее время концепцию прионов как инфекционных белков можно считать доказанной, хотя время от времени и появляются работы, пытающиеся связать инфекционность прионов с вирусами. Присуждение Нобелевской премии, видимо, свидетельствует о победе прионной теории.

Современные представления о прионах позволяют предполагать следующий механизм инфекции: патогенный белок PrPSc, попадая в клетку (или связываясь с ней, поскольку PrPC в норме локализован на поверхности клеток), способствует путем белок-белковых взаимодействий превращению нормального клеточного белка PrPC в прион PrPSc. В случае спорадических или наследственных прионных заболеваний возникновение PrPSc из PrPC происходит спонтанно. При этом наследственные болезни связаны с аллелями Prnp, кодирующими белки, которые имеют повышенную склонность к такому спонтанному превращению. Сам механизм прионного превращения до сих пор не ясен. Например, неизвестно, участвуют ли в этом процессе какие-либо другие молекулы, кроме PrP. При смешивании очищенных PrPC и PrPSc нормальный белок превращается в патогенный, однако эффективность этого процесса весьма низка. Таким образом, участие других молекул не обязательно, но может играть вспомогательную роль.

Существуют две основные модели, описывающие передачу прионных свойств белком PrPSc (см. рисунок). Согласно первой, гетеродимерной модели Прузинера, прионное состояние присуще мономеру PrP, который катализирует конформационный переход PrPC в PrPSc через образование комплекса PrPC : PrPSc. При этом агрегация PrPSc рассматривается как вторичный процесс, несущественный для прионообразования. Однако многие исследователи, в том числе авторы данной статьи, придерживаются иной, полимеризационной модели. В этой модели прион - это упорядоченный полимер PrP, который можно было бы назвать одномерным кристаллом. Наличие такого полимера необходимо для дальнейшей полимеризации, подобно тому, как кристаллизация соли из перенасыщенного раствора требует присутствия мельчайших кристалликов в качестве затравки. Особенность прионной кристаллизации состоит в том, что одновременно с присоединением белковой молекулы к кристаллу значительно меняется ее конформация. Этот механизм не беспрецедентен: предполагается, что так образуются фибриллы амилоидообразующих белков, которых сейчас известно 16. Вероятно, прионы представляют собой инфекционную разновидность амилоидных фибрилл.

Несмотря на отсутствие генома, у прионов существуют межштаммовые отличия, которые сохраняются при пассировании в линейных мышах, т.е. на выравненном генетическом фоне. Наличие штаммов прионов плохо объясняется гетеродимерной моделью Прузинера: нельзя представить множество различных конформаций мономера PrP, не только обладающих стабильностью, но и способных к точному воспроизведению. В полимерной же модели межштаммовые отличия объясняются различными типами укладки белка PrP в фибриллы. Возможность укладки одного белка в различные кристаллические формы неоднократно наблюдалась ранее в случае обычной, трехмерной кристаллизации. Понятно, что каждый тип укладки может воспроизводиться при полимеризации неограниченно долго.

Первичная структура белка PrP имеет лишь небольшие отличия у разных видов млекопитающих и человека. Это открывает неприятную возможность передачи прионных заболеваний от животных к человеку, хотя на самом деле она сильно затруднена между различными видами. Этот эффект, называемый межвидовым барьером, отражает необычайно высокую чувствительность прионообразования к изменениям аминокислотной последовательности приона. В последнее время, в связи с распространением бычьей энцефалопатии (БСЕ), активно обсуждается вопрос о вероятности передачи ее человеку через зараженное мясо. Принципиальную возможность такой передачи сейчас можно считать доказанной, но на практике она достаточно мала: в мире насчитывается не более 20 случаев, в которых предполагается заражение людей БСЕ. При уменьшении масштабов эпизоотии БСЕ и надлежащем контроле за качеством мяса вероятность заражения можно свести к минимуму.

Разработка теории прионов и ее признание позволили выявить прионоподобные механизмы у совершенно иных организмов - у дрожжей Saccharomyces и гриба Podospora . В свою очередь открытие прионов у низших эвкариот придает новое звучание самой проблеме, подчеркивая, что эти белки - общебиологическое явление, а не экзотический случай.

У пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae известны два нехромосомно наследуемых генетических фактора - [PSI+] и [URE3]. По своему фенотипическому проявлению они совсем не похожи: один связан с дефектом терминации синтеза белка, а другой - с регуляцией метаболизма азота. Однако их генетические характеристики очень близки и отличаются от свойств обычных генов: они наследуются как детерминанты, локализованные в цитоплазме; на них не действуют обычные мутагены, зато их можно устранить при помощи разнообразных воздействий, вызывающих стресс. В частности, эти факторы крайне чувствительны к малым концентрациям гидрохлорида гуанидина, вещества, которое вызывает денатурацию белков, но лишь при гораздо более высоких концентрациях; существование каждого из этих нехромосомных факторов зависит от наличия белков Sup35 (фактора трансляции) или Ure2 (регулятора метаболизма азота) соответственно. Оба фактора не могут представлять собой какие-либо эписомные плазмиды, поскольку их потери обратимы - после исчезновения факторы могут возникать вновь, причем частота их возникновения возрастает в сотни раз при сверхэкспрессии соответствующего белка.

Эти и некоторые другие свойства обоих факторов не поддавались объяснению с точки зрения "нормальной" генетики, однако все они стали совершенно понятными, когда в 1994 г. Р.Уикнер (R.B.Wickner) предположил, что наличие в клетке факторов [PSI+] или [URE3] связано с прионоподобным состоянием белков Sup35 или Ure2. За короткий срок гипотезу подтвердили биохимики, показав, что свойства этих белков действительно весьма похожи на свойства прионов. В прионном состоянии Sup35 или Ure2 образуют агрегаты и проявляют повышенную устойчивость к протеазам. Поскольку в отличие от прионов млекопитающих функции этих белков известны, удалось объяснить и фенотипы, вызываемые их прионным состоянием. Агрегация препятствует основной функции этих белков, и поэтому фенотипы [PSI+] и [URE3] соответствуют снижению или отсутствию активности Sup35 и Ure2. Кроме того, прионное превращение Sup35 воспроизвели in vitro с весьма высокой эффективностью. Также in vitro было замечено, что очищенный белок Sup35p способен самопроизвольно полимеризоваться в высокоупорядоченные фибриллы, подобные амилоидным у человека. Такие фибриллы, вероятно, составляют структурную основу прионных агрегатов Sup35p in vivo. Столь быстрый прогресс во многом связан с тем, что дрожжи S.cerevisiae - один из наиболее разработанных молекулярно-биологических объектов. Путь, который Прузинер и другие исследователи прионов млекопитающих начали в 1982 г., в генетике дрожжей пройден за три года. А некоторые результаты, полученные на дрожжах, не имеют аналогов в исследованиях PrP и, значит, дополняют их.

Так, использование дрожжей выявило новый фактор, существенный для поддержания дрожжевых прионов. Стабильное поддержание фактора [PSI+] зависело от активности одного из белков теплового шока, Hsp104, который в норме необходим для разрушения агрегатов денатурированных белков. Интересно, что как отсутствие, так и сверхэкспрессия Hsp104 изгоняли фактор [PSI+]. Это наблюдение может иметь простое, хотя и парадоксальное объяснение. Не исключено, что Hsp104 действует на прионные агрегаты Sup35p так же, как и на агрегаты денатурированных белков, т.е. пытается их растворить, отделяя от них молекулы и возвращая им правильную конформацию. Если в клетке белка Hsp104 много, он растворяет все агрегаты и, следовательно, изгоняет [PSI+]. При нормальном уровне Hsp104 он успевает лишь делать разрывы в фибриллах Sup35p. При этом возрастает количество концов фибрилл, по которым происходит полимеризация, а значит, возрастает и общая скорость полимеризации. Таким образом, конечный эффект Hsp104 противоположен его исходной функции! Кроме того, фрагментация важна и для наследования прионов, т.е. для их передачи в дочерние клетки при клеточных делениях, поскольку один агрегат, хоть и очень большой, трудно разделить на две клетки. Таким образом, фрагментация белком Hsp104 замыкает жизненный цикл приона Sup35, который можно представить себе как чередование роста и фрагментации.

Прионы млекопитающих скорее всего также представляют собой одномерно-кристаллические фибриллы, и для них возможен аналогичный механизм. Действительно, у животных имеется белок, подобный Hsp104, хотя, возможно, в фрагментации PrPSc участвуют и какие-то другие факторы - это предстоит выяснить. В любом случае фрагментация полимера PrPSc критична для размножения патогена, и воздействие на ген HSP104 или другие факторы фрагментации могло бы стать одним из перспективных подходов при лечении прионных болезней.

Выявление прионов у дрожжей показало их широкую распространенность в природе и стимулировало их поиск у других организмов. Так, у мицелиального гриба Podospora найден белок Het-s, прионные свойства которого определяют совместимость различных штаммов этого гриба при скрещивании.

Изначально прионам приписывали роль инфекционных агентов белковой природы, ответственных за возникновение некоторых нейродегенеративных заболеваний человека и животных. Обнаружение прионоподобных белков у низших эвкариот расширило круг прионов, в котором ни инфекционность, ни болезнетворность не обязательны. Например, амилоиды, образование которых характерно не только для прионных заболеваний, по большей части неинфекционны, а прионы дрожжей инфекционны лишь в ограниченном смысле: они передаются с цитоплазмой, но не через внеклеточное пространство. У млекопитающих прионы и амилоиды ассоциируются с болезнями, однако у гриба Podospora и у дрожжей наследуемое переключение активности белков, вызванное их переходом в прионное состояние, скорее всего имеет адаптивное значение. Значит, инфекционность прионов - это лишь частный случай некоторого более широкого явления. Ключевое звено этого феномена - уникальный механизм передачи конформации между молекулами одного белка, который, вероятно, реализуется через образование одномерно-кристаллических фибрилл. Такой механизм - действительно неизвестное ранее фундаментальное свойство белковых молекул. Сомнительно, чтобы в природе не нашлось полезного применения такому уникальному свойству. По всей видимости, в скором будущем можно ожидать открытия новых процессов, использующих прионный принцип, в том числе и у высших организмов. Например, некоторые авторы считают, что способность к наследуемой регуляции функции прионных белков могла бы использоваться при клеточной дифференцировке и раковой трансформации.

Таким образом, исследования Стенли Прузинера могут оказаться лишь началом интересного и многообещающего направления в современной биологии - изучения прионов.

В.В.Кушниров,
кандидат биологических наук

М.Д.Тер-Аванесян,
доктор биологических наук

История
1933 год. Из Германии в Исландию завезены овцы для развития каракулеводства. Период адаптации к новым условиям среды всегда связан с повышенной заболеваемостью. Однако скрейпи овец (медленно развивающееся инфекционное заболевание) было выделено отдельно, так как имело долгий, никак не проявляющий себя инкубационный период, сверхмедленное прогрессирующее течение, странное поражение органов (мозг, селезенка) и неотвратимую смерть. Так, в 1954 году Б. Сигурдсон научными исследованиями скрейпи закрепил за собой имя первооткрывателя прионных болезней.
Три года спустя у папуасов Новой Гвинеи обнаружено заболевание куру, связанное с поеданием сырого мозга умерших родственников. Ритуальный каннибализм приводил к неспешно проявляющимся симптомам идентичной скрейпи болезни. К.Гайдушек установил инфекционный путь передачи куру (Нобелевская премия 1976 года).
1992-2000 годы. Достигла максимума эпизоотия среди крупного рогатого скота Великобритании. Мирно пасущиеся животные вдруг начинали носиться по полю, кидаться друг на друга, дико мычать, а затем умирали. Коровье бешенство оказалось той же болезнью, что и известная прежде лишь у овец скрейпи. Выяснилось, что она заразна и для людей - в Европе погибло около 150 человек, заболело 3,8 млн голов крупного рогатого скота. Американец С.Прузинер, открывший возбудитель недуга - патогенные белки-прионы, был удостоен Нобелевской премии 1997 года. Эпизоотию удалось погасить, но лечить это заболевание ни у людей, ни у животных медицина пока не в состоянии. Этот случай привел к созданию жесткой системы контроля мяса. Заодно был обнаружен человеческий аналог коровьего бешенства - болезнь Кройтцфельдта - Якоба, до того неизвестная, поскольку встречается по статистике один случай на миллион. По симптомам она похожа на другие психиатрические недуги (нарушение координации движений, слабоумие).

Биологическое оружие
XXI века?
На сегодня известно, что нормальный прионный белок PrP обнаруживается в клетках цнс, лимфатических тканях. Его патогенная модификация совпадает по аминокислотной последовательности с нормальной, но имеет другую пространственную структуру: при переходе в патогенное состояние часть -спиралей превращается в листоподобные -складчатые слои, образуя множество водородных связей, стабилизирующих инфекционную пространственную структуру. Клеточная функция нормальной формы PrP пока неясна, патогенная форма вызывает заболевания. Инфекционный PrP не только устойчив к деградации (УФ, нагревание, проникающая радиация, протеазы), но также может перестраивать нормальную форму, превращая ее в подобие себя по цепной реакции. Со временем прионы с нарушенной конформацией формируют фибриллы в нервных клетках, приводя к гибели нейронов и в конце концов к смерти особи.
Патогенные формы прионов могут вызывать ряд тяжелых заболеваний: болезнь Кройтифельда - Якоба, семейная фатальная бессонница у человека и губчатая энцефалопатия у крупного рогатого скота, норок, лосей и оленей, кошачьих, экзотических животных, скрейпи овец и коз, которые на данный момент неизлечимы. Практически ничто не способно инактивировать неправильный белок: ни высокие температуры, ни повышенное давление, ни даже обугливание не снижают степень его патогенности. На него не влияют и протеолитические ферменты кишечника. Получается, что животное, употребившее такой белок в пищу, может заразиться само и заразить других особей через экскременты или прах. Напрашивается предположение, что при таком положении дел прионы могут стать мощнейшим биологическим оружием ХХI века.
Доказана внутривидовая передача прионных заболеваний: коровье бешенство при кормлении скота костной мукой, куру при ритуальном каннибализме. Однако иногда инфекция передается межвидово, например, от животных к человеку, хотя при этом болезнь развивается не столь эффективно, реже поражая мозг. Но в любом случае болезнь возникает спорадически, и при ее развитии амилоидные структуры в мозговой ткани разрастаются как губка (отсюда и название - губчатая энцефалопатия). Этот процесс характерен и для недугов пожилого возраста - Альцгеймера и Паркинсона - с печально известными симптомами в виде патологического ухудшения памяти и утраты способности к обучению, поэтому, разгадав загадки прионов, человечество может надеяться если не победить, так отсрочить старение (по И.Мечникову срок человеческой жизни составляет 140 лет).

Загадочный механизм
Белки физиологически существуют в виде пространственных структур, и их конформация слишком важна и сложна, чтобы изменяться случайным образом. Биофизик В.Астбэри когда-то предположил, что нефункциональные фибриллы образуются в результате денатурации (необратимого изменения природной структуры белковой глобулы) под стрессовым воздействием свойств среды. Сейчас известно, что внутриклеточные природные процессы - окисление, фосфорилирование, гликолизирование - могут приводить к изменению термодинамических параметров белков, высвобождая энергию, за счет которой возможен рефолдинг (пересворачивание) белка в неправильную структуру.
К сожалению, в настоящее время механизм, обеспечивающий спорадическое возникновение заболевания, остается загадкой. Пока что человечеству известны наследственные варианты заболевания благодаря открытию гена, кодирующего аминокислотную последовательность PrP. В этом случае происходит мутационное изменение первичной структуры белка, стимулирующее его превращение в прион. Наконец, существует инфекционная форма развития заболевания при проникновении патогенной формы приона в организм.

​Светлана ХОРОНЕНКОВА, кандидат химических наук

Может быть, за это кто-то назовет его неживым, что будет совершенно справедливо. Но посмотрим, как он это делает. Весь секрет приона в том, что это белок, который может принимать различные структуры. Более того, одна из этих структур, которая является патогенной, обладает способностью к информационному катализу, то есть она, встретившись с нормальной белковой молекулой, изменяет ее структуру так, что та становится патогенной молекулой.

В результате эти молекулы начинают агрегировать, образовывать отложения внутри организма. Кроме того, они активируются, теряют свою функцию. Но это, может быть, не так важно, потеря функции не столь важна, страшна для организма, как именно накопление этих белков. Дело в том, что в своей патогенной форме они весьма устойчивы к протеазам, как правило, и поэтому они накапливаются и дальше нарушают жизнедеятельность клетки, потом и целого организма, и затем с неизбежностью наступает смерть.

В практической медицине прионы в силу своих необычных свойств также отличаются необычными свойствами, а именно — их очень трудно инактивировать. Обычно всяческую инфекцию, бактерии или вирусы, уничтожают, например, автоклавированием, то есть прогревом до 120 градусов. В случае приона это далеко не всегда срабатывает. Еще один способ инактивации — обработка формалином, который просто ковалентно прошивает белковые молекулы. В случае приона это опять же не срабатывает совершенно, потому что внутренняя прошивка для него неважна, для него имеет значение лишь внешняя поверхность.

Прионные болезни известны примерно с начала XVIII века. Тогда никто не понимал, что они прионы и что это такое вообще. Но наблюдали болезнь скрейпи у овец, по-русски называемую почесухой. Болезнь проявлялась в сильном зуде, и овцы, соответственно, стремились тереться обо что угодно.

Дальше пауза, где-то в начале XX века Крейцфельд и Якоб обнаружили еще одну болезнь, позже названную прионной. Собственно, она и носит их имя. Это болезнь уже у человека, опять же нейродегенеративное заболевание, то есть нарушающее нервную систему, при котором в мозге образовывались обширные микрополости. То есть мозг превращался в подобие губки. Объяснение пришло значительно позже.

Но дальше уже началось серьезное изучение приона, который все более и более вставал загадкой. Было понятно, что это вирус, то есть некая инфекция, которая фильтруется через достаточно тонкие фильтры.

Но, в отличие от обычных вирусов, которые сравнительно быстро развивали болезнь, этот вирус развивал болезнь очень медленно.

Инкубационный период мог длиться десятилетиями.

В те времена, где-то в районе 1960-х годов, был такой популярный метод определения размера инфекционных агентов — его обрабатывали радиацией. И чем больше размер генома, тем менее устойчив к радиации он был. И английский радиобиолог Тиквах Альпер определила радиационную устойчивость приона. Оказалось, что его размер должен быть совершенно маленьким, порядка 100 нуклеотидов. И понятное дело, что на 100 нуклеотидов никакой нормальный даже белок невозможно закодировать.

Дальше в дело вступили уже более серьезные силы. В частности, Стенли Прузинер в Калифорнии попытался выделить этот белок. Большой прогресс в его работе связан с тем, что он перешел на маленьких модельных животных, а именно на мышей и хомячков, что, конечно, позволило сильно ускорить работу. А там ведь, когда выделяешь этот агент, его нужно постоянно тестировать. То есть ты выделил и вколол мышкам, чтобы они, бедные, через год заболели и умерли. Тоже недолго, тоже все это очень трудоемко.

За эти исследования Прузинер в конце концов получил Нобелевскую премию, что я считаю совершенно справедливым, поскольку он практически ввел новый принцип, хотя не он его придумал, но он его доказал — прионный принцип, что инфекция может происходить без ДНК и РНК.

Затем следующий заметный эпизод: в середине 1990-х годов прион показал свою силу и опасность. Была известная история с эпидемией бешенства коров, которая произошла в Великобритании в середине 1990-х годов. Дело в чем? Экономные британцы в рацион своим коровам добавляли измельченную костную муку, то есть останки других животных. И в какой-то момент оказалось, что некоторые из этих животных имели прионную болезнь. Здесь-то все и началось. Оказалось по ходу, что человек также восприимчив к коровьему приону, хотя и не очень сильно восприимчив, но тем не менее. Почти 300 человек заразились прионной болезнью, поедая говядину. И надо сказать, что все они умерли: эта болезнь не имеет лечения.

Прототипом прионной болезни было трансмиссивное нейродегенеративное заболевание овец — таинственная смертоносная скрейпи (или почесуха овец). Ранние исследования показали, что агент скрейпи необычайно устойчив к лечению, которое нейтрализует другие патогены, и может годами оставаться на пастбищах. То, что агент скрейпи проявляет устойчивость, в частности, к радиации, привело к тому, что в 1960-х годах Дж. С. Гриффит и Тиквах Альпер предположили, что он представляет собой новый класс патогенов, который не имеет собственного нуклеинового генома и может быть аномальной самовоспроизводящейся формой белка или мембраны. Между тем описания патологии мозга, вызванной человеческой болезнью куру в Папуа — Новой Гвинее, которые выполнил Карлтон Гайдушек, привели Уильяма Хэдлоу к мысли, что куру похожа на скрейпи овец, и Хэдлоу порекомендовал, чтобы куру испытали на передаваемость от людей к другим приматам. Гайдушек успешно проделал эту работу и показал, что люди племени форе заболевали куру во время ритуальных каннибалистских праздников. Яркой особенностью куру и других прионных заболеваний, часто скрывавшей их причины, является длительный инкубационный период между заражением и появлением клинических признаков, который у людей может превышать четыре десятилетия.

Моя лаборатория в сотрудничестве с Питером Лэнсбери показала, что связанные с заболеваниями формы PrP сами могут вызвать трансформацию нормальных молекул PrP в аномальные формы. В этих реакциях превращения мы выявили поразительные биохимические особенности, которые помогли объяснить характеристики известных штаммов прионов и барьеры их передачи между разными видами. Однако, чтобы однозначно доказать, что прионы состоят из повторно свернутых агрегатов PrP и им не нужны специфически-прионные нуклеиновые кислоты, потребовалось разработать методы непрерывной бесклеточной амплификации прионов или реакции образования прионов de novo. Они первоначально были созданы лабораториями Сото, Супаттапоне и Прузинера в 2000-х годах; до того времени было трудно полностью исключить вероятность того, что эти заболевания вызваны неопознанными вирусами.

К сожалению, многие из стандартных методов, на которых долгое время базировались исследования обычных патогенов, — генетика патогенов, серология, рентгеноструктурный анализ, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) — чрезвычайно трудно применить к прионам. Без каких-либо специфических патогенных генов, которые можно было бы секвенировать или подвергнуть мутации, многие стандартные генетические и обратные генетические подходы к выявлению структуры и функции патогенов не работают. Поскольку прионы состоят из белков организма-хозяина, иммунный ответ хозяина на патоген очень мал; таким образом, провести простое серологическое обнаружение прионных инфекций, основанное на взаимодействии с антителами, очень сложно. Кроме того, прионы млекопитающих, как правило, плотно упакованы, сильно гликозилированы и связаны с другими молекулами организма-хозяина, и поэтому даже специфические прионные конформационные эпитопы (поверхности, распознаваемые антителами) на агрегатах PrP трудно обнаружить и использовать. Все попытки определить трехмерные структуры прионов на протяжении уже долгого времени заходят в тупик, так как очищенные прионы имеют агрегированный, но некристаллический характер.

В течение многих лет единственным способом обнаружения и анализа прионов млекопитающих был биоанализ животных, который даже на самых быстрых моделях — грызунах — длился от нескольких месяцев до одного года. В конкретном организме разные штаммы обычно можно различить по периодам инкубации, невропатологическим паттернам и биохимическим признакам связанных с болезнью отложений PrP или прионов.

К счастью, в последнее время были разработаны мощные бесклеточные амплификационные анализы прионов, такие как циклическая амплификация прионной формы белка (PMCA), вибрационно-индуцированный конверсионный анализ в режиме реального времени (RT-QuIC) и анализ клеток скрейпи. Эти методы основаны на присущем прионам механизме репликации. И PMCA, и RT-QuIC чрезвычайно чувствительны: они могут усилить присутствие прионов в триллион раз, почти до точки обнаружения нескольких прионных частиц. Реакции PMCA распространяют инфекцию прионов, тем самым отражая и освещая многие аспекты прионной биологии, в то время как анализы RT-QuIC, как правило, не распространяют полностью инфекционные прионы, но обеспечивают более быстрые, более практичные и более высокопроизводительные методы их обнаружения, и, таким образом, они стали самыми современными инструментами в диагностике прионных заболеваний. Как PMCA, так и RT-QuIC в некоторых случаях помогают различать важные штаммы прионов у определенных видов организмов-хозяев.

В выявлении базовой структуры прионов наблюдается медленный прогресс. При помощи полупроводниковых ЯМР-исследований была обнаружена молекулярная архитектура некоторых прионов грибов и прионоподобных фибриллярных структур PrP млекопитающих. Электронная кристаллография, дифракция волокон и криоэлектронные микроскопические исследования помогли описать ключевые структурные ограничения прионов млекопитающих, но применение этих и, возможно, других структурных биологических методов еще нужно улучшить.

Разобраться в структуре и механизмах репликации прионов млекопитающих, по крайней мере на молекулярном уровне, крайне сложно. Сначала нужно объяснить, как неправильно свернутые белки могут распространяться в роли патогенов, не перенося своего собственного нуклеинового генома. Затем следует также объяснить, как белки с единой последовательностью аминокислот, такие как PrP того или иного животного-хозяина, могут образовывать разные штаммы прионов, которые исправно распространяются и вызывают различные фенотипы болезни без генетических мутаций, объясняющих вариации штаммов в обычных патогенах.

Множество исследований указывает на то, что прионы млекопитающих — это упорядоченные скопления нескольких молекул PrP, плотно упакованных и часто фибриллярных или нитевидных. Молекулы PrP (мономеры) в прионах по сравнению с нормальными свободными молекулами PrP пересвернуты практически полностью. Когда правильные молекулы PrP включаются в растущие прионные агрегаты, эти агрегаты вызывают их рефолдинг, причем прионы действуют как штамм-специфические шаблоны или затравки, которые каким-то образом придают свои собственные аберрантные формы каждой входящей молекуле, контролируя стабильную репликацию своего штамма.

За рамками этого грубого описания детали структуры и распространения прионов на молекулярном уровне остаются неясными. Также нерешенным остается вопрос о том, как прионы распространяются за пределы исходного места заражения в организме-хозяине. Существующие данные свидетельствуют о том, что наиболее эффективная межклеточная передача прионов связана с мембранозными структурами, такими как экзосомы или туннелирующие нанотрубки, — скорее всего, потому, что прионы обычно связаны с мембранами липидными якорями; однако возможность этих мембранных структур способствовать распространению прионов in vivo еще предстоит определить. Очень важно понять механизмы распространения прионов, поскольку способности различных неправильно свернутых белковых агрегатов распространяться внутри и между клетками, тканями и индивидами определяют то, действуют ли они как инфекционные патогены или являются относительно безобидными сбоями белкового метаболизма.

Многие виды млекопитающих, включая людей, низших приматов, крупный рогатый скот, овец, коз, оленей, лосей, кошек, норок, грызунов и различных экзотических копытных, восприимчивы к прионным заболеваниям PrP. Но такими являются не все виды: собаки и лошади, судя по всему, представляют собой заметные исключения. Разные виды обычно экспрессируют несколько разные нормальные молекулы PrP, и различия в аминокислотной последовательности PrP могут сильно влиять на восприимчивость хозяина к входящим прионным инфекциям. Например, люди, как известно, до некоторой степени восприимчивы к губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (ГЭКРС), но, по-видимому, устойчивы к скрейпи овец и, насколько нам известно, хронической изнуряющей болезни оленей. По какой-то причине лесные полевки и беличьи обезьяны необычайно восприимчивы к широкому спектру прионных инфекций других видов.

Механизмы, с помощью которых прионные инфекции вызывают нейродегенеративные заболевания, нам пока неизвестны. Агрегаты различных прионных штаммов в организмах-хозяевах разных видов могут накапливаться преимущественно в разных областях центральной нервной системы и вызывают ряд невропатологических расстройств. Очевидно, что конечным эффектом по крайней мере частичного повреждения является сбой в работе нейронов и их потеря, что вызывает множество клинических симптомов и приводит к летальному исходу. Известно, что ряд нейрофизиологических процессов и путей нарушается, но многое еще предстоит определить относительно того, связаны ли такие нарушения с прямой или косвенной токсичностью прионов и в какой степени та или иная недостаточность или комбинация недостаточностей наиболее ответственна за кончину больного.

У людей причины прионных заболеваний могут быть генетическими (из-за специфических мутаций гена PrP), приобретенными (вызванными заражением — например, воздействием куру, ГЭКРС или другим содержащим прионы материалом) или спорадическими (неизвестного происхождения; обычно предполагается, что они обусловлены спонтанным образованием прионов у конкретного индивидуума). Подавляющее большинство прионных заболеваний человека являются спорадическими, и среди них наиболее распространена спорадическая болезнь Крейтцфельдта — Якоба (sCJD), заболеваемость которой в год во всем мире составляет примерно один случай на миллион населения. Ряд различных мутаций в гене PrP может вызывать множество семейных прионных заболеваний, при этом некоторые мутации являются полностью пенетрантными (всегда вызывающими болезнь у носителей мутации), а другие — менее пенетрантными. Клинические симптомы и прогрессирование болезни могут заметно различаться в разных организмах-хозяевах и при разных типах прионных заболеваний, но могут включать деменцию, расстройство координации, бессонницу, галлюцинации, жесткость мышц, спутанность сознания, усталость и затрудненность речи.

В последнее время были достигнуты значительные успехи в том, чтобы точно и относительно неинвазивно диагностировать прионные заболевания человека у живых пациентов на основе новых прион-специфических тестов мазков из носа, спинномозговой жидкости, крови, мочи или кожи. Например, RT-QuIC-тестирование спинномозговой жидкости и/или материалов назальной щеточной биопсии может достигать 100% точности при диагностике спорадической болезни Крейтцфельдта — Якоба. Эти тесты выгодны потому, что измеряют возбудителей прионной болезни, но они еще не полностью проверены и не рекомендованы официально такими организациями, как ВОЗ. В остальном диагностика спорадических прионных заболеваний у людей зависит в первую очередь от совокупности клинических признаков, результатов сканирования мозга, электроэнцефалограмм и других биомаркеров, которые вместе могут иметь высокую диагностическую чувствительность, но не полностью специфичны для прионных болезней.

Несмотря на описанные выше недавние успехи в разработке новых прионных тестов, действующие руководящие принципы таковы: для окончательной диагностики спорадического или приобретенного прионного заболевания необходимо невропатологическое исследование тканей головного мозга, полученных в результате биопсии (что редко) или аутопсии. Полагаю, в скором времени эти рекомендации будут изменены, в них будут включены новые, менее инвазивные прижизненные тесты для выявления прионов. К сожалению, несмотря на то, что этот прогресс в раннем диагностировании прионных болезней должен улучшить перспективы разработки и применения терапевтических средств, в настоящее время доступных методов лечения, которые доказали бы свою эффективность в клинических испытаниях, не существует.

Действительно, последний вопрос представляет собой важный рубеж в изучении многих заболеваний, связанных с неправильным образованием белков, особенно тех, которые связаны с патогенным накоплением аномальных фибриллярных белковых отложений (например, амилоидных фибрилл и бляшек). Эти болезни включают в себя болезни Альцгеймера, Паркинсона и Гентингтона, а также боковой амиотрофический склероз, лобно-височные деменции, хроническую травматическую энцефалопатию и диабет второго типа. Различные белки организма-хозяина образуют скопления при этих и многих других заболеваниях, но, как и прионы, такие скопления обычно растут за счет включения в затравку нормальных растворимых молекул белка. Таким образом, потенциал для прионоподобного распространения белков существует на молекулярном уровне. Также растет количество доказательств того, что множество различных связанных с болезнями белковых отложений может расти и распространяться так же, как и прионы, вызывая патологии после инокуляции в локализованные участки у подопытных животных.

Результаты этих исследований поднимают насущные вопросы о том, могут ли многочисленные заболевания, основанные на повторном фолдинге белка, — а они зачастую гораздо более распространены, чем прионные заболевания, основанные на PrP, — быть переданы людям или животным в реальных условиях. Болезнь Крейтцфельдта — Якоба передается между людьми через трансплантацию тканей, инъекции гормонов, полученных от трупов, переливание крови и зараженные медицинские инструменты. Вторым фактором в таких ятрогенных передачах является тот факт, что прионы часто не полностью инактивируются стандартными процедурами клинической дезинфекции.

Еще предстоит установить, могут ли быть определены другие типы потенциально прионоподобных, ассоциированных с болезнями агрегатов белка, которые также могут быть устойчивы к инактивации и при этом способны инициировать или ускорять патогенные процессы у людей. Я не знаю никаких эпидемиологических указаний на то, что это так, но дальнейшее тщательное изучение этого вопроса кажется оправданным.