Сыворотки для диагностики сальмонеллеза

Набор реагентов «Сыворотки диагностические сальмонеллезные адсорбированные О-поливалентные для реакции агглютинации" предназначен для идентификации с помощью реакции агглютинации (РА) на предметном стекле бактерий рода Salmonella, выделенных из биологического материала человека (моча, испражнения, промывные воды желудка, рвотные массы).

Описано более 2400 патогенных сероваров сальмонелл, вызывающих у человека острые гастроэнтериты, тифоподобные и септикопиемические формы заболевания, объединенных под названием сальмонеллез. Основными возбудителями сальмонеллеза являются Salmonella сероваров enteritidis, typhi murium, cholerae-suis, haifa и т.д.

Набор реагентов «Сыворотки диагностические сальмонеллезные адсорбированные О-поливалентные для реакции агглютинации" предназначен для идентификации таких бактерий с целью назначения правильного лечения больного.

Набор выпускается в 4 вариантах комплектации:

Комплект №1 Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка основных групп (А, В, С, D , E ):

Комплект №1/1 - Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка основных групп, сухая;

Комплект №1/2 - Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка основных групп, жидкая;

Комплект №2 Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка редких групп:

Комплект №2/1 - Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка редких групп, сухая;

Комплект №2/2 - Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка редких групп, жидкая.

Каждый вариант комплектации в 2 исполнениях.

СОСТАВ И КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА

Комплект №1 Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка основных групп (А,В,С,D,E)

сухая иммунная адсорбированная сыворотка крови кролика или барана, содержащая О-агглютинины против антигенов 1;2;3,4;5;6.1;6.2;7;8;9;10;12,Vi; инактивированная; аморфная масса белого или кремового цвета

жидкая иммунная адсорбированная сыворотка крови кролика или барана, содержащая О-агглютинины против антигенов 1;2;3,4;5;6.1;6.2;7;8;9;10;12,Vi; инактивированная; бесцветная или розовато-желтого цвета жидкость

Комплект №2 Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка редких групп

сухая иммунная адсорбированная сыворотка крови кролика или барана следующих групп (F; G; H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, W, V, X,Y, Z,52,53,54' 55,57, 58, 59, 60, 61), содержащая О-агглютинины против антигенов 11;13, 22; 14, 24; 23; 24; 25; 16; 17; 18; 21;28; 30; 35; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 47; 48; 50; 52; 53; 54; 55; 57; 58; 59; 60; 61); инактивированная; аморфная масса белого или кремового цвета

жидкая иммунная адсорбированная сыворотка крови кролика или барана следующих групп (F; G; H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, W, V, X,Y, Z,52,53,54' 55,57, 58, 59, 60, 61), содержащая О-агглютинины против антигенов 11;13, 22; 14, 24; 23; 24; 25; 16; 17; 18; 21;28; 30; 35; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 47; 48; 50; 52; 53; 54; 55; 57; 58; 59; 60; 61); инактивированная; бесцветная или розовато-желтого цвета жидкость

Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению сокращенная схема антигенной структуры бактерий сальмонеллезной группы.

ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Базовые варианты комплектов набора рассчитаны на исследование 200 (исполнение 1) или 40 образцов (исполнение 2).

ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ

Адсорбированные сыворотки содержат антитела, которые агглютинируют культуры сальмонелл, содержащие гомологичные О-антигены, и не агглютинируют культуры сальмонелл, содержащие гетерологичные О-антигены.

ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Исследуется культура, выделенная при бактериологических исследованиях из биологического материала (моча, испражнения, промывные воды желудка, рвотные массы) и выращенная в пробирках на скошенном питательном агаре в течение 18-20 ч при температуре 37 0 С.

Допускается хранение выделенной культуры на питательном агаре при температуре +2 -+8 в течение 2 суток.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Аналитическая чувствительность: определяется с гомологичными музейными тест-штаммами Salmonella и составляет 100%

Аналитическая специфичность: определяется с гетерологичными музейными тест-штаммами Salmonella и составляет 100%

Воспроизводимость результатов составляет 100%.

Диагностическая чувствительность (с доверительной вероятностью 95%) составила:

Музейные тест-штаммы Salmonella - 98,07%-100%;

Культуры Salmonella, выделенные из клинического материала пациентов - 98,25%-100%.

Диагностическая специфичность (с доверительной вероятностью 95%) составила:

Музейные тест-штаммы Salmonella - 98,07%-100%;

Культуры Salmonella, выделенные из клинического материала пациентов - 98,25%-100%.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Набор биологически безопасен, однако с исследуемыми образцами необходимо обращаться как с потенциально инфицированным материалом.

Потенциальный риск применения набора – класс 2б (Приказ МЗ РФ №4н от 6 июня 2012 г.).

Меры предосторожности при работе с набором – соблюдение правил "Инструкции по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений" (Утв. Минздравом СССР 17 января 1991 г.), ГОСТ Р 52905–2007 (ИСО 15190:2003).

Утилизацию или уничтожение, дезинфекцию наборов реагентов следует проводить в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами" и МУ 287-113 "Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения".

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Оборудование и материалы (для "ручной" постановки)

Холодильная камера с температурным режимом 2-8 0 С;

Пипетки полуавтоматические с рабочими диапазонами: 5-50 мкл, 20-200 мкл;

Одноразовые наконечники к указанным пипеткам;

Контейнеры для жидких и твердых отходов;

Резиновые или латексные перчатки, средства дезинфекции;

Лупа с увеличением (2х);

0,9 % раствора хлористого натрия;

Термостат суховоздушный, поддерживающий температуру (37 ± 1) °С;

70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Постановка РА на стекле

Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка

Сухую сыворотку растворяют в 2 мл 0,9% водного раствора хлористого натрия

На предметное стекло наносят одну каплю (около 50 мкл) сыворотки и одну каплю 0,9% водного раствора хлористого натрия. Идентифицируемую культуру, выращенную в пробирках на скошенном питательном агаре в течение 18-20 ч при температуре 37 о С, снимают с верхней части агара петлей, наносят на предметное стекло вблизи капли 0,9% водного раствора хлористого натрия и эмульгируют (контроль на отсутствие спонтанной агглютинации). При отсутствии спонтанной агглютинации манипуляцию повторяют в капле О - сыворотки, формируя равномерную непрозрачную суспензию. Учет результатов проводят в течение 1-2 минут, мягко покачивая стекло. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате.
При наличии агглютининов к исследуемому штамму в капле сыворотки в течение 1 -2 мин появляется хлопьевидный агглютинат.

Учет результат РА производят визуально при помощи лупы с увеличением(2х) по четырехкремстной системе

Результаты РА учитываются и оцениваются следующим образом:

++++ – отчетливый агглютинат при полном просветлении жидкостив капле (100%).

+++ – отчетливый аггютинат на фоне мутноватой жидкости (75%)

++ – незначительный агглютинат на фоне мутной жидкости (50%)

+ – следы агглютината, жидкость в капле мутная (25%)

(–) – отрицательный результат, гомогенно мутная жидкость в капле (0%).

РА с диагностической сывороткой учитывается только при отрицательном результате контроля спонтанной агглютинации.

Исследуемую культуру относят к соответствующей О-группе, если на стекле получена РА с поливалентной сывороткой этой группы не ниже чем на (+++).

СРОК ГОДНОСТИ

Комплект №1/1, №1/2. Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка, сухая - 3 года со дня приемки ОБТК предприятия-изготовителя.

Комплект №2/1, №2/2. Сальмонеллезная поливалентная О-сыворотка, жидкая- 1 год со дня приемки ОБТК предприятия-изготовителя.

ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ

Хранение

В упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 о С до 8 о С. Замораживание не допускается.

После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты допускается хранить в плотно закрытых упаковках при температуре от 2 до 8 о С в течение 1 мес.

Транспортирование

При температуре от 2 до 8 о С транспортом всех видов в крытых транспортных средствах в соответствии с правилами перевозок, действующими на транспорте данного вида. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 о С до 25 о С в течение 14 сут.

S. paratyphi вызывает паратифы, они различаются по типу заболевания и делятся на А, В и С. Salmonellatyphi вызывает брюшной тиф. Эти инфекционные заболевания сопровождаются циркуляцией возбудителя в крови, высокой температурой тела, реакцией лимфатических узлов и токсическими проявлениями. Сальмонеллы вызывают сальмонеллез, который протекает несколько легче чем тифы и паратифы. Эти патологии трудно отличить, основываясь лишь на клинических явлениях - для этого используются лабораторные методы исследования. Их объединяет то, что они тропны к пищеварительному тракту и большинство симптомов наблюдается именно со стороны этих органов.

Эпидемиологические особенности патологий

Важным моментом при постановке диагноза являются особенности проникновения возбудителя в организм. В зависимости от этого различают несколько типов инфекций. К примеру, бактерии, которые приводят к развитию тифа и паратифов, являются антропонозными - передача инфекции наблюдается от людей, которые болеют и являются носителями. Сальмонеллез и некоторые паратифы являются зооантропонозами - инфекциями, которые общие и для животных. и для людей.

Строение сальмонелл позволяет им переживать условия внешней среды и продолжать свой жизненный цикл в воде, почве. Чтобы уничтожить их, необходимо использовать дезинфектанты и другие агрессивные вещества. В сточные воды и землю бактерии поступают, в основном, с испражнениями, поэтому путь передачи называется фекально-оральным. Кроме кала и мочи, значительное количество бактерий содержит слюна пациента, из чего также можно сделать выводы о передаче заболевания.

Когда необходимо пройти диагностику?

Анализы необходимо сдать тем, кто работает на пищевом производстве, посещает детский коллектив или работает в нем. Это нужно для того, чтобы исключить факт носительства бактерии. Пищевая промышленность опасна в эпидемиологическом плане, так как возбудитель превосходно чувствует себя на питательных средах, которые используются в производстве готовых блюд или продуктов. Детские коллективы также имеют свою особенность - в детском возрасте не так серьезно соблюдаются гигиенические меры, чаще наблюдается некачественное мытье рук, контакт грязных поверхностей со слизистой рта. Особенно важна диагностика и для беременных. В остальных случаях, анализы проводятся при наличии следующих симптомов:

острое повышение температуры;
нарастающая интоксикация, которая проявляется слабостью, головной болью, ломотой в костях и суставах;
боль в животе, которая имеет спастический характер, локализуется вокруг пупочного кольца и в месте, где сходятся реберные дуги;
тошнота, за которой следует неоднократная рвота;
диарея, при которой может наблюдаться зеленоватый оттенок каловых масс и их неприятный запах;
бледность кожных покровов;
сухость слизистых;
мелкопятнистая сыпь красного цвета, которая постепенно становится более бледной.

Наблюдаются различные формы и особенности течения заболеваний, поэтому симптомы могут несколько отличаться. Как правило, при подозрительной клинической картине пациенты обращаются к врачу, а он направляет их на сдачу анализов. Лабораторная диагностика используется и ретроспективно - после выздоровления, для определения иммунологической картины, а также для выявления устойчивых форм патологии.

Виды исследований при данных инфекционных заболеваниях

Начало диагностики - забор материала. Биологические жидкости и ткани необходимо правильно собрать, в зависимости от фазы развития болезни. Лучше сделать это до начала приема антибактериальной терапии.

Постановка диагноза “брюшной тиф” происходит такими методами:

Данные методы актуальны для ранней постановки диагноза. Возбудителя можно выявить в крови, тканях костного мозга, дуоденальном содержимом, в каловых массах и в моче. Посев палочек тифа дает точную информацию для постановки диагноза.

Для исследования берется кровь пациента, 10 мл, венозная. Посев производится на специфические питательные среды. В некоторых случаях, часть крови используется для посева, а сыворотка - для серологического анализа. Ожидается рост культур, которые идентифицирует с помощью макро- и микроскопического исследования.

На определенных стадиях патологического процесса можно выделять возбудитель из костного мозга - для этого проводится стернальная пункция и забор небольшого количества материала. Это безопасно и безболезненно, так как проходит на фоне анестезии. Посев происходит на питательные среды. Особенность метода - большая чувствительность. Методика обладает диагностической точностью даже при стертых формах болезни, которые невозможно определить методом гемокультуры.

Забор желчи происходит путем зондирования 12-перстной кишки. Сеются 3 порции кишечного содержимого. Особенность методики - эффективность при поиске носителей или устойчивых форм болезни у носителей.

Материал находится в элементах сыпи - это прозрачная жидкость в центре розеолы. Используется при негативном ответе на другие методы исследования и при наличии характерной сыпи. Для забора крови необходимо обработать кожу и скарифицировать её острием скальпеля. Содержимое элемента сыпи наносится на питательную среду, как и в остальных случаях.

Определение культур в моче больше направлено на поиск бактерионосителей, чем пациентов с активной формой болезни. Мочу собирают после тщательного туалета, а еще лучше с помощью катетера. В остальном, исследование происходит также, как и в случае с остальным биологическим материалом.

Методика используется не так часто, так как в каловых массах возбудитель появляется через время после заболевания. Исследование используется для здоровых лиц и носителей.

Для выявления тифозных микроорганизмов может использоваться исследование воды.

Для того, чтобы идентифицировать сам микроорганизм используется специальный метод окраски - он позволяет увидеть под микроскопом типичные палочки, красного цвета, которые на концах имеют закругленные образования. Исследуют её форму, размеры, биохимические свойства и идентифицируют вид микроорганизма. Производится также фаготипирование, то есть определение конкретного вида возбудителя.

Используются для определения носительства или наличия патологического процесса. В диагностике тифа используется реакция Видаля, а также РИГА. Еще один серологический метод - иммуноферментный анализ.

Реакция Видаля позволяет выделить возбудитель из сыворотки крови. Реакция специфическая, начиная с 7-10 дня болезни. Особенность брюшного тифа - разные скорости повышения тех или иных типов антигенов. Определение всех антигенов позволяет правильно диагностировать процесс. Реакция имеет специфические особенности в плане забора материала и постановки исследования, поэтому её точность зависит от условий лаборатории.

Реакция гемагглютинации широко используется для диагностики тифа и паратифа. Особенно важна методика для определения носительства бактерий. Достоверность реакции подтверждается выделением чистой культуры микроорганизмов. Для носителей используются методики исследования мочи, желчи или каловых масс.

Серологические пробы более достоверны, если использовать методику парных сывороток и отслеживать динамическое изменение количества антител. Также, определение вида антител позволяет сказать, какая стадия процесса происходит в организме.

Аллергопроба при тифе основана на воздействии тифина, который обладает аллергеном. Он вызывает реакцию, если в организме есть антитела к нему. Реакция сопровождается небольшим местным отеком, покраснением. Проба используется для реконвалесцентов и необходима в ретроспективном плане.

Диагностика сальмонеллеза происходит с помощью таких процедур:

Бактериологическое исследование каловых масс используется наряду с аналогичным исследованием рвотных масс, мочи, желчи, промывных вод желудка. Посев производится на питательные среды, в которых созданы наиболее благоприятные условия для роста культур. Такие реактивы создаются на основе биохимических свойств возбудителя. Если в исследуемом материале есть культура сальмонелл, в благоприятных условиях она даст рост на среде. Исследователь ждет необходимое количество дней (от 7 до 10) и осматривает реактивы. Сальмонеллы отличаются характерным ростом, который дает основания для постановки диагноза.

Копрограмма при сальмонеллезе - один из наиболее быстрых методов постановки диагноза. Макроскопическое исследование дает основания заподозрить патологические изменения слизистой пищеварительного тракта. Об этом говорят непереваренные частицы клетчатки, воспалительные клетки, выделения слизи и крови вместе с калом, крахмальные зерна. Это говорит о том, что нарушена пищеварительная функция и многие компоненты пищи не расщепляются до своих единиц. Такие изменения вместе с клиническими данными позволяют поставить диагноз и начать лечение. Сбор каловых масс нельзя проводить после приема слабительных препаратов.

Для постановки полимеразно-цепной реакции используется кровь пациента. Современные методы диагностики позволяют обнаружить частицы генетического материала и составить из них фрагмент нуклеиновой кислоты. Полученный образец сопоставляют с таковым у искомого возбудителя и при их совпадении ставят диагноз. Метод обладает высокой чувствительностью, он является точным основанием для постановки диагноза.

Серологические методы диагностики основаны на поиске антител в крови пациента. Если в организме находятся антитела, они создадут иммунокомплекс вместе с антигеном, который добавляют к биологическому материалу. Если реакция произошла, её повторяют через время, чтобы увидеть динамическую картину заболевания. Это называется методом парных сывороток, определяется нарастание титра антител. Различают виды антител, которые есть в острой стадии, у носителей, у пациентов с реконвалесцентной формой патологии. Среди серологических методов - иммуноферментный анализ, реакции гемагглютинации, иммунофлюоресцентные методики. Они различаются добавлением дополнительных реактивов, прицельным изучением эритроцитов.

Каждый из методов диагностики используется при определенных обстоятельствах - в зависимости от состояния пациента, дня с начала болезни, а также для разных целей диагностики. Это важно и для назначения лекарственной тактики, и для получения эпидемиологических данных.

Острые кишечные инфекции опасны тем, что приводят к интоксикации и быстрому обезвоживанию. Вместе с жидкостью из организма выводятся полезные минералы, соли и другие вещества. За короткий срок может наступить критическое состояние организма, ведь потеря влаги происходит также за счет высокой температуры, частого дыхания, потоотделения и других процессов. Особенно опасно это для тех, кто имеет ослабленный иммунитет, для детей. Поэтому, своевременная и качественная диагностика настолько важна, ведь именно на её основе можно назначить необходимое лечение, которое приведет к положительному результату.

Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента

Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма

Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.

Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.

Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"

Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.

Сальмонеллезная инфекция до сих пор занимает лидирующие позиции в нозологии кишечных инфекций [1,5,9]. Согласно данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека заболеваемость сальмонеллезом различных групп в 2015 г. по Российской Федерации зарегистрирована в 37026 случаях (25,39 случаев на 100 тыс. населения), заболеваемость брюшным тифом зарегистрирована в 29 случаях (0,02 случая на 100 тыс. населения) [2]. Диагностика заболевания основана, прежде всего, на данных клинической картины, сбора эпидемиологического анализа и результатов бактериологического, биохимического исследования [1,4,5]. Серологические методы являются вспомогательными и направлены для подтверждения клинического диагноза и определения серотипа сальмонеллы [4,6]. Наиболее часто используют метод реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), в котором определяют парные сыворотки, которые берут у больного на 4–6 день заболевания (начальный титр) и на 2–3-й неделе, где титр достигает максимума, превышающий исходный в 3–4 и более раз [3,4]. Метод РПГА является традиционным и его применение до сих пор актуально.

Цель

Целью работы явилось изучение динамики титрообразования сыворотки крови кроликов путем исследования парных сывороток после каждого цикла иммунизации в РПГА и подтверждения активности используемых в опыте О-антигенов сальмонелл групп B,C,D, выделенных из штаммов, наиболее часто циркулирующих в Российской Федерации и Пермском крае [8,9]. Для сравнения изучали в параллельном опыте титрообразование сыворотки кроликов, иммунизированных антигеном Vi из сальмонеллы штамма О-901 (брюшного тифа), которая чаще встречается у бессимптомных бактерионосителей.

Материалы и методы исследования

Материал исследования – иммунная сыворотка крови кроликов. В опыт брали половозрелых, физиологически здоровых кроликов, массой 2,5–3,0 кг, без проявления признаков инфекций, кроликов рассаживали в индивидуальные клетки с формированием групп по 5 особей на каждый вид антигена.

Для иммунизации использованы антигены, выделенные из штамма S. enteritidis (серогруппа D с антигенной формулой 1,9,12), штамма S.typhimurium (серогруппа B, антигенная формула 1,4,12), штамма S.choleraesuis var. Kunzendorf (серогруппа С₁, антигенная формула 6,7). Из штамма S. typhi О-901 выделен Vi-антиген (антигенная формула 9,12,Vi). Штаммовый материал предоставлен институтом им. Г. Н. Габричевского в 2013 г. и отделением бактериофагов филиала в 2015 г.

Метод исследования – реакция пассивной гемагглютинации, выполняемая в 96-луночном планшете для иммунологических реакций с использованием диагностических наборов для конкретной группы сальмонелл (диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный О-антигенный серогрупп В, С, D и диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Ви-антигенный).

Результаты исследования

Антигены патогенных штаммов серогрупп B, C₁, D и Vi, представляли собой микробную взвесь, полученную путем технологических превращений из пассажного материала культур сальмонелл. Концентрацию микробных тел оценивали при помощи стандарта ОСО мутности, соответствующей 0,93х10 9 клеток/мл для микроорганизмов кишечной группы [7]. Антигены вводили по 1,0 мл каждому кролику в краевую вену уха 3–4-х кратно, с интервалом между иммунизацией в 4–5 дней. Первоначальная доза могла составлять 500 млн микробных тел в 1 мл, последняя могла доходить до 4 млрд микробных тел в 1 мл, что определялось уровнем титра. Для его детекции брали пробу крови из краевой вены уха кролика в количестве 3,0 мл после иммунизации и титровали в РПГА. После всего цикла иммунизации осуществляли тотальный кровезабор (50–60 мл с одного кролика), кровь объединяли в пул и определяли конечный титр сыворотки. Для проведения реакции готовили последовательные двукратные разведения полученных сывороток, начиная с 1:100 и титровали до разведения, в котором гарантированно отсутствует специфическая гемагглютинация. Реакцию сопровождали контролем на отсутствие спонтанной агглютинации в сыворотке, для чего добавляли в 2 лунки 1 % взвесь несенсебилизированных эритроцитов (контрольные эритроциты – кэ) по 0,025 мл и 0,05 мл сыворотки, результат обозначали минусом. В каждую лунку предварительно добавили по 0,025 мл диагностикума соответствующей группы. Планшеты осторожно встряхивали и помещали в термостат при температуре 37 0 С на 2–2,5 часа. После производили учет реакции методом 4-х крестной системы в каждом разведении, положительный результат учитывался только при 4 и 3 крестах. Результаты титрации сывороток групп B и C₁ в РПГА представлены в таблицах №№ 1,2, начальная иммунизация в 0,5 млн микробных тел/мл не представлена из-за неинформативности материала.

Как видно из таблицы № 1, суммарный титр пула сывороток серогруппы В составил 1:25600. Иммунизация данной группы прошла успешно, цикл состоял из трех иммунизаций, у всех кроликов регистрировался высокий титр, превышающий допустимый начальный титр 1:6400 в 2–3 раза.

Результаты титрации иммунной сыворотки серогруппы В

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики сальмонеллеза. Способ заключается в выявлении антител к сальмонеллам в сыворотке крови посредством иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА) с флуоресцирующими комплексными и моногрупповыми (к антигенам групп А, В, С, D, Е) сальмонеллезными диагностикумами, в состав которых введены Fab-фрагменты иммуноглобулинов к гетерологичным микроорганизмам кишечной группы. При наличии в мазках агглютинатов, содержащих 25 и более флуоресцирующих сальмонелл, диагностируют сальмонеллез. Реакцию ИФРМА ставят в объеме не менее 2 мкл, начиная с цельного разведения сыворотки крови. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности и специфичности способа. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно микробиологии и иммунологии, и может быть использовано в практическом здравоохранении для выявления антител к сальмонеллам групп А, В, С, D, E у взрослых и детей.

В прикладной иммунологии, практической и научной, и бактериологической работе тестирование антител к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е проводят в РА, РНГА.

Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования - М.: Медицина, 1982, -462 с.

Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических методов исследования. - М.: Медицина, 1988, - 440 с.

Покровский В. И., Килессо В.А., Ющук Н.Д. Сальмонеллезы. - Ташкент: Медицина, 1989, - 344 с.

Известен способ-прототип выявления антител к сальмонеллам, полученных по способу, защищенному патентом 2175558 от 27.11.2000 г., заключающийся в применении в иммунофлуоресцентной реакции микроагг-лютиинации (ИФРМА) флуоресцирующих комплексных и моногрупповых диагностикумов, содержащих в наполнителе нормальную кроличью сыворотку.

По способу-прототипу стандартизованная и отконтролированная взвесь флуоресцирующих комплексных и моногрупповых сальмонеллезных диагностикумов содержит нормальную кроличью сыворотку до конечной концентрации 0,1%.

Недостатком применения способа-прототипа являются неспецифические реакции в ИФРМА с сыворотками больных, содержащих антитела к гетерогенным возбудителям кишечной группы, что обусловлено наличием перекрестно-реагирующих детерминант у сальмонелл и кишечной группы микроорганизмов. Это делает невозможным достоверное определение антител в начальных разведениях сыворотки крови при их невысоких титрах (см. таблицу).

Изобретение направлено на решение задач: повышения чувствительности и специфичности способа; выявления специфических антител в низких разведениях сыворотки, начиная с цельного; сокращении расходов диагностикумов.

Указанные задачи достигаются за счет использования ИФРМА, отличающейся тем, что постановку реакции проводят с флуоресцирующими комплексным и моногрупповыми диагностикумами, в состав которых вместо нормальной кроличьей сыворотки введены Fab-фрагменты иммуноглобулинов к гетерологичным микроорганизмам кишечной группы. Последние взаимодействуют с перекрестно-реагирующими детерминантами диагностикума и блокируют их, обеспечивая взаимодействие в реакции только специфических детерминант диагностикума с соответствующими антителами к сальмонеллам с образованием агглютинатов. Полученные комплексы антител и флуоресцирующих комплексного и моногрупповых сальмонеллезных диагностикумов исследуют в люминесцентном микроскопе и при наличии агглютинатов, содержащих 25 и более флуоресцирующих сальмонелл, диагностируют сальмонеллез. Реакцию ИФРМА ставят в объеме не менее 2 мкл, начиная с цельного разведения сыворотки крови.

Способ осуществляют следующим образом. Для постановки используют лиофилизированные флуоресцирующие комплексный и моногрупповые сальмонеллезные диагностикумы, содержащие в наполнителе 0,1% Fab-фрагментов иммуноглобулинов к гетерологичным микроорганизмам кишечной группы, полученные из агглютинирующих эшерихиозных ОК сывороток.

Постановку ИФРМА с сухими диагностикумами осуществляют следующим образом: на предметные стекла (разграфленные на 8 квадратов), помещенные в открытую влажную камеру, наносят по 2 мкл последовательных разведении исследуемых сывороток от цельного до 1:640, Затем к каждой капле разведений сыворотки добавляют по 2 мкл флуоресцирующего сальмонеллезного диагностикума группы А, капли перемешивают и камеру закрывают Затем камеру с предметными стеклами помещают в термостат (t=37 o С), где выдерживают в течение 60 мин. После этого камеру открывают, капли на стеклах высушивают и препараты просматривают в поле зрения люминесцентного микроскопа. Аналогичную постановку осуществляют с флуоресцирующими сальмонеллезными диагностикумами других групп В, С, D, Е и комплексным.

При наличии в сыворотке специфических (к сальмонеллам гомологичного вида) антител наблюдают образование агглютинатов, содержащих флуресцирующие сальмонеллы.

Оценку результатов проводят по количеству сальмонелл в агглютинате и наличию отдельно расположенных сальмолнелл.

Учет результатов проводят по альтернативной шкале оценки при условии просмотра 8-10 полей зрения: + поля зрения заполнены агглютинатами крупной и средней величины (25 и более сальмонелл в одном агглютинате) и единичными отдельно расположенными сальмонеллами; - поля зрения заполнены мелкими агглютинатами (менее 25 сальмонелл в одном агглютинате) и большим количеством отдельно расположенных сальмонелл или сальмонеллы во всех полях зрения располагаются отдельно.

Титром сыворотки считают ее максимальное разведение, которое вызывает агглютинацию диагностикума с содержанием 25 и более флуоресцирующих сальмонелл в одном агглютинате. При наличии в исследуемой сыворотке агглютинатов указанной величины диагностируют сальмонеллез.

Постановка реакции должна сопровождаться нижеследующими контролями: 1. Заведомо положительный контроль: стандартная диагностическая сыворотка + флуоресцирующие сальмонеллезные диагностикумы, титр сыворотки должен подтвердиться.

2. 3аведомо отрицательный контроль: сыворотка, не содержащая специфических антител + флуоресцирующие сальмонеллезные диагностикумы. Агглютинаты отсутствуют.

3. Контроль диагностикумов: физиологический раствор + флуоресцирующие диагностикумы. Агглютинаты отсутствуют.

Продолжительность постановки реакции 1 ч 10 мин.

Примеры конкретного исполнения Пример 1.

Больной Д., 11 лет, поступил в клинику в 1-й день болезни. Заболел остро. Утром появилась тошнота, недомогание, затем рвота, которая появилась за день дважды, жидкого стула не было.

При поступлении состояние средней тяжести, температура 38,5 o С. В сознании. Кожа чистая, эластичность кожи и тургор сохранены. Пульс 108 ударов в 1 мин. Язык суховат, обложен серо-белым налетом. Живот при пальпации мягкий, болезненный в области эпигастрии и подвздошной областях, урчит по ходу толстого кишечника. Печень у края реберной дуги, селезенка не пальпируется. Диурез сохранен. Стула на приеме не было, с первых суток в отделении - водянистый, желтый, без патологических примесей, затем кашицеобразный, с 6 суток оформленный. Субфибрильно температурил в течение 7 дней.

Общий анализ мочи без изменений.

В копроцитограмме слизь +++, непереваренные углеводы ++.

Бак. анализ кала 3-кратно отрицат.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, обнаружены агглютинаты, содержащие 30-45 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:320 (титр1:320). Выявлены неспецифические реакции в разведении 1:80 с возбудителями кишечной группы (эшерихии).

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом с Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, зарегистрированы агглютинаты, содержащие 30-50 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:320 (титр 1:320), начиная с цельного разведения сыворотки. Неспецифические реакции с эшерихиями не наблюдались.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:320).

Поставлен диагноз сальмонеллез, желудочно-кишечная форма (гастроэнтероколит) средней тяжести, острое течение. Выписан в удовлетворительном состоянии.

Пример 2 Больная М., 1 г. 8 мес, поступила в клинику на 6-й день болезни с жалобами на повышение температуры тела до 39 o С, рвота до 3 раз в сутки, жидкий стул с зеленью и слизью до 5 раз в сутки. Заболела остро с повышения температуры до 38 o С, появления жидкого стула. Лечились в течение 5 дней амбулаторно фуразолидоном, смектой, парацетамолом - без эффекта. Направлена в стационар.

Состояние при поступлении средней тяжести, вялая, аппетит снижен, кожные покровы бледные, эластичность кожи и тургор сохранены. Язык влажный, чистый. Живот мягкий безболезненный. Печень у края реберной дуги, селезенка не пальпирунтся. Диурез сохранен. Стул жидкий, желтый, с большим количеством мутной слизи в течение 4 дней в стационаре, затем кашицеобразный, а с 7суток - оформленный.

В ОАМ лейкоциты 4-6 П/зр., белок - отр., бактерии +, фосфаты +++.

Бак. анализ кала 4-кратно отрицат.

Серологические анализы. В ИФРМА на 14 день болезни с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, выявлены агглютинаты, содержащие 35-50 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:1280 (титр 1:1280). Отмечены неспецифические реакции с эшерихиями в титре 1:40.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, обнаружены агглютинаты, содержащие 40-50 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:1280 (титр 1:1280). Реакции с эшерихиями отсутствуют, начиная с цельного разведения сыворотки.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:1280).

Поставлен диагноз: сальмонеллез, гастроэнтероколитическая форма, средней тяжести (клинически и серологически), острое течение. Больная выписана из стационара в удовлетворительном состоянии.

Пример 3 Больной К., 7 лет, поступил в клинику на 2-й день болезни с жалобами на повышение температуры тела до 39 o С, боли в животе, рвоту, жидкий стул до 3-4 раз в сутки. Состояние при поступлении средней тяжести, температура 37,4 o С, вялый, аппетит снижен, кожа чистая, бледная, язык влажный, обложен серо-белым налетом. Живот при пальпации мягкий, болезненный по ходу толстого кишечника, печень на 2 см ниже края реберной дуги, селезенка не пальпируется. Стул на приеме и в последующие 3 суток в отделении жидкий, с зеленью и слизью.

В общем анализе мочи изменений невыявлено.

Бак. анализ кала 4-кратно отрицательный.

Серологические анализы: в ИФРМА на 7-й день болезни с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, обнаружены агглютинаты, содержащие 25 - 40 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:640 (титр 1:640). Наблюдали неспецифические реакции в разведении до 1:80 с возбудителями кишечной группы (эшерихиями).

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, наблюдали агглютинаты, содержащие 32-65 флуоресцирующие сальмонеллы в разведении 1:640 (титр 1:640). Неспецифические реакции с эшерихиями не отмечены, начиная с цельного разведения сыворотки.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:640).

Поставлен диагноз: сальмонеллез,, гастроэнтероколитическая форма, средней тяжести (клинически и серологически), острое течение. Выписан из отделения на 11 сутки в удовлетворительном состоянии.

Пример 4 Больная А., 4 года, поступила в клинику с жалобами на повышение температуры до 39 o С, многократную рвоту, жидкий, водянистый стул на 2-й день болезни. Заболела остро. Состояние при поступлении средней тяжести, температура 37,9 o С. Кожные покровы бледные с мраморным рисунком, эластичность кожи и тургор сохранены. Язык сухой, обложен серо-белым налетом. Тахикардия до 120 в мин. Живот при пальпации мягкий, болезненный в левой подвздошной области, сигмовидная кишка спазмирована.

В копроцитограмме слизь, непереваренные углеводы, бактерии.

Бак. анализ кала 3-кратно отриц.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, обнаружены агглютинаты, содержащие 25-40 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:160 (титр 1:160) Наблюдали неспецифические реакции в разведении до 1:20 с возбудителями кишечной группы (эшерихиями).

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, наблюдали агглютинаты, содержащие 30-60 флуоресцирующие сальмонеллы в разведении 1:160 (титр 1:160). Неспецифические реакции с эшерихиями не отмечены, начиная с цельного разведения сыворотки.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:160).

Поставлен диагноз: сальмонеллез, гастроэнтероколитическая форма, средней тяжести (клинически и серологически), острое течение. Выписан из отделения на 11 сутки в удовлетворительном состоянии.

Пример 5 Больная Б., 1 г. 3 мес, поступила в клинику на 2-ые сутки от начала заболевания с жалобами на боли в животе, частый жидкий стул, повышение температуры до 38 o С. Заболела остро. Врачом скорой помощи госпитализирована в детское хирургическое отделение для исключения острого аппендицита из-за сильных болей в животе, где наблюдалась в течение суток.

За время наблюдения боли уменьшились, диагноз острого аппендицита был снят и девочка переведена в нашу клинику с острой кишечной инфекцией. Состояние при поступлении средней тяжести. Кожа и видимые слизистые физиологической окраски, влажные. Тургор тканей сохранен. Тахикардия до 124 в мин на фоне температуры 38 o С. В ротоглотке умеренная гиперемия дужек и миндалин. Склерит. Язык обложен серо-белым налетом. Живот мягкий, безболезненный, печень 1 см, селезенка не пальпируется. Диурез сохранен. Стул в первые сутки в стационаре до 5 раз в сутки, жидкий, зеленый, со слизью и прожилками крови, с 3 суток - кашицеобразный, с 5 суток - оформленный.

В копроцитограмме увеличение лейкоцитов до 15-20 в п/зр., непереваренные углеводы+, бактерии+, эритроциты 10-15 в п/зр.

Бак. анализ кала 3-кратно отрицат.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, обнаружены агглютинаты, содержащие 35-40 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1: 320 (титр 1:320). Наблюдали неспецифические реакции в разведении до 1:20 с возбудителями кишечной группы (эшерихиями).

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, наблюдали агглютинаты, содержащие 28-55 флуоресцирующие сальмонеллы в разведении 1:320 (титр 1:320). Неспецифические реакции с эшерихиями не отмечены, начиная с цельного разведения сыворотки.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованими сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е, в которой титр 1:320, проба с унитиолом - отрицательная.

Поставлен диагноз: сальмонеллез (клинически и серологически), энтероколитическая форма, средней тяжести, острое течение. Выписана в удовлетворительном состоянии Пример 6
Больная А. , 2 г. 2 мес, поступила в клинику с жалобами на повышение температуры до 38 o С. До этого в течение 2-х недель лечилась амбулаторно по поводу ОРВИ симптоматическими средствами. Состояние при поступлении средней тяжести, температура 38,3 o С. Кожа бледная, чистая. Слизистые влажные. Зев гиперемирован. Из носа слизистое отделяемое. Язык чистый, влажный. Живот мягкий, безболезненный. Печень +2 см, селезенка не пальпируется. Диурез сохранен. Стула не приеме не было. В отделении утром и в 1-е сутки поступления жидкий стул, темно-коричневый с тяжами слизи и прожилками крови. Из анамнеза стало известно, что накануне заболевания кормили творогом со сметаной, купленными в магазине. В дальнейшем стул в отделении жидкий, водянистый с хлопьями мутной слизи до 7 раз в сутки в течение 2-х дней, затем кашицеобразный и оформленный.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, были выявлены агглютинаты, содержащие 8-10 флуоресцирующих сальмонелл, в разведении 1:20, т.е. результаты были отрицательные. Отмечены неспецифические реакции с эшерихиями в разведении 1:20.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, не наблюдали агглютинатов флуоресцирующих сальмонелл, начиная с цельного разведения сыворотки.

В РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е титр антител 1:10, при постановке РТНГА со специфическим антигеном торможения реакции не наблюдали, что свидетельствовало о неспецифических результатах, полученных в РНГА.

Поставлен диагноз: инфекционный энтероколит неустановленной этиолгии, средней тяжести, острое течение. Выписана в удовлетворительном состоянии.

Положительный эффект данной методики заключается в повышении чувствительности и специфичности по сравнению со способом-прототипом, возможности регистрировать антитела в цельной сыворотке, что важно при низкой величине титров антител, наблюдающейся у детей, а также в 2-кратном снижении экономических затрат диагностикумово

1. Способ диагностики сальмонеллеза с помощью иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА) путем взаимодействия специфических антител сыворотки крови с флуоресцирующими комплексным и моногрупповыми сальмонеллезными диагностикумами, отличающийся тем, что в состав диагностикумов введены Fab - фрагменты иммуноглобулинов к гетерологичным микроорганизмам кишечной группы, и при наличии в мазках агглютинатов, содержащих 25 и более флуоресцирующих сальмонелл, диагностируют сальмонеллез.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию ИФРМА ставят в объеме не менее 2 мкл, начиная с цельного разведения сыворотки крови.

TK4A - Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях "Изобретения (заявки и патенты)" и "Изобретения. Полезные модели"

Напечатано: (73) Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген” Министерства здравоохранения Российской Федерации

Следует читать: (73) Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген” Министерства здравоохранения Российской Федерации, Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Пермская государственная медицинская академия

Номер и год публикации бюллетеня: 21-2004

Код раздела: PD4A

Извещение опубликовано: 27.12.2004 БИ: 36/2004

Читайте также: