Серологические методы в диагностике холеры

Бесплатная горячая линия юридической помощи

• Главная
• "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

8. Методы серологической диагностики

Серологические методы исследования, как правило, имеют дополнительное значение, и лишь в отдельных случаях при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа их результаты могут быть решающими.

Для серологической диагностики холеры используют иммунологические реакции, выявляющие в сыворотке крови больных, переболевших и вибриононосителей, а также вакцинированных специфические антитела: агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела.

У больных холерой на 5 - 7-й день от начала заболевания появляются агглютинины, вибриоцидные антитела и антитоксины.

Целесообразно исследовать парные сыворотки с интервалом в 7 - 10 дней. Первая проба должна быть взята на 5 - 7-й день для оперативной диагностики и вторая - через 7 - 10 дней и более - для ретроспективной.

Кровь для серологических исследований берут из вены, а при отсутствии такой возможности - из пальца. Из вены берут 1 - 5 мл крови, после свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной стеклянной палочкой или платиновой петлей. Пробирки сохраняют в холодильнике и транспортируют в лабораторию охлажденными (в термосе, сумке-холодильнике и др.). В лаборатории сыворотку инактивируют при температуре (56,0 +/- 0,5) °С 30 мин.

Если кровь забирают в день постановки реакции, пробирки со свернувшейся кровью необходимо центрифугировать 10 - 15 мин. при 3000 об./мин. При отсутствии возможности исследовать сыворотку немедленно ее сохраняют в ампулах при температуре (4,0 +/- 0,5) °С. Кровь из пальца берут в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый флакон или пробирку с 1,6 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия (1:5).

А. Обнаружение противохолерных антител методом развернутой реакции агглютинации

Исследуемую сыворотку разводят 1%-й пептонной водой рН 7,5 +/- 0,1 в объеме 1 мл от 1:10 до 1:640. В качестве антигена используют 3-часовую бульонную культуру, выделенную в данном очаге, или исследуют в 3-х рядах с культурами холерных вибрионов (сероваров Огава, Инаба и О139 серогруппы). В пробирку с раститрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 ч в термостат, затем до утра в холодильник при температуре (4,0 +/- 0,5) °С, после чего отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки.

При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3 - 4 креста.

Результат исследования сыворотки больного при реакции агглютинации в разведении 1:40 и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител.

Б. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с диагностикумом эритроцитарным холерным антигенным

Для выявления полных антител в сыворотке крови предназначена РНГА. Это достаточно специфичная и чувствительная двухкомпонентная реакция. По чувствительности значительно превосходит реакцию агглютинации. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и микрообъемах изложены в наставлении к диагностикуму эритроцитарному холерному антигенному.

Результат исследования сыворотки больного в разведении 1:40 и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител.

В. Реакция нейтрализации антигена (РНАг)

Для выявления антител в сыворотке крови с использованием диагностикума эритроцитарного холерного иммуноглобулинового служит РНАг. Реакция нейтрализации антигена - высокоспецифическая трехкомпонентная реакция. Ее принцип заключается в специфической нейтрализации добавляемого антигена как полными, так и неполными антителами, которые появляются ранее других. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и микрообъемах изложены в инструкциях по применению к диагностикуму эритроцитарному холерному иммуноглобулиновому.

При использовании системы реакций РНГА и РНАг отпадает необходимость в постановке контроля специфичности с каждой исследуемой сывороткой, т.к. эти две реакции взаимно контролируют полученные результаты.

Результат исследования сыворотки больного в РНАг в разведении 1:50 (1:80) и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител при исследовании парных сывороток в РНГА и РНАг.

Вибриоцидные антитела в крови больных обнаруживаются и достигают максимальных значений 10(-4) - 10(-8) к 10 - 12 дню. Принцип метода во всех его вариантах заключается в том, что в присутствии вибриоцидных антител не происходит размножение холерных вибрионов.

При проведении серологических исследований в очаге, обусловленном возбудителем холеры определенного серовара, в реакции используют один штамм соответствующего серовара, при отсутствии этих данных - два штамма обоих сероваров.

Материалы и оборудование:

- исследуемые сыворотки, инактивированные прогреванием 30 мин. при температуре (56,0 +/- 0,5) °С;

- сухой комплемент или свежеполученная сыворотка морской свинки в разведении 1:20;

- 0,9%-й раствор хлорида натрия рН 7,2 +/- 0,1;

- штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные в S-форме, не чувствительные к комплементу;

- чашки Петри со щелочным агаром;

- термостат на (37,0 +/- 1,0) °С.

Методика постановки реакции

Комплемент, разведенный 0,9%-м раствором хлорида натрия 1:20, разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В первую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания последовательно переносят по 0,1 мл до разведения 10(-10), получая десятикратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титрацию сыворотки проводят на льду, который помещают в любую емкость.

Из односуточной агаровой культуры холерного вибриона готовят взвесь в 0,9%-м растворе хлорида натрия, содержащего в 1 мл 1 - 2 х 10(4) м.к. Стерильной градуированной пипеткой полученную взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститрованной сывороткой.

Необходимы следующие контроли: а) контроль комплемента (0,9 мл комплемента и 0,1 мл культуры); б) контроль сыворотки (0,8 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл культуры); в) контроль культуры (0,9 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия и 0,1 мл культуры).

Штатив с пробирками на 1 ч помещают в водяную баню или термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С, сделав предварительно высев из пробирки контроля культуры на 2 пластинки щелочного агара для определения фактической концентрации живых вибрионов в опытной суспензии (контроль разведения).

Через 1 ч штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высевают на чашку с щелочным агаром рН 7,0 +/- 0,1. Посев равномерно распределяют по поверхности чашки покачиванием или шпателем. Чашки помещают на 18 - 24 ч в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

В посевах из контрольных пробирок с культурой должно вырастать количество колоний, близкое к контролю разведения.

Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает гибель не менее чем 50% клеток холерного вибриона, что выявляется при посеве на агаровые пластинки в чашки Петри по сравнению с количеством выросших колоний из пробирки контроля комплемента.

Пример вычисления: при посеве из опытных пробирок с разведением сыворотки 10(-1); 10(-2); 10(-3); 10(-4); 10(-5); 10(-6); 10(-7) и т.д. на чашках соответственно выросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 и т.д. колоний. При высеве из пробирки контроля комплемента также после часовой инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) °С выросло 36 колоний, 50% от этого числа будет составлять 18. Из 5-й пробирки выросло 15 колоний, т.е. меньше 50% от количества колоний в контроле (18), в следующей - 30, т.е. более 50% этого же показателя. Разведение сыворотки в 5-й пробирке составляет 10(-5), следовательно, вибриоцидный титр в данном примере будет составлять 10(-5).

Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе ферментации углеводов

Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы, регистрируемой с помощью индикатора.

Материалы и оборудование:

- инактивированная сыворотка крови;

- штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба;

- комплемент, разведенный 1:20 1%-й пептонной водой, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде;

- термостат на (37,0 +/- 1) °С.

Методика постановки реакции

Комплемент, разведенный 1:20 1%-й пептонной водой с сахарозой и индикатором Андреде разливают в пробирки по 0,45 мл. В первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. (до разведения 10(-5) - 10(-9)). Готовят суспензию 18 - 20-часовой агаровой культуры холерного вибриона и разводят 1%-й пептонной водой до концентрации 10(3) м.к./мл. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в термостат.

Постановку реакции сопровождают следующими контролями:

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды, содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси культуры - контроль сыворотки;

- 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль комплемента;

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль культуры;

- 0,45 мл 1%-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,05 мл исследуемой сыворотки - контроль стерильности сыворотки.

Через 5 - 6 ч проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается неизмененным или интенсивность его значительно отличается от окраски контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма разведения сыворотки, взятого с обратным знаком.

Примечание. Для постановки РВА при холере, обусловленной холерным вибрионом О139 серогруппы, не может быть использован выделенный в очаге штамм в связи с возможной чувствительностью его к комплементу. В этих случаях рекомендуется предложенный специалистами Ростовского НИПЧИ, ctx- клон холерного вибриона О139, направленный на депонирование в Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб" (РосНИПЧИ "Микроб").

Для выявления токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови больных холерой и вибриононосителей предназначена РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД), у которых инфицирование обусловлено холерными вибрионами О1 и О139 серогрупп. Токсиннейтрализующие антитела появляются на 5 - 7-й день болезни, достигая максимума на 14 - 21-й день, затем их титр постепенно снижается, но сохраняется дольше других антител. Иммуноглобулины к холерному токсину в сравнении с вибриоцидными и другими специфическими холерными антителами дольше циркулируют в сыворотке крови после перенесенной инфекции (до 8 - 10 и более месяцев). Условно положительным титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1:160 и выше. Целесообразно исследовать парные сыворотки.

Результат РНГА с ЭХЭД позволяет сделать заключение о токсигенности (эпидемичности) циркулирующего в очаге штамма холерного вибриона, в том числе и без выделения культуры.

Бесплатная горячая линия юридической помощи

• Главная
• "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

6.1. Серологические методы

Принадлежность холерных вибрионов к О1 или О139 серогруппе определяют в слайд-агглютинации или развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками О1, Инаба, Огава, РО и с холерной сывороткой О139 серогруппы в соответствии с инструкциями по применению препаратов, а также в других реакциях с иммуноглобулиновыми препаратами, предназначенными для ускоренной диагностики холеры и идентификации возбудителя.

Слайд-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри или на дне самой чашки, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и (или) агаровую 12 - 18-часовую культуру и сыворотки О1 серогруппы в разведении 1:50 - 1:100. Сыворотку О139 разводят в соответствии с указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями культуры в 0,9%-м растворе хлорида натрия.

Развернутую реакцию агглютинации ставят и учитывают по общепринятой методике в соответствии с инструкцией по применению диагностических сывороток.

Для исключения спонтанной агглютинации рекомендуется ставить развернутую реакцию в 0,3%-м растворе NaCl.

Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3%-м раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра. Суспензию изучаемой культуры готовят в этом же растворе концентрацией 3 х 10(9) - 5 х 10(9) м.к./мл в объеме 8 - 10 мл. Взвесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1,0 - 1,5 ч. В реакции используют поверхностный слой микробной взвеси, разведенной 0,3%-м раствором натрия хлорида до концентрации 1 млрд. м.к./мл, добавляя ее по 0,5 мл во все разведения сыворотки и контроль культуры (0,5 мл 0,3%-го раствора натрия хлорида + 0,5 мл взвеси культуры). Учет и оценка результатов аналогичны основному варианту развернутой реакции.

Метод дает возможность ускоренно идентифицировать выделенную культуру, а также выявить возбудителя холеры О1 и О139 серогруппы при содержании его в исследуемом материале не менее чем 10(5) м.к./мл. Исследованию подлежат выделенная культура, нативный материал (испражнения и рвотные массы) и материал после подращивания.

Порядок приготовления мазков, обработка их флюоресцирующими иммуноглобулинами, микроскопия и оценка результатов, являющиеся общими для всех бактерий, описаны в "Наставлениях по применению иммуноглобулинов диагностических флюоресцирующих холерных адсорбированных лошадиных сухих".

Положительный результат может быть получен через 1,5 - 2,0 ч от начала исследования.

При просмотре мазков, обработанных иммуноглобулином холерным флюоресцирующим, особое внимание следует обращать на морфологию светящихся микробов, т.к. в отдельных случаях в мазках из испражнений здоровых людей может наблюдаться свечение микроорганизмов, отличающихся по морфологии от вибрионов (грубые крупные палочки, кокки).

Для устранения неспецифического свечения целесообразно использовать в качестве "гасителя" бычий альбумин, меченый родамином. Методика его использования описана в "Инструкции по применению альбумина бычьего, меченого родамином, сухого".

Метод дает возможность обнаружить возбудителя в течение нескольких минут при концентрации его в исследуемом материале не менее 10(5) м.к./мл. На предметное стекло пипеткой или петлей наносят 2 капли испражнений, рвотных масс или поверхностного слоя среды обогащения. Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), ко второй добавляют каплю О1 сыворотки в разведении 1:50, перемешивают и также накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю смотрят под микроскопом при увеличении х400 - 600, используя фазово-контрастное устройство или конденсор

При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой капле наблюдают характерную подвижность, во второй - иммобилизацию отдельных микробных клеток и образование неподвижных микроагглютинатов немедленно или в течение 1 - 2 мин. В случае неспецифического взаимодействия с диагностическими сыворотками наблюдается образование мелких подвижных конгломератов при активной подвижности отдельных клеток.

Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15 - 20 мин. от начала исследования нативного материала. При отрицательном результате исследование повторяют после подращивания в 1%-й пептонной воде.

В случае отрицательного результата необходимо провести аналогичное исследование с холерной сывороткой О139 серогруппы, которую разводят 1:5.

Порядок подготовки материала, ингредиентов, постановки реакции и ее учет изложены в "Инструкции по применению диагностикума эритроцитарного холерного антительного иммуноглобулинового", прилагаемой к препарату.

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Савельева Ирина Вилорьевна, Безсмертный В. Е., Савельев В. Н., Федоров Ю. М., Иванова С. М.

Показана возможность серологической диагностики холеры путем применения липосомального холерного энтеротоксического диагностикума в реакции связывания комплемента с целью определения антиэнтеротоксических антител в сыворотке крови больных холерой , обусловленной гибридными вариантами биовара эльтор. Так, при легком течении болезни холерные антиэнтеротоксические антитела выявлены в парных сыворотках крови, взятой на 7 и 14 дни болезни, в титрах соответственно 1:50 и 1:200 (4-кратное увеличение титра), при среднетяжелом течении — 1:100 (пятый день болезни) и 1:3200 (двенадцатый день болезни) (32-кратное увеличение титра). У двух больных на 6-й день со среднетяжелым течением болезни антитела выявлены в титрах 1:1600 (у взрослого) и 1:800 (у ребенка 10 месяцев).

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Савельева Ирина Вилорьевна, Безсмертный В. Е., Савельев В. Н., Федоров Ю. М., Иванова С. М.

Serological diagnosis of modern cholera using liposOmal enterotoxic diagnosticum in complement fixation test1The Federal Government Public Health Institution “Stavropol Institute for Plague Control of the Rospotrebnadzor”, Stavropol, Russian Federation

The possibility of serological diagnosis of cholera using cholera enterotoxic diagnostics kit in complement fixation test to detect anti-enterotoxic antibodies in sera of patients with cholera caused by hybrid variants of the El Tor biovar has been demonstrated. In patients with mild course of cholera anti-enterotoxic antibodies were detected in titres 1:50 and 1:200 in paired sera obtained on the 7th and 14th days of disease, respectively (fourfold titre increase). In patients with the course of medium severity 32-fold titre increase was recorded from the titre 1:100 in serum obtained on the fifth day of disease till the titre 1:3200 — on the twelfth day of disease. Antibodies titers reached 1:1600 and 1:800 were revealed in two medium course patients (adult and infant of 10 months) on the sixth day of disease.

201зетЦзЯмозММУ2Н85Те^ Краткие сообщения

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА СОВРЕМЕННОЙ ХОЛЕРЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИЧЕСКОГО ДИАГНОСТИКУМА В РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

И.В. Савельева1, В.Е. Безсмертный2, В.Н. Савельев1, Ю.М. Федоров2, С.М. Иванова2, В.В. Иванников2

1ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ставрополь, Россия 2 ФКУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора, Москва, Россия

Резюме. Показана возможность серологической диагностики холеры путем применения липосомального холерного энтеротоксического диагностикума в реакции связывания комплемента с целью определения анти-энтеротоксических антител в сыворотке крови больных холерой, обусловленной гибридными вариантами биовара эльтор. Так, при легком течении болезни холерные антиэнтеротоксические антитела выявлены в парных сыворотках крови, взятой на 7 и 14 дни болезни, в титрах соответственно 1:50 и 1:200 (4-кратное увеличение титра), при среднетяжелом течении — 1:100 (пятый день болезни) и 1:3200 (двенадцатый день болезни) (32-кратное увеличение титра). У двух больных на 6-й день со среднетяжелым течением болезни антитела выявлены в титрах 1:1600 (у взрослого) и 1:800 (у ребенка 10 месяцев).

Ключевые слова: серологическая диагностика, холера, липосомальный диагностикум, РСК.

Проблема холеры для России актуальна в связи с расширением угрозы завоза этой инфекции вследствие выноса холеры из Индии в район Карибского бассейна и продолжающейся, таким образом, вот уже более 50 лет седьмой пандемии холеры эльтор. За этот период времени холерный вибрион эльтор, являясь доминантным возбудителем холеры в мире, претерпел серьезные эволюционные изменения, касающиеся, прежде всего, его эпидемического и пандемического потенциала, устойчивости к обычно применяемым для лечения данного заболевания антибиотикам, повышения выживаемости

в объектах окружающей человека среды. Так, если в первые 3 десятилетия шествия седьмой пандемии холеры эльтор, начавшейся на о. Су-лавеси (Индонезия) в 1961 г., заболевания людей были обусловлены типичными токсигенными холерными вибрионами биовара эльтор (Vibrio cholera biotype eltor, Hly—, геном которого включает гены rstREl, ctxA, ctxBEl, rstC), то в настоящее время в этиологии холеры основную роль играют генетически измененные варианты биовара эльтор, содержащие в своем геноме, помимо эльторовских, гены классического холерного вибриона. Основой разнообразия генетических вариантов биовара эльтор является вариабельность профага CTXphi, геном которого содержит

Савельева И.В., к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории питательных сред для культивирования микроорганизмов I—IV групп патогенности, ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ставрополь; Безсмертный В.Е., к.м.н., директор ФКУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора, г. Ставрополь; Савельев В.Н., д.м.н., старший научный сотрудник, зав. лабораторией диагностики холеры и других кишечных инфекций, ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ставрополь;

Федоров Ю.М., д.м.н., профессор, заместитель директора ФКУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора, г. Ставрополь;

Иванова С.М., заместитель директора ФКУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора, Москва;

Иванников В.В., зав. бактериологической лабораторией ФКУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора, Москва.

Адрес для переписки:

Савельева Ирина Вилорьевна

355035, Россия, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15,

ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.

Тел.: (8652) 26-48-19; 8 962 000-59-18 (моб.). Факс: (8652) 26-03-12.

поступила в редакцию 26.12.2012 принята к печати 13.05.2013

основные гены патогенности данных вибрионов. Согласно исследованиям Н.И. Смирновой с соавт. [3], А.В. Шашковой, Я.М. Краснова [4], геноварианты биовара эльтор подразделяются на четыре генотипа: ctxBCI, rstREI, trp3; ctxBCI, rstREI, trp4; ctxB01, rstREl/rstRa, trp4; ctxBC'(Bl), rstRE'/rstRa, trp5. Вместе с тем, как у типичных, так и у генетически измененных холерных вибрионов биовара эльтор, основным патогенетическим фактором остается энтеротоксин, на который организм человека отвечает выработкой антитоксических (антиэнтеротоксических) антител. При этом следует учесть, что геноварианты продуцируют энтеротоксин классического типа, который кодируется геном ctxBF1, и в значительно большем количестве, вследствие чего можно ожидать более сильный иммунологический ответ при возникновении инфекционного процесса в организме человека.

В ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора сконструирована липосомальная диагностическая тест-система на основе липосомального энтеротоксическо-го диагностикума (ЛХЭД), лиофильно высушенного, в 1 мл которого содержится 200 мг ганглиозидсодержащих липосом, связанных с 11,6 КЕ чистого энтеротоксина классического типа. Ингредиенты, входящие в состав тест-системы, обеспечивают постановку реакции связывания комплемента ЛХЭД с сывороткой крови больного (подозрительного на заболевание) холерой для выявления антиэнтероток-сических антител и выдачу ответа через 5—6 ч.

Данная тест-система апробирована в экспериментальных условиях [1], и показано, что ЛХЭД четко выявляет в РСК холерные антиэн-теротоксические антитела в кроличьих антитоксических сыворотках, разведенных от 1:5 до 1:160—1:320; ни в одном случае диагности-кум не реагировал с 25 сыворотками здоровых людей. Диагностикум хранится в лиофильно высушенном состоянии в условиях холодильника (4°С).

В свете вышеизложенного целью настоящей работы явилось изучение возможности серологической диагностики холеры путем использования липосомальной диагностической тест-системы для выявления антиэнтеротоксических антител в сыворотке крови больных холерой, обусловленной генетически измененными (гибридными) вариантами биовара эльтор.

Материалы и методы

ТАБЛИЦА. СХЕМА ПОСТАНОВКИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ БОЛЬНЫХ ХОЛЕРНЫХ АНТИЭНТЕРОТОКСИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В РСК С ЛХЭД

Исследуемые сыворотки Разведение сывороток и количество в них ингредиентов РСК, мл КС 0,25 КЛ КГС

1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400

ЛХЭД 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Комплемент* 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

ТЕРМОСТАТ 37°С 60 минут

Гемолитическая система 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

ТЕРМОСТАТ 37°С 45 минут

Разведения сывороток 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 КС КЛ КГС

Серологическая диагностика холеры

обозначены как № 1—6д и № 2—6д (сыворотки крови, взятые в 2010 г. у женщины и ее десятимесячного ребенка со среднетяжелой формой болезни); № 3—7д и № 3—14д (парные сыворотки крови, взятые в 2010 г. у стюардессы соответственно на седьмой и 14 дни болезни с легким течением); № 4—5д и № 4—12д (парные сыворотки крови, взятые в 2012 г. у мужчины соответственно на пятый и двенадцатый дни пребывания в стационаре со среднетяжелым течением болезни).

Все сыворотки исследовали в РСК с ЛХЭД с целью выявления в них холерных антиэнтеро-токсических антител [2].

Результаты и обсуждение

Результаты исследования сывороток крови больных на наличие холерных антиэнтероток-сических антител в РСК с ЛХЭД представлены в таблице, из данных которой следует, что в сыворотках крови, взятых у женщины и ее ребенка на шестой день среднетяжелого течения болезни с помощью ЛХЭД в РСК выявлены холерные

антиэнтеротоксические антитела в титрах соответственно 1:1600 и 1:800, а в парных сыворотках крови, взятых у стюардессы на 7 и 14 дни с легким течением болезни, антиэнтероток-сические антитела выявлены соответственно в титрах 1:50 и 1:200, то есть отмечено 4-кратное нарастание титра. Более выраженное нарастание титра холерных антиэнтеротоксических антител отмечено при исследовании парных сывороток, взятых на 5 и 12 дни пребывания в стационаре мужчины со среднетяжелым течением холеры — соответственно 1:100 и 1:3200, то есть 32-кратное нарастание титра антител, что свидетельствует о мощном иммунологическом ответе организма человека при выраженной холерной инфекции, обусловленной гибридными вариантами биовара эльтор.

Таким образом, разработанная в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора липосомальная диагностическая тест-система оказалась пригодной для серологической диагностики современной холеры эльтор.

1. Савельева И.В. Разработка липосомального холерного энтеротоксического диагностикума // Холера и патогенные для человека вибрионы. — Ростов н/Д., 2001. — Вып. № 14. — С. 84—86.

2. Савельева И.В. Новый диагностикум для серологической диагностики холеры // Материалы VIII съезда Всерос. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26—28 марта 2002 г. — М., 2002. — Т. 3. — С. 322—323.

3. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.В., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio сМегае Эль Тор, завезенных на территорию России в современный период // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2011. — № 4. — С. 11—18.

Infekcia i immunitet (Infection and Immunity) eurkD-r ^mmi iMinATinikie

2013, vol. 3, no. 3, pp. 285-288 SHORT COMMUN|CATIONS

SEROLOGICAL DIAGNOSIS OF MODERN CHOLERA USING LIPOSOMAL ENTEROTOXIC DIAGNOSTICUM IN COMPLEMENT FIXATION TEST

Savelyeva I.V.a, Bezsmertnyj V.E.b, Savelyev V.N.a, Fedorov Yu.M.b, Ivanova C.M.b, Ivannikov V.V.b

a The Federal Government Public Health Institution "Stavropol Institute for Plague Control of the Rospotrebnadzor", Stavropol, Russian Federation

b The Federal Government Public Health Institution "Anti-plague Centre of the Rospotrebnadzor", Moscow, Russian Federation

Abstract. The possibility of serological diagnosis of cholera using cholera enterotoxic diagnostics kit in complement fixation test to detect anti-enterotoxic antibodies in sera of patients with cholera caused by hybrid variants of the El Tor biovar has been demonstrated. In patients with mild course of cholera anti-enterotoxic antibodies were detected in titres 1:50 and 1:200 in paired sera obtained on the 7th and 14th days of disease, respectively (fourfold titre increase). In patients with the course of medium severity 32-fold titre increase was recorded from the titre 1:100 in serum obtained on the fifth day of disease till the titre 1:3200 — on the twelfth day of disease. Antibodies titers reached 1:1600 and 1:800 were revealed in two medium course patients (adult and infant of 10 months) on the sixth day of disease.

Key words: serological diagnosis, cholera, liposomal diagnosticum, direct complement fixation test.

Savelyeva I.V. El, PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of media for cultivation of microorganisms of I-IV groups

of pathogenicity, Stavropol Institute for Plague Control;

355035, Russian Federation, Stavropol, Sovetskaya Street, 13-15.