Противовирусную активность in vivo
Проведённый сравнительный анализ эффективности Ингавирина ® и этиотропных химиопрепаратов (Арбидол ® и Ремантадин ® ) в отношении вируса гриппа A (H3N2) в чувствительных постоянных культурах клеток свидетельствует о том, что исследуемый препарат в изученных концентрациях эффективно подавляет цитопатическую активность вируса, формирование специфического гемагглютинина и репродукцию вируса (по накоплению).
Ключевые слова: грипп А, Ингавирин ® , противовирусная эффективность, культура клеток.
S. YA. LOGINOVA, S. V. BORISEVICH, I. V. SEMENOVA, V. A. MAKSIMOV, V. P. BONDAREV, V. E. NEBOLSIN
Virological Centre of the Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad Valenta Pharmacevtica, Moscow
The comparative analysis of the efficacy of Ingavirin ® and etiotropic chemotherapeuticals, such as Arbidol ® and Remantadin ® , against the influenza virus A (H3N2) performed with the use of susceptible permanent cell cultures showed that in the used concentrations Ingavirin was efficient in inhibition of the virus cytopathic activity , formation of the specific hemagglutinin and reproduction of the virus (by the accumulation).
Key words: influenza virus A, Ingavirin ® , antiviral efficacy, cell culture.
Одним из первых этапов доклинического исследования новых лекарственных противовирусных препаратов является оценка их активности в чувствительных культурах клеток в отношении вируса гриппа. В связи с тем, что различные типы и линии клеток обладают разной чувствительностью к воздействию противовирусных препаратов, оценку их эффективности нередко проводят с использованием нескольких типов и линий клеток [1]. Использование нескольких культур клеток позволяет более достоверно осуществлять оценку активности существующих и новых лекарственных соединений.
Целью наших исследований являлось изучение эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин ® в отношении экспериментальной гриппозной инфекции in vitro.
Культуры клеток. Использованы постоянные культуры клеток почек зеленых мартышек — GMK-AH-1(Д), почек свиньи — СПЭВ и почек собаки — MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% сыворотки крупного рогатого скота соответственно.
Противовирусную эффективность препаратов in vitro оценивали по следующим показателям:
— снижение уровня накопления вируса под воздействием препарата (Δ, lg);
— коэффициент ингибирования (Ки), %;
— подавление цитотоксической активности вируса, %.
Уменьшение уровня накопления вируса под влиянием препарата (Δ, lg) определяли по формуле:
где Ак — уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата (lg ЦПД50/МЛ); Ао — уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (lg ЦПД50/мл).
Коэффициент ингибирования (Ки, %) рассчитывали по формуле:
где Аконтр — уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата, (ЦПД50/мл); Аоп — уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (ЦПД50/мл).
Оценка противовирусной эффективности используемых лекарственных препаратов осуществлена в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета РФ [1]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по Стьюденту [2]
Результаты и обсуждение
Исследования препаратов проводили по нескольким направлениям: изучение подавления цитотоксичности вируса, формирования специфичного гемагглютинина и репродукции вируса в монослое культуры клеток.
Результаты оценки токсичности Ингавирина ® для постоянных культур клеток GМК-АН-1(Д), СПЭВ и MDCK свидетельствуют, что в концентрациях от 20 до 1000 мкг/мл препарат не вызывает визуально наблюдаемых изменений во всех использованных культурах клеток [3].
В работе использовали максимально эффективные дозы Ремантадина ® и Арбидола ® (1/2 от максимально переносимой концентрации), составляющие 50 и 25 мкг/мл соответственно. Более высокие их концентрации токсичны для исследуемых культур клеток, а более низкие менее эффективно ингибируют репродукцию вируса гриппа [3]. В то же время Ингавирин ® использовали в концентрации 200 мкг/мл, составляющей 1/5 от максимально переносимой концентрации.
При изучении влияния препаратов на цитотоксическую активность вируса в культурах клеток MDCK, GМК-АН-1(Д) и СПЭВ (табл. 1) было установлено, что Ингавирин ® в концентрации 200 мкг/мл подавляет способность вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), вызывать цитопатический эффект в монослое культур клеток (через 72 ч после инфицирования) на 64—70%. Изучение влияния Ингавирина ® на динамику (через 12, 24, 48, 72 ч после инфицирования) репродукции вируса в культурах клеток свидетельствует о том, что в первые двое суток после инфицирования препарат полностью ингибирует цитопатическую активность возбудителя и формирование специфического гемагглютинина.
Таблица 1.
Сравнительная эффективность Ингавирина ® по подавлению цитопатической активности вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в постоянных культурах клеток
| Препарат | Концентрация препарата, мкг/мл | Культура клеток | Коэффициент подавления ЦПД, % (Хср.±σхср) |
| Ингавирин ® | 200 | GMK-АН-1(Д) | 66,7±3,3 |
| 100 | 50,0±0,0 | ||
| Арбидол ® | 25,0 | 33,3±3,3 | |
| Ремантадин ® | 50,0 | 80,0±5,7 | |
| Ингавирин ® | 200 | MDCK | 64,0±1,3 |
| 100 | 58,0±3,3 | ||
| Арбидол ® | 25,0 | 40,0±3,1 | |
| Ремантадин ® | 50,0 | 86,0±2,4 | |
| Ингавирин ® | 200 | СПЭВ | 70,0±0,0 |
| 100 | 60,0±5,8 | ||
| Арбидол ® | 25,0 | 36,7±3,3 | |
| Ремантадин ® | 50,0 | 83,3±3,3 |
Наименее эффективно подавляет цитотоксическую активность вируса Арбидол ® , коэффициент ингибирования — 33—40%.
Результаты исследования по выявлению специфического гемагглютинина в поддерживающей среде культур клеток GМК-АН-1(Д), MDCK и СПЭВ (табл. 2) в присутствии лекарственных препаратов свидетельствуют о том, что Ингавирин ® подавляет формирование гемагглютинина (через 72 ч после инфицирования) соответственно на 87,5, 85,0 и 87,5%; Ремантадин ® — на 97,9, 96,9 и 96,7%; Арбидол ® — на 33,3, 50,0 и 58,3%.
Таблица 2.
Сравнительная эффективность Ингавирина ® по подавлению образования специфического гемагглютинина вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в постоянных культурах клеток
| Препарат | Концентрация препарата, мкг/мл | Культура клеток | Коэффициент подавления ЦПД, % (Хср.±σхср.) |
| Ингавирин ® | 200,0 | GMK-AH-1(Д) | 87,5±0,0 |
| 100,0 | 75,0±0,0 | ||
| Арбидол ® | 25,0 | 33,3±16,7 | |
| Ремантадин ® | 50,0 | 97,9±2,1 | |
| Ингавирин ® | 200,0 | MDCK | 85,0±1,3 |
| 100,0 | 80,0±1,1 | ||
| Арбидол ® | 25,0 | 50,0±0,0 | |
| Ремантадин ® | 50,0 | 96,9±0,0 | |
| Ингавирин ® | 200,0 | СПЭВ | 87,5±0,0 |
| 100,0 | 75,0±0,0 | ||
| Арбидол ® | 25,0 | 58,3±8,3 | |
| Ремантадин ® | 50,0 | 96,7±0,0 |
Исследования по изучению подавления репродукции вируса в культурах клеток MDCK и GMK-AH-1(Д) исследуемыми препаратами выявили, что препарат Ингавирин ® эффективно подавляет репродукцию вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в культурах клеток через 72 ч после инфицирования. Референс-препарат Ремантадин ® также эффективно подавляет репродукцию вируса in vitro, в отличие от препарата Арбидол ® (табл. 3). Учитывая результаты изучения цитотоксичности Ингавирина ® и противовирусной эффективности можно сделать вывод о том, что величина ХТИ (химиотерапевтический индекс) для этого препарата более 10.
Таблица 3.
Сравнительная эффективность Ингавирина ® в отношении вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), по подавлению репродукции вируса в постоянных культурах клеток (n=3)
| Препарат | Концентрация препарата, мкг/мл | Культура клеток | Уровень подавления накопления вируса, Δ, lg (Хср.±σхср.) | Коэффициент ингибирования, % (Хср.±σхср.) |
| Ингавирин ® | 200 | GMK-AH-1(Д) | 2,3±0,1 | 99,1±0,1 |
| 100 | 1,4±0,2 | 92,2±0,2 | ||
| Арбидол ® | 25 | 1,5±0,1 | 92,5±0,2 | |
| Ремантадин ® | 50,0 | 4,8±0,1 | 99,99±0,1 | |
| Ингавирин ® | 200 | MDCK | 2,2±0,1 | 99,4±0,1 |
| 100 | 1,4±0,1 | 96,0±0,1 | ||
| Арбидол ® | 25 | 1,8±0,1 | 98,4±0,1 | |
| Ремантадин ® | 50,0 | 4,9±0,1 | 99,99±0,2 |
Исторически Ремантадин является эталонным препаратом, эффективным в отношении вируса гриппа А, и применяющийся для сравнительной оценки противовирусных средств in vitro и in vivo на модельных штаммах вируса гриппа, чувствительных к нему [4, 5]. Однако проблема быстрого появления резистентных штаммов к Ремантадину (в США в сезон 2005—2006 г. циркулировало более 90% резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А (H3N2), а в Российской Федерации в сезон 2007—2008 г. — до 77% резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А (H3N2)) на фоне проводимого лечения гриппозной инфекции определила запрет на применение препаратов адамантанового ряда в ряде стран мира на протяжении последних трёх эпидемических сезонов [6].
Таким образом, проведённый сравнительный анализ эффективности Ингавирина ® в отношении вируса гриппа А (H3N2) в чувствительных постоянных культурах клеток в сравнении с референс-препаратами (ремантадин и Арбидол ® ), свидетельствует о том, что Ингавирин ® эффективно подавляет цитопатическую активность вируса, формирование специфического гемагглютинина и репродукцию вируса (по накоплению) и может быть рекомендован в качестве средства выбора противовирусной терапии при гриппе.
1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: 2005.
2. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: 1990.
3. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А., Бондарев В. П. Оценка токсичности неспецифических медицинских противовирусных средств, предназначенных для профилактики и лечения опасных и особо опасных вирусных инфекций. Антибиотики и химиотер 2009; 54: 3-4: 11-14.
4. Saelens X., Vanlandschoot P., Martinet W. et al. Protection of mice against a lethal influenza virus challenge after immunization with yeast-derived secreted influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem 1999; 260: 1: 166-175.
5. Yingsakmongkon S, Miyamoto D, Sriwilaijaroen N. et al. In vitro inhibition of human influenza A virus infection by fruit-juice concentrate of Japanese plum (Prunus mume SIEB. et ZUCC). Biol Pharm Bull 2008; 31: 3: 511-515.
6. Бурцева E. И., Шевченко E. С., Белякова H. В. и др. Мониторинг чувствительности выделенных в России эпидемических штаммов вирусов гриппа к этиотропным химиопрепаратам. Вопр. вирусол 2009; 5: 25-28.
Введение
В настоящее время арсенал лекарственных средств для противовирусной терапии включает химиопрепараты этиотропного действия, средства для иммунокорригирующей, патогенетической и симптоматической терапии. Открытие нового вирусного агента требует тестирования уже известных антивирусных препаратов в отношении этого вируса и проведения всего комплекса научных исследований по созданию новых антивирусных препаратов, эффективных в отношении вновь обнаруженных вирусов. Другим аспектом этой проблемы является возникновение лекарственной устойчивости у хорошо известных вирусных агентов [2]. Поэтому вопрос о необходимости разработки и поиска новых противовирусных препаратов представляется особо актуальным. Одним из приоритетных направлений развития современных противовирусных препаратов в медицине является поиск биологически активных соединений, обладающих лечебными свойствами, из природных источников.
Благодаря исследованиям последних десятилетий стало известно, что базидиальные грибы являются продуцентами целого ряда биологически активных веществ: белков, липидов, полисахаридов, органических кислот, ферментов, витаминов и др. [1; 5; 7]. Установлено, что биологически активными соединениями, подавляющими репродукцию вирусов, являются терпеноиды. Так, при анализе антивирусной активности экстракта базидиального гриба Ganoderma pfeifferi в отношении вируса гриппа А и вируса простого герпеса 1 типа установлено, что основным антивирусным компонентом экстракта были тритерпеноиды: ганодермадиол, луцидодиол, апланоксиновая кислота G. В грибе чага Inonotus obliquus, обладающем противоопухолевыми и антивирусными свойствами, также выделены терпеновые соединения [4]. Из несовершенных грибов такими свойствами могут обладать нематофаговые (хищные) грибы, которые представляют собой уникальную экологическую группу грибов-микромицетов, являющихся естественными врагами паразитических нематод. В механизме хищничества существенную роль играют сесквитерпеновые соединения [1]. Объем публикаций, посвященный базидиомицетам, чрезвычайно велик, в то время как практически нет работ по исследованию противовирусной активности нематофаговых грибов. Имеется информация по ряду биологически активных веществ (БАВ), участвующих в процессе зоотрофного питания нематофаговых грибов. К ним относятся аттрактанты, привлекающие нематод; нематициды, обездвиживающие нематод и участвующие в разрушении их внешних оболочек при прорастании гиф гриба внутрь тела пойманной нематоды, а также ферменты.
В настоящей работе проведено исследование противовирусных свойств водных экстрактов базидиомицетов и нематофагового гриба в отношении вируса гриппа в экспериментах in vitro и in vivo.
Материалы и методы
Референс-препарат. Тамифлю, 75 мг, капсулы (cерия В1367В01, Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд., Швейцария, Roche).
Определение противовирусной активности экстрактов грибов in vitro. В исследованиях по определению противовирусной активности грибных экстрактов использовали их максимально переносимые концентрации (МПК). Готовили разведения вируссодержащей жидкости от 1 до 8 с десятикратным шагом на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности грибных экстрактов в профилактической схеме на монослой культуры клеток MDCK вносили образцы в объеме 50 мкл/лунку в максимально нетоксичной концентрации, после инкубирования клеток при температуре 37 °С в атмосфере 5% CO2 в течение 1 ч вносили разведения вируссодержащей жидкости в объеме 50 мкл/лунку и вновь инкубировали клетки в течение 2-3 суток при температуре 37 °С в атмосфере 5% CO2. По окончании инкубирования клеток регистрировали цитопатическое действие вируса (ЦПД) в монослое клеток с помощью инвертированного микроскопа и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами петуха [6]. Определяли индекс нейтрализации (ИН, в lg) вируса гриппа по формуле: ИН=Титрконтроль-Титропыт.
Определение протективных свойств экстрактов макро- и микромицетов в отношении вируса гриппа в экспериментах in vivo. В опытах по изучению протективных свойств экстрактов грибов в отношении вируса гриппа использовали следующие схемы: экстренно профилактическую - экстракты вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) через час после заражения вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) или A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), далее экстракты вводили 1 раз в сутки в течение 5 суток; лечебно-профилактическую - экстракты вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) за час до заражения вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) или A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), далее экстракты вводили 1 раз в сутки в течение 5 суток. За животными наблюдали в течение 14 суток. Высчитывали процент выживаемости животных в опыте и контроле, коэффициент защиты (КЗ) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей. КЗ высчитывали по формуле: % гибели мышей в контроле - % гибели мышей в опыте [6]. Все опыты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами, оценивали доверительный интервал для 95%-ной вероятности.
Результаты и обсуждение
Изучение протективных свойств экстрактов грибов макро- и микромицетов в отношении вируса гриппа в культуре клеток MDCK. В экспериментах по изучению противовирусной активности использовали экстракты грибов в дозах, нетоксичных для монослоя клеток. Эксперименты in vitro показали, что грибные экстракты обладают вируснейтрализующим эффектом в отношении вируса гриппа. Индекс нейтрализации (ИН) вирусов гриппа для большинства образцов составлял 1,4-7,5 lg. Наибольшим нейтрализующим действием в отношении вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) в профилактической схеме введения экстрактов обладали образцы №№ 07-45, 09-78, 09-80, 09-92 и 09-93, а в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) - образцы №№ 09-76, 09-78, 09-80, 09-92, 09-93 и 09-65 ПС (образец, содержащий полисахариды) (табл. 1). В лечебной схеме применения грибных экстрактов наибольший противовирусный эффект обнаружили образцы №№ 08-09, 09-65 ПС и 11-72 в отношении вируса гриппа A субтипа A/H3N2 и образцы №№ 09-65 ПС и 09-66 ПС в отношении вируса гриппа субтипа A/H5N1 (табл. 2). Изучение противовирусной активности образцов, приготовленных на основе гриба-микромицета (Duddingtonia flagrans), обнаружило значительный противовирусный эффект в отношении обоих используемых штаммов вируса гриппа. Так, при лечебном применении экстрактов культивированной биомассы хищного гриба (№ 10-70) и культуральной жидкости (№ 10-70 КЖ) ИН были выше 4,0 lg как в отношении штамма А/Aichi/2/68 (H3N2), так и в отношении штамма A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) (табл. 1). В эксперименте с профилактической схемой введения грибных образцов ИН в отношении штамма субтипа A/H3N2 составляли 2,68±0,39 и 4,30±0,65 для образцов №№ 10-70 КЖ и 10-70 соответственно, а в отношении штамма другого субтипа - A/H5N1 ИН были максимальными в данных экспериментах и составляли 5,21±0,49 и 5,85±0,32 для этих образцов соответственно.
Таким образом, экстракты плодовых тел грибов макромицетов и экстракты нематофагового гриба микромицета Duddingtonia flagrans в экспериментах in vitro значительно подавляют репродукцию вируса гриппа разных субтипов. Изучение протективных свойств экстрактов грибов макро- и микромицетов в отношении вируса гриппа в экспериментах in vivo. В опытах in vivo, проведенных по лечебно-профилактической схеме, введенный мышам экстракт базидиомицета Inonotus obliquus (образец № 12-11) обнаружил протективную активность в отношении вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2), коэффициент защиты этого образца составил 20% при выживаемости животных - 60% (табл. 3). Экстракты всех других исследованных базидиомицетов (образцы №№ 09-11/8, 11-109 и 12-15) не проявили протективной активности (табл. 3). В инфицированной группе сравнения (введение Тамифлю) и контрольной инфицированной группе (введение дистиллированной воды) выжило 90 и 40% животных соответственно, при этом коэффициент защиты для Тамифлю составил 50%. Более высокие показатели защиты инфицированных мышей были обнаружены в экспериментах, проведенных по экстренно профилактической схеме с образцами (№№ 10-70 и 10-70 КЖ) на основе хищного гриба Duddingtonia flagrans: доля выживших животных, инфицированных вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2), составила 80 и 60% соответственно, а коэффициент защиты - 65 и 45% соответственно (табл. 4). В контрольных группах (введение Тамифлю и дистиллированной воды) выжило 100 и 15% животных соответственно, при этом коэффициент защиты для Тамифлю составил 85% (табл. 4). В аналогичных экспериментах с образцом № 10-70 показатели защиты мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц - A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), были ниже таковых в отношении вируса гриппа субтипа A/H3N2. Так, доля выживших инфицированных животных при введении образца № 10-70 и коэффициент защиты составляли 19%, в контроле (введение Тамифлю) значения обоих данных показателей составляли 40% (табл. 4). Средняя продолжительность жизни животных, инфицированных вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2), при введении им образцов № 10-70 и Тамифлю была достоверно выше по сравнению с СПЖ зараженных этим же вирусом мышей контрольной группы (без введения препарата) (табл. 4).
Заключение
Таким образом, водные экстракты грибов макромицетов и микромицетов обладают противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1 в экспериментах in vitro и in vivo, что делает перспективными дальнейшие исследования по использованию их для разработки профилактических и лечебных препаратов против гриппа.
Таблица 1 - Противовирусная активность экстрактов макро- и микромицетов в клетках MDCK, инфицированных вирусом гриппа
(профилактическая схема) (М±m, n=3)
Образец
Индекс нейтрализации (Титр контроль - Титр опыт), lg
Глотова Т.И. 1 , Глотов А.Г 2 ., Семенова О.В 3 ., Зубкова Н.В. 4
ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ НАТРИЯ КАПРИЛАТА В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ крупного рогатого скота В ОПЫТАХ IN VITRO
В экспериментах in vitro показана противовирусная активность каприлата натрия в отношении вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.
Ключевые слова: противовирусная активность, цитотоксичность, инфекционная активность.
Glotova T.I. 1 , Glotov A.G. 2 , Semenova O.V. 3 , Zubkova N.V. 4
1 Doctor of Biological Sciences, Professor, head of the Laboratory of Virology, 2 Doctor of Veterinary Sciences, Professor, head of the Laboratory of Virology, 3 PhD in biological, Institute of Experimental Veterinary of Siberia and the Far East, 4 Doctor of Biological Sciences branch of NPO “Microgen” the Health Ministry
ANTIVIRAL ACTIVITY OF SODIUM CAPRYLATE AGAINST CONCERNING OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUSES OF CATTLE
In experiences in vitro investigated antiviral activity of sodium caprylate against concerning of bovine viral diarrhea viruses of cattle.
Keywords: the antiviral activity, cytotoxicity, infectivity.
Натрия каприлат – это натриевая соль каприловой (октановой) кислоты (С7Н15COOH), которая является одноосновной предельной карбоновой кислотой. В водном растворе натрия каприлат диссоциирует, образуя каприлат-ион, который уже более 50 лет используется производителями препаратов крови в качестве фракционирующего агента и стабилизатора альбумина [2, 4]. Недавно стало известно, что он обладает вирусинактивирующим действием, механизм которого еще недостаточно изучен. Полагают, что вирулицидным эффектом обладают недиссоциированные формы каприловой кислоты, образующиеся в водных растворах натрия каприлата при кислом значении рН, оптимально 4,0-4,8. Благодаря наличию неполярных связей С-О и С-Н, этот агент может внедряться в оболочку вируса, разрыхляя ее и препятствуя слиянию суперкапсида вируса с мембраной клетки [9, 10].
В последние годы эти свойства каприлат-иона заинтересовали производителей препаратов крови, и они начали использовать каприлат натрия в технологии производства иммуноглобулинов с целью повышения их вирусной безопасности, а также для достижения более высокого уровня очистки и выхода целевого продукта. Эффективность новой технологии в отношении основных гемотрансмиссивных вирусов подтверждена экспериментально. Кроме того, были продемонстрированы ее преимущества по сравнению с традиционной для иммуноглобулинов сольвент-детергентной обработкой
[8 – 10].
В России каприлатная обработка иммуноглобулинов находится на стадии внедрения, оптимальные технологические режимы пока не отработаны. Поэтому изучение вирулицидных свойств этого реагента на модельных вирусах в опытах in vitro является чрезвычайно актуальной проблемой.
Целью настоящей работы было определение цитотоксичности и противовирусной активности натрия каприлата в отношении вируса ВД-БС КРС при различных схемах его применения в условиях in vitro в культуре клеток.
Материалы и методы
В работе использовали референтный цитопатогенный штамм ВК-1 (ВИЭВ, г. Москва) вируса вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС); перевиваемую культуру клеток коронарных сосудов теленка (КСТ) (ВИЭВ, г. Москва); натрия каприлат (Sigma-Aldrich) (стерильный раствор 200 ммоль; рН 4,5-4,8).
Противовирусную активность натрия каприлата в отношении вируса ВД-БС КРС определяли в культуре клеток КСТ, выращенной в 24-луночных микропланшетах. Монослой заражали вирусом ВД-БС КРС в дозе 5 lgТЦД50/0,1см3. Через 1,5 часа его отмывали питательной средой без сыворотки крови и вносили раствор натрия каприлата в нетоксичных для культуры клеток дозах (20,0 ммоль/см3, 2,0 ммоль/см3, 0,2 ммоль/см3), в контрольном опыте добавляли питательную среду без натрия каприлата.
Титры вируса определяли микрометодом в 96-луночных планшетах с монослоем культуры клеток КСТ, использованием не менее 4 параллельных рядов и выражали в ТЦД50/0,1 см3 (50%-я тканевая цитопатическая доза).
Противовирусный эффект натрия каприлата изучали в культуре клеток КСТ, которую обрабатывали нетоксичной дозой натрия каприлата (20,0 ммоль/см3), обладающей наибольшей противовируной активностью, в объеме 100 мкл на лунку за 1 ч до заражения клеток вирусом ВД-БС КРС (в дозе 1 ТЦД на клетку), в момент заражения и через 1 ч после инфицирования. В контрольные лунки не добавляли препарат. Результаты исследования способности каприлата натрия защищать инфицированные клетки путем предотвращения развития цитопатогенного действия вируса учитывали через 72 часа инкубации в сравнении с контрольной группой.
Статистическую обработку данных проводили в соответствии с общепринятыми методами [1].
Результаты и обсуждения
Вирус гепатита С, как известно, представляет опасность для реципиентов плазмы крови и препаратов, из нее изготовленных. Случаи инфицирования пациентов этим вирусом после применения некоторых препаратов из плазмы крови, включая иммуноглобулины, были зафиксированы [5]. Но одной из главных причин, по которой в настоящее время затруднен поиск эффективных вирусинактивирующих реагентов, направленных против гепатита С, является отсутствие удобной модельной биосистемы для размножения возбудителя этого заболевания, при которой бы количественно регистрировались жизнеспособные полноценные вирусные частицы.
ВД-БС КРС филогенетически близок к вирусу гепатита С, относится к тому же семейству Flaviviridae и имеет сходные биологические характеристики, при этом он абсолютно безопасен для исследователей. Поэтому он является наиболее приемлемой моделью вируса гепатита С для проведения исследований по оценке противовирусной активности реагентов, используемых в технологии производства препаратов крови [6].
Изучение цитотоксичности необходимо для того, чтобы правильно выбирать вирусинактивирующую дозу препарата. Оценку цитотоксичности проводили по четырех крестовой системе, анализируя морфологию клеток и целостность монослоя.
В результате разведения препарата от 20,0 ммоль/см3 и выше не оказывают цитотоксического действия на клетки.
Исследование противовирусной активности препарата проводили, используя три нетоксичные для культуры клеток дозы натрия каприлата (0,2; 2,0 и 20,0 ммоль/см3). Культуру клеток КСТ инфицировали 5,0 lg ТЦД50/0,1см3 вируса ВД-БС КРС штамм ВК-1.
На рисунке 1 представлены результаты снижения инфекционного титра вируса при обработке различными дозами натрия каприлата. Наибольшая редукция отмечена при концентрации натрия каприлата 20,0 ммоль/см3, титр вируса снизился до 2,37 lgТЦД50/0,1см3 в сравнении с контролем – 5,25 lgТЦД50/0,1см3.Остальные дозы натрия каприлата (2,0 ммоль/л и 0,2 ммоль/см3) снижали инфекционный титр вируса до 2,5 и 2,87 lgТЦД50/0,1см3. Следовательно, разница титров вируса в опытных и контрольных образцах была более чем в 2,5 lgТЦД50/см3, что свидетельствует о выраженной противовирусной активности натрия каприлата.
Рис. 1 – Определение противовирусной активности натрия каприлата в отношении вируса ВД-БС КРС
Актуальным является поиск противовирусных препаратов, оказывающих лечебное и лечебно-профилактическое действие, эффективно подавляющих или снижающих репликацию вируса в клетках. Поэтому целью следующего этапа работы было изучение способности натрия каприлата защищать инфицированные клетки путем предотвращения развития цитопатогенного действия вируса. Для этого выбрали наиболее эффективную в противовирусном отношении концентрацию испытуемого препарата – 20,0 ммоль/см3. По результатам наших исследований каприлат натрия в этой концентрации защищает 100% клеток от цитопатогенного действия вируса.
Натрия каприлат вносили в культуру клеток за 1 ч до заражения, в момент заражения и через 1 ч после адсорбции вируса на клетках. В контрольные лунки с инфицированной культурой клеток его не вносили. Результаты исследования представлены на рисунке 2.
Рис. 2 – Противовирусный эффект натрия каприлата (концентрация – 20 ммоль/см 3 ) в отношении вируса ВД-БС КРС
Полученные результаты свидетельствуют о том, что натрия каприлат обладает выраженным вирулицидным действием в отношении вируса ВД-БС и может быть использован для дальнейших исследований с целью изучения возможности его применения для обработки препаратов крови в качестве эффективного вирусинактивирующего реагента, направленного против вируса гепатита С.
1. Ашмарин И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов / И.П. Ашмарин, Н.Н. Васильев, В.А. Амбросов. – Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974. – 76 с.
3. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – 2-е изд. – Москва, 2005. – 832 c.
4. Allary, M. Use of sodium caprylate for the separation of plasma proteins /M. Allary, J. Saint-Blancard// Ann Pharm Fr. – 1973. Vol. 7, №31. – Р. 513-520.
5. Bresee, J.S. Hepatitis C virus infection associated with administration of intravenous immune globulin. A cohort study / J.S. Bresee, E.E. Mast // JAMA. – 1996. Vol.19, № 276. – Р. 1563-1567.
6. Buckwold, V.E. Bovine viral diarrhea virus as a surrogate model of hepatitis C virus for the evaluation of antiviral agents / V.E. Buckwold, B.E. Beer //Antiviral Res. – 2003. Vol.1, № 60. – P.1-15.
7. Horowitz, B. Viral safety of solvent-detergent treated blood products / B. Horowitz, A.M. Prince // Dev Biol Stand. – 1993, №81. – P. 147-161.
8. Korneyeva, M. Enveloped virus inactivation by caprylate: a robust alternative to solvent-detergent treatment in plasma derived intermediates// M. Korneyeva, J. Hotta // Biologicals. – 2002. Vol. 2, №30. – Р.153-162.
Читайте также:
