Определение чувствительности трихомонад к антибиотикам

Neisseria gonorrhoeae

Резистентность возбудителя гонореи растёт с каждым годом и заслуживает всё большего внимания. Резистентные штаммы появились в Юго-Восточной Азии, и отсюда происходит их распространение по всему миру. Именно здесь в 1970-е гг. были впервые выявлены штаммы N.gonorrhoeae, продуцирующие пенициллиназы, а также распространяющиеся в настоящее время штаммы, резистентные к фторхинолонам. Фактически, фторхинолоны, считавшиеся несколько лет назад препаратами выбора, сегодня не подходит для лечения гонореи. Описанная в Азии ситуация стала последствием сочетания нескольких причин, включая недоступность препаратов высокого качества и проведение неполных курсов лечения, что приводит к воздействию субоптимальных концентраций антибиотика, способствуя, таким образом, селекции резистентных штаммов. В настоящее время отмечаются пугающие предвестники. В частности, в Японии довольно часто стала встречаться резистентность к цефиксиму. К счастью, пока не регистрируются случаи нечувствительности к цефтриаксону. Программы рационального применения лекарственных средств с контролем за распространением антибиотиков и использованием адекватных схем терапии могут оказать существенное влияние на снижение развития антибиотикорезистентности гонококков.

В Бильбао (Испания) в период с 2002 по 2004 г. отмечался рост распространённости фторхинолонорезистентных штаммов N.gonorrhoeae. Около 40% из 116 протестированных гонококков характеризовались сниженной чувствительностью к ципрофлоксацину. Распространённость штаммов с высоким уровнем резистентности увеличилась с 2,77% (1 из 36) в 2002 г. до 31,70% (13 из 41) в 2004 г. Молекулярное тестирование резистентных штаммов продемонстрировало их поликлональное происхождение. Большинство штаммов со сниженной чувствительностью были выделены от гомосексуальных пациентов. Нарастание распространённости гонококков со сниженной чувствительностью к фторхинолонам в Бильбао привело к прекращению использования схемы однократного приёма фторхинолонов для терапии неосложнённой гонореи.

Общепринятым лечением неосложнённой гонококковой инфекции считается однократный приём фторхинолонов, пероральное или парентеральное введение цефалоспоринов. Однако, распространение штаммов с минимальной подавляющей концентрацией (МПК) ≥1 мкг/мл сделало лечение менее надёжным и стимулирует поиск более активных фторхинолонов или альтернативных препаратов. Гемифлоксацин рассматривается в качестве препарата для лечения гонореи, вызванной устойчивым к фторхинолонам штаммом. Данный препарат обладает в 4 раза более высокой активностью по сравнению с ципрофлоксацином и левофлоксацином, что было показано на коллекции гонококков, включавшей 20% штаммов, резистентных к фторхинолонам, 31,2% пенициллинорезистентных изолятов и 23,6% гонококков, резистентных к тетрациклину. МПК₉₀ цефтриаксона составила 0,06 мкг/мл (100% штаммов сохраняли чувствительность). Повышенная частота резистентных к фторхинолонам штаммов выявлена на Гавайях (64,0%), в штате Вашингтон (32,9%), Калифорния (20,0%) и Орегон (13,3%). Отмечается тенденция сочетания резистентности к фторхинолонам, тетрациклинам и пенициллинам. Резистентность к фторхинолонам нарастает в США в последнее десятилетие, как и на Дальнем Востоке. Гемифлоксацин остается активным (МПК≤0,25 мкг/мл) в отношении ципрофлоксацинорезистентных гонококков. Необходимо проведение клинических исследований для определения оптимальной длительности курса терапии гемифлоксацином при множественноустойчивой инфекции.

Trichomonas vaginalis

Трихомониаз является широко распространённым паразитарным заболеванием, передаваемым половым путём. Центрами по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) для терапии трихомониаза рекомендован пероральный прием 2 г метронидазола. Некоторые изоляты демонстрируют повышение резистентности к этой дозе, и имеется опасность распространения резистентности. Тестирование 126 клинических штаммов, полученных в 2004-2005 гг., с использованием протокола определения чувствительности T.vaginalis, предложенного CDC, показало, что 12/126 (9,5%) штаммов обладали резистентностью, при этом 10/126 (7,9%) имели низкий уровень резистентности и 2/126 (1,6%) — средний и высокий уровень резистентности к метронидазолу. Низкий уровень резистентности к тинидазолу выявлен у 1 штамма, при этом МПК составила 50 мкг/мл. На основании представленных данных в случае неэффективности метронидазола следует проводить терапию трихомониаза тинидазолом.

Antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae.

Clin Infect Dis 2005; 41(S4): S263-8.

Sexually Transmitted Infections.

Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, резистентность, гонорея, гонококки, трихомониаз, ципрофлоксацин, фторхинолоны, тинидазол, метронидазол

Трихомониаз — самое распространенное заболевание, предающееся половым путем [1] . Он встречается чаще, чем сифилис и гонорея, вместе взятые [2] . Это заболевание часто протекает бессимптомно и приводит к серьезным осложнениям. Поэтому так важно знать, как вовремя выявить трихомониаз и какие анализы нужно сдать, чтобы его обнаружить.

Трихомониаз — это заболевание мочеполовой системы, которое вызывает небольшое одноклеточное простейшее трихомонада.

Трихомонада — крайне нестойкий организм. Она не переносит высушивания, на влажном белье может сохраняться всего 2–3 часа, и даже водопроводная вода убивает ее всего за несколько минут [3] . То есть заразиться трихомониазом бытовым путем практически невозможно. Для этого обязательно нужен половой контакт.

По данным исследователей, в разных странах трихомонаду выявляют у 2–85% мужчин и 12–65% женщин, которые обратились по поводу уретритов и других воспалительных заболеваний мочеполовой системы. Ученые объясняют такую разницу в показателях точностью лабораторной диагностики трихомониаза [6] .

Если брать российские данные, то трихомонадная инфекция составляет около 34,8% случаев негонококкового уретрита у мужчин и 20–40% обращений среди пациенток гинекологических клиник [7] .

Трихомониаз не всегда вызывает клинически выраженное заболевание. У женщин до половины случаев заражения могут протекать бессимптомно. И выявляется это заболевание уже при обследовании по поводу осложнений — бесплодия, невынашивания беременности, сальпингоофорита, эндометрита [8] . Трихомонады увеличивают риск заражения ВИЧ-инфекцией и риск развития рака шейки матки [9] .

Из-за трихомониаза в половых путях и в уретре развивается воспалительная реакция, появляются микроскопические кровоизлияния. Это нарушает естественный защитный барьер и делает организм более восприимчивым к любым другим инфекциям. Лейкоциты и другие иммунные клетки мигрируют в очаг поражения, где создается их большая концентрация. А именно эти клетки в первую очередь поражает ВИЧ-инфекция. И от того, насколько высока их концентрация в месте соприкосновения с вирусом, зависит вероятность заражения [10] .

Симптомы трихомониаза у женщин — болезненность и дискомфорт внизу живота, которые усиливаются при половых контактах или при мочеиспускании. Появляются выделения желтоватого цвета из половых путей. Часто эти выделения имеют пенистый вид и неприятный запах.

У мужчин появляются слизистые выделения из уретры, боль во время мочеиспускания и половых контактов. Основными осложнениями этой инфекции для мужчин являются простатит и везикулит [11] . В одном из исследований было доказано, что именно трихомонада стала причиной хронического простатита у 29% пациентов [12] .

Российское общество дерматовенерологов и косметологов советует проводить диагностику трихомониаза [13] :

• при воспалительных урологических и гинекологических заболеваниях;
• при обследовании партнеров во время планирования беременности;
• во время самой беременности;
• перед урологическими и гинекологическими операциями;
• при бесплодии;
• после незащищенного полового контакта.

Для выявления трихомонады используют четыре типа методов: микроскопический, культуральный, молекулярно-генетический и серологический. Для того чтобы установить диагноз, достаточно обнаружить этот микроорганизм хотя бы одним из первых трех методов [14] .

Микроскопия — это выявление трихомонады в мазках. Биологический материал наносят на предметное стекло и исследуют его под микроскопом.

Кроме исследования влажного мазка материал могут обрабатывать различными красителями. В этом случае врач ищет под микроскопом клетки определенного размера со специфической окраской и формой.

Этот метод применяют, когда заболевание не сопровождается ярко выраженными симптомами [17] . Его также используют как второй этап диагностики, если микроскопический метод не дал результата. Чувствительность этого метода достигает 95% [18] . Из минусов можно отметить длительность исследования.

Молекулярно-генетические методы — это различные виды ПЦР, NASBA и других реакций, которые выявляют участки ДНК или РНК в биоматериале. ПЦР обладает меньшей чувствительностью, чем культуральный метод, порядка 88–97% [19] . А по некоторым данным — от 55 до 95% [20] .

ПЦР желательно применять вместе с культуральным исследованием. Это значительно повышает вероятность выявления болезнетворного микроорганизма.

Серологическое исследование , то есть определение в крови антител к трихомонаде, используется как дополнение к первым трем методам. Если коротко, то сдать анализ крови на трихомониаз можно, но его результаты нужно оценивать только комплексно с учетом других исследований.

Его недостатком является возможность ложных положительных и ложноотрицательных реакций. Из положительных моментов — антитела сохраняются длительное время, около 1 года после заражения [21] . То есть даже спустя год можно определить, что человек перенес трихомониаз.

Для определения уровня антител понадобится кровь, для проведения всех остальных исследований чаще всего берут соскоб из уретры. У женщин также могут брать материал из влагалища или из цервикального канала — здесь концентрация трихомонад будет самая высокая.

Мужчинам перед взятием анализа на трихомониаз нужно не мочиться около двух–трех часов. Для женщин правил несколько больше. Обследование не проводится во время месячных или накануне, после кольпоскопии или вагинального УЗИ. За 1–2 дня до обследования желательно не использовать свечи, спринцевания и воздержаться от половых актов. Все эти процедуры нарушают состав микрофлоры, и исследование может получиться неточным.

Для проведения ПЦР кроме соскоба можно использовать первую порцию утренней мочи или сперму. Собрать сперму или мочу нужно в специальный стерильный контейнер.

Из всех анализов на трихомониаз самый быстрый — микроскопия нативного мазка. В идеале она должна проводиться через 10 минут после взятия материала. За это время трихомонады не успевают потерять свою подвижность и сохраняют типичную форму [22] . То есть уже примерно через час врач может дать предварительный результат.

В реальности такое возможно в гинекологических или урологических клиниках, при которых есть своя лаборатория с возможностью проводить микроскопическое исследование.

Окрашенные мазки не требуют такой срочности анализа. Поэтому результат будет готов на следующий день или через день.

Результаты ПЦР-исследования обычно можно получить через 1–2 рабочих дня. При обнаружении трихомонад результат могут задержать для постановки подтверждающих проб. Положительный результат выдают при обнаружении этих микроорганизмов, отрицательный — при их отсутствии.

Диагностика трихомониаза культуральным методом — самая долгая. Она может занимать более недели. За это время исследуемый материал помещают на питательную среду, следят за ростом микроорганизмов на ней, проводят повторное определение возбудителя. Идеальный вариант — отсутствие роста. Это означает, что в собранном материале не было живых трихомонад. Если, конечно, были точно соблюдены все требования по забору биоматериала, его хранению и транспортировке. Положительный результат анализа на трихомониаз говорит о заражении.

Анализ крови на трихомониаз проводится в течение 1–2 рабочих дней. Положительный результат говорит о том, что в крови есть антитела, то есть пациент или болеет трихомониазом, или перенес его в прошлом. Отрицательный результат — отсутствие заболевания или низкий уровень антител. Сомнительный — это пограничный результат, который сложно интерпретировать. В таком случае обычно рекомендуют повторить исследование через 1–1,5 недели.

Стоимость анализа на трихомониаз зависит от метода исследования и метода забора материала. Например, в Москве стоимость забора мазка из уретры или из влагалища — около 400 рублей. За взятие крови возьмут 150–200 рублей. А при сдаче мочи или спермы доплачивать не придется, стоимость контейнера обычно уже включена в цену исследования.

Микроскопия мазка будет стоить от 450 до 600 рублей в зависимости от лаборатории. ПЦР-исследование — 300–450 рублей вне зависимости от вида материала. Анализ на трихомониаз культуральным методом выполняется не во всех клиниках и стоит от 800 до 1300 рублей [24] . А серологическая диагностика трихомониаза по крови обойдется примерно в 600–800 рублей.

Трихомониаз — это венерическое заболевание, которое часто протекает бессимптомно и является причиной серьезных осложнений. Лабораторная диагностика трихомониаза позволяет выявить это заболевание даже в стертой форме и вовремя начать лечение. А лучшей профилактикой любых половых инфекций остается использование барьерных методов контрацепции.

От­каз от слу­чай­ных по­ло­вых свя­зей и за­щи­щен­ный секс — вот луч­шие ме­то­ды про­фи­лак­ти­ки три­хо­мо­ни­а­за и дру­гих ИП­ПП. Но если за­ра­же­ние все же про­изо­шло, сто­ит точ­но со­блю­дать схе­му ле­че­ния и по окон­ча­нии те­ра­пии прой­ти кон­троль­ный ана­лиз. Кста­ти, сей­час во мно­гих част­ных кли­ни­ках ком­плек­с­ную ди­аг­нос­ти­ку ИП­ПП мож­но прой­ти ано­ним­но.

Трихомониаз во всём мире в последние десятилетия считается наиболее распространённой инфекцией, передаваемой половым путём, является частой причиной хронических воспалительных заболеваний мочеполовой сферы человека [24; 26]. В России в 2002 г. уровень заболеваемости урогенитальным трихомониазом составил 282,9, в 2003 г. - 261,0, в 2004 г. - 201,2 на 100 000 населения [9; 10]. В последние годы наблюдается уменьшение этого показателя, однако данная тенденция не повсеместна и в целом эпидемиологическая ситуация остается напряженной. У мужчин трихомонады также могут быть одной из причин бесплодия, в основе которого, как правило, поражение предстательной железы (ПЖ). По данным М.Л. Амозова (2001), при хроническом простатите T.vaginalis выявляются у 29% больных. Доказана роль T.vaginalis в развитии осложнений при беременности и в её неблагоприятном исходе [23; 30], развитии бесплодия у женщин, в том числе вследствие сальпингитов, развившихся в детском возрасте [27]. Установлено значение влагалищных трихомонад в увеличении риска заболевания ВИЧ-инфекцией [31; 33] и рака шейки матки [34].

Проведённый нами анализ частоты обнаружения трихомонад в последние годы в российских и зарубежных лабораториях демонстрирует аналогичное расхождение по данному показателю (табл. 1).

Таблица 1 - Частота обнаружения T.vaginalis у больных с урогенитальной симптоматикой, по данным работ отечественных и зарубежных авторов, опубликованных в 2001-2004 гг.

Авторы, год публикации

Пол обследуемых

Частота выявления, (%)

Козлюк А.С., Козлюк В.А., 2001

Wendel K. et al., 2001

Сrucitti T. et al., 2001

Kayos S.C. et al., 2001

Kendrick C.S. et al., 2001

Wendel K. et al., 2001

Williams J.A. et al., 2001

Жабин С.Г. с соавт., 2002

Литвинова М.М. с соавт., 2002

Агиров А.Х. с соавт., 2002

Введенская Э.В. с соавт., 2003

Шайхутдинов Р.Г. с соавт., 2003

Сорокина Е.А., Симонова О.Г., 2004

Симещенко И.Е. с соавт., 2004

Kesli R. et al., 2004

Обсуждая вопрос точности ПЦР-анализа, можно привести весьма показательную работу T. Crucitti et al. (2001), в которой было проведено комплексное сравнение чувствительности различных модификаций метода, отличающихся по выявляемой ДНК-мишени (праймерам). В результате уровень чувствительности ПЦР составил от 53,2 до 87,3%. Возможные технические погрешности на этапах пробоподготовки при ПЦР-анализе и вероятность как ложноотрицательных, так и ложноположительных ответов могут свидетельствовать о недостаточной воспроизводимости метода и предостерегают от его излишней идеализации.

Существенное значение в лабораторной диагностике урогенитального трихомониаза имеют особенности проведения исследования и трактовки полученных результатов. Остается проблема оценки детекции неподвижных форм простейших, не учитываемых при микроскопии нативных препаратов, особенно у мужчин, и, напротив, принятие за трихомонады деградированных макрофагов [2; 6; 7; 22]. В литературе описаны случаи выявления контаминирующих питательную среду непатогенных жгутиковых простейших (Pleuromonas jaculans), ошибочно принимаемых за T.vaginalis [16], и примеры контаминации влагалища кишечными трихомонадами.

Очевидно, что для получения объективной картины первостепенное внимание должно отводиться стандартности лабораторного анализа, использованию регламентированных схем выполнения исследования, разрешённых к применению (сертифицированных) тест-систем, наборов реактивов и питательных сред. Перечисленные факторы могут существенно влиять на частоту выявления влагалищных трихомонад и показатели заболеваемости этой инфекцией. Но одной из основных причин разницы в частоте обнаружения T.vaginalis по данным разных авторов, очевидно, следует считать отличия в обследуемых контингентах и качество (тщательность) проведённого обследования. H. Swygard (2004) на основании анализа 369 публикаций, посвященных проблеме трихомониаза, делает заключение, что частота болезни у мужчин составляет 5-29%, у женщин - 5-74% и определяется характером обследуемых групп населения.

Урогенитальный трихомониаз может оставаться незамеченным прежде всего в случаях асимптомного носительства T.vaginalis, которое у мужчин составляет от 10,6 до 27,8% [6]. По данным В.А. Молочкова (2002), в настоящее время около 90% больных приходят к врачу уже с хронической формой инфекции. При этом инфекционный агент может локализоваться в криптах цервикального канала, верхних отделах половых путей женщин, осумкованных очагах воспаления в ПЖ и т.д., и только правильное проведение топической диагностики обеспечит грамотную тактику лабораторного обследования. Субманифестное течение болезни обусловливает повышенные требования к более тщательной лабораторной диагностике трихомониаза. Регламентировано положение, определяющее, что единственным достоверным доказательством трихомониаза служит обнаружение типичных (подвижных) форм паразитов в мазках или посевах. Бактериологические методы при анализе материала от мужчин менее надежны, чем от женщин, так как в отделяемом уретры, как правило, содержится значительно меньше возбудителей и они часто малоподвижны. Диагностическая чувствительность микроскопии нативных препаратов по сравнению с культуральным методом (КМ) составляет, по разным данным, 10-60% [6; 18; 28; 29]. Чувствительность метода микроскопии окрашенного мазка (ОМ) не превышает 60% [19]. Повышению уровня диагностики способствует широкое применение КМ. Однако при малом числе T.vaginalis или их гибели при транспортировке или высеве КМ не позволяет обнаружить трихомонады. Неоднозначные результаты, получаемые с помощью данного подхода, могут объясняться нестандартностью используемых питательных сред.

При обобщении данных отечественных и зарубежных авторов по диагностической чувствительности разных методов выявления трихомонад, выполненных одновременно в сравнительных исследованиях, можно заключить, что чувствительность КМ составляет величину порядка 40-90%, ПЦР - 55-95% и микроскопии (влажного или окрашенного мазка) - 30-70% (табл. 2).

Таблица 2 - Чувствительность методов лабораторной диагностики трихомониаза, по данным отечественных и зарубежных авторов

Махлай Н.С., Березина Л.А., Вербов В.Н., Закревская А.В., Жебрун А.Б.

• ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, Санкт-Петербург.

Цель. Разработка тест-системы для определения чувствительности Trichomonas vaginalis к препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана.

Материалы и методы. Определение минимальных цидных концентраций (МЦК) противопротозойных препаратов проводили при культивировании лабораторных штаммов Т.vaginalis в лунках планшетов с питательной средой, содержащей различные концентрации этих препаратов. Оценку жизнеспособности возбудителя определяли с помощью витальной окраски трипановым синим и по способности к последующему росту на питательной среде без добавления противопротозойных препаратов. Конструирование тест-системы проводили путем подбора условий для фиксации препаратов в лунках планшетов и контроля сохранения активности после фиксации. Для апробации тест-системы использовали 109 изолятов, выделенных от больных с подтвержденным диагнозом трихомониаз.

Результаты. При культивировании десяти лабораторных штаммов было показано, что МЦК исследуемых препаратов имели следующие значение мкг/мл: метронидазол 5, тинидазол 1,25 мкг/мл, секнидазол 2,5 мкг/мл, ниморазол 1,25 мкг/мл, орнидазол 2,5 мкг/мл, клотримазол 15 мкг/мл, нифуратель 1,25 мкг/мл. При исследовании клинического материала была выявлена однотипная чувствительность штаммов, выделенных при остром трихомониазе, и различная - при хроническом, при этом один штамм обладал множественной устойчивостью.

Заключение. Разработана простая и доступная для рутинной лабораторной работы тест-система для определения чувствительности T.vaginalis к препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана. Эффективность теста обеспечивает высокую чувствительность, воспроизводимость и меньшую длительность процедуры по сравнению с классическим методом, что позволяет с наибольшей вероятностью подобрать препарат для терапии. Изучено применение этой тест-системы для определения чувствительности изолятов, выделенных при остром и при хроническом трихомониазе.

Ключевые слова: Trichomonas vaginalis, тест, 5-нитроимидазолы, 5-нитрофураны, чувствительность.

Development and application of a test for sensitivity evaluation of trichomonas vaginalis to nitroimidazoles and nitrofurans

N.S. Makhlay, L.A. Berezina, V.N. Verbov, A.V. Zakrevskaya, A.B. Zhebrun.

• Pasteur Institute of Epidemiology and Microbiology, St.Petersburg, Russia.

Aim. To develop a test for determining the Trichomonas vaginalis sensitivity to 5-nitroimidazole and 5-nitrofuran derivatives.

Materials and methods. Determination of minimal lethal concentrations (MLC) of anti-protozoa drugs was carried out by culturing T.vaginalis strains in wells with medium containing various concentrations of these drugs. The viability evaluation of the pathogen was determined by vital staining with trypan blue and by the ability to subsequent growth in medium without adding drugs. Designing the test was performed by adjusting conditions for drugs fixation in plates wells and control the activity preservation after it. 109 isolates from patients who had been confirmed of having trichomoniasis were used for approbation of the test.

Results. During the cultivation of ten strains T.vaginalis it was shown that MLC of studied drugs were as follows µg/ml: metronidazole 5 µg/ml, tinidazole 1,25 µg/ml, seknidazol 2,5 µg/ml, nimorazol 1,25 µg/ml, ornidazole 2,5 µg/ml, clotrimazole 15 µg/ml and nifuratel 1,25 µg/ml. In the study with clinical samples it was shown similar sensitivity of strains isolated from patients with acute infection and variable sensitivity of strains isolated from patients with chronicle infection. One strain possessed a multiple resistance.

Conclusion. A simple and practical test for routine laboratory work was designed for screening T.vaginalis sensitivity to 5-nitroimidazole and 5-nitrofuran derivatives. The performance of the test provides high sensitivity and reproducibility, less time consuming compared with classic method, making it more suitable for selection therapy. The application of this test for determining the sensitivity of isolates in acute and chronic trichomoniasis was studied.

Key words: Trichomonas vaginalis, test, 5-nitroimidazole, 5-nitrofuran, sensitivity.

Введение

Традиционная специфическая терапия трихомониаза заключается в применении препаратов группы 5-нитроимидазола (5-НИМЗ), обладающих высокой активностью в отношении Protozoa. Все эти препараты имеют нитрогруппу в положении 5-го имидазольного цикла и практически не различаются между собой по степени и спектру антипротозойной активности [1]. Механизм действия этих препаратов основан на их проникновении в клетку путем диффузии, восстановлении нитрогруппы в гидрогеносомах с участием пируват-ферредоксин оксидоредуктазы и образовании свободных нитрит радикалов, которые повреждают цепи ДНК, вызывая гибель простейшего в течение 8 часов. Хотя однотипный механизм действия обуславливает возможность развития перекрестной резистентности трихомонад к 5-НИMЗ, она, тем не менее, является неполной и выявляется относительно редко [6].

Первый представитель этого ряда - метронидазол был синтезирован в 50-х годах прошлого века и уже в 60-х его стали использовать для лечения трихомонадной инфекции [2]. Также широкое применение в медицинской практике получили тинидазол и орнидазол. В значительной степени интерес к этим препаратам связан с их достаточно хорошей переносимостью и хорошими фармакокинетическими свойствами. Например, тинидазол имеет более длительный период полувыведения, чем метронидазол и его концентрация в вагинальных выделениях близка к концентрации в сыворотке, что говорит о лучшей биодоступности тинидазола в этой области. Перекрестная устойчивость тинидазола с метронидазолом является неполной, при этом его минимальная цидная концентрация (МЦК) ниже чем у метронидазола [4].

Орнидазол и секнидазол также имеют по сравнению с метронидазолом более длительный период полувыведения. Ниморазол, напротив, элиминируется быстрее. Тем не менее препарат обладает выраженной антипротозойной активностью, поскольку два его основных метаболита более активны, чем метаболиты метронидазола [3].

Все эти препарата зарегистрированы и разрешены для медицинского применения в России.

Неэффективность терапии урогенитального трихомониаза может быть обусловлена целым рядом факторов, связанных с особенностями как макро, так и микроорганизмов. К числу наиболее частых причин неэффективности лечения большинство авторов относят недостаточно высокую комплаентность пациентов и реинфекцию, хотя в отдельных статьях ведущее место отводится резистентности Т.vaginalis к метронидазолу. Среди других возможных причин неудачного лечения указывают недостаточную абсорбцию препарата в желудочно-кишечном тракте, низкую степень его доставки в урогенитальные органы, инактивацию микрофлорой влагалища, а также низкую концентрацию цинка в плазме крови [1].

Первые случаи резистентности Т.vaginalis к метронидазолу были зарегистрированы в 1962 г [6]. По нашим данным, полученным при тестировании 865 клинических штаммов Т. vaginalis, выделенных в 2006-2009 гг., резистентность к метронидазолу была выявлена у 8,1 % изолятов.

В последние годы актуальна также другая группа этиотропных средств - препараты 5-нитрофурана (5-НИТФ), в частности нифуратель. Нитрофураны в качестве монотерапии обычно используют в тех случаях, когда лечение 5-нитроимидазолами невозможно, например, в случаях имеющейся гиперчувствительности.

В настоящее время назначение лечения производят в соответствии с протоколом ведения больных урогенитальным трихомониазом (утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005). Этот документ не регламентирует проведение предварительного подбора препарата in vitro для каждого штамма. Вероятно, следствием такого подхода является высокая частота случаев неэффективного лечения и хронизации заболевания.

Несмотря на существование проблемы, связанной с подбором наиболее подходящего для каждого пациента препарата, в настоящее время не существует доступной для широкой практики тест-системы, позволяющей определять чувствительность Т.vaginalis к антипротозойным препаратам in vitro.

Для определения чувствительности Т.vaginalis к различным лекарственным средствам используют метод серийных разведений. Суть метода заключается в приготовлении серийных разведений лекарственного средства в жидкой питательной среде (контроль - среда без лекарственного средства). Затем в каждую пробирку со средой вносят одинаковую концентрацию культуры исследуемого штамма Т.vaginalis и после инкубации в течение 48-72 часов микроскопически определяют наличие живых форм возбудителя в каждой пробирке. Этот метод трудоемок и имеет высокую стоимость.

В данной работе представлены результаты разработки и применения тест-системы для определения чувствительности Т.vaginalis к противопротозойным препаратам.

Штаммы Т.vaginalis Pr001, Pr002, Pr004, Pr005, Pr006, Pr007, Pr011, Pr027 были получены из Городского кожно-венерологического диспансера (г. Санкт-Петербург). Перед проведением исследования культуры выращивали на питательной среде для выявления трихомонад - СВТ (№ ФСР 2009/05982) и использовали при достижении логарифмической фазы роста. Микроскопию нативных препаратов проводили при помощи устройства для микробиологических исследований - гребенка (номер заявки 2010124024 от 11.06.2010 г.). Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Было исследовано 109 штаммов Т.vaginalis, выделенных от больных с установленным диагнозом трихомониаз. Диагноз был установлен на основе культурального исследования на питательной среде СВТ, а также ПЦР-РТ с использованием набора фирмы ИнтерЛабСервис (№ ФС 01262006/5190-06) на приборе АНК-32. При этом 10 штаммов (группа А), было выделено от больных с острой формой инфекции и 99 штаммов (группа Б) - от пациентов с хронической формой урогенитального трихомониаза.

Использовали субстанции следующих противопротозойных препаратов: метронидазол, тинидазол, орнидазол, клотримазол производства Sigma-Aldrich (USA) и секнидазол, ниморазол, нифуратель производства Zxchem (China). Для приготовления исходных растворов препаратов с концентрацией 1 мг/мл в качестве растворителя использовали демитилсульфоксид (ДМСО). Рабочие растворы готовили последовательным разведением исходных растворов в питательной среде СВТ.

Разработка тест-системы для определения чувствительности T.vaginalis. С целью создания тест-системы был решен ряд практических задач: при использовании лабораторных штаммов было определено оптимальное время культивирования в лунках планшетов и выбрана посевная доза заражающего материала, что позволило стандартизировать при последующих опытах основные условия проведения анализа. Было установлено, что максимальный прирост биомассы происходит через 48 часов культивирования при посевной дозе заражающего материала 5 х 10 4 кл/мл (рис. 1).

Рисунок 1

Для определения МЦК противопротозойных препаратов проводили культивирование штаммов Т.vaginalis в питательной среде, содержащей различные концентрации этих препаратов. При определении МЦК, под которой понимали наименьшую концентрацию препарата, вызывающую гибель 100% клеток трихомонад, использовали два критерия: оценку жизнеспособности возбудителя по методу витальной окраски трипановым синим и способность штаммов к последующему росту в питательной среде СВТ без добавления противопротозойных препаратов. Одновременно проводили определение МЦК традиционным методом последовательных разведений препаратов в пробирке [5] и были получены идентичные результаты.

Определение МЦК описанных выше препаратов позволило выбрать их рабочие концентрации. МЦК для исследованных препаратов имеют следующие значения: КТЗ - 15 мкг/мл, МТЗ - 5 мкг/мл, СКЗ - 2,5 мкг/мл, ОРЗ - 2,5 мкг/мл, НМЗ - 1,25 мкг/мл, ТНЗ - 1,25 мкг/мл и НФТ - 1,25 мкг/мл.

Для исследования сохранения активности препаратов в выбранных МЦК проводили их фиксацию в лунках полистироловых планшетов в течение 24 часов при температуре 50 °С в вакуумном сушильном шкафу. Сохранение активность высушенных препаратов оценивали при сравнении их способности оказывать цидное действие на штаммы Т.vaginalis до и после фиксации.

На следующем этапе было проведено определение срока хранения стрипов с фиксированными противопротозойными препаратами методом "ускоренного старения". При этом было показано, что срок хранения таких стрипов без потери активности зафиксированных в лунках препаратов составляет 13 месяцев.

Таким образом, в состав разработанной тест-системы для определения чувствительности T.vaginalis к противопротозойным препаратам входят следующие компоненты:

• питательная среда для выявления T.vaginalis;
• стрипы с сорбированными противопротозойными препаратами;
• пленки для заклеивания стрипов;
• гребенки для микроскопии.

Рисунок 2

Схема расположения противопротозойных препаратов и контроля в лунках стрипа и помещения гребенки в лунки стрипа: а - устройство для микроскопии, б - стрип с фиксированными препаратами (К - контроль, НФТ - нифуратель, КТЗ - клотримазол, СКЗ - секнидазол, ОРЗ - орнидазол, НМЗ - ниморазол, ТНЗ - тинидазол. МТЗ - метронидазол).

Апробация тест-системы. Проводили в лаборатории иммунология ФГУН НИИЭМ имени Пастера, где для проведения исследования чувствительности к противопротозойным препаратам первоначально осуществляли накопление выделенных изолятов на питательной среде СВТ до концентрации 10 5 кл/мл. После этого готовили инокулят путем суспензирования осадка в 0,5 мл свежей питательной среды СВТ. Для проведения исследования из набора брали стрипы с фиксированными противопроозойными препаратами и устанавливали их в рамку-держатель. Во все лунки (рис. 2б) вносили прогретую до 37 °С питательную среду СВТ и приготовленный инокулят, который перед внесением перемешивали пипетированием. Стрип заклеивали пленкой и помещали в термостат при температуре 37 °С.

Учет результатов проводили через 48 часов. Для этого содержимое лунок перемешивали при помощи многоканальной пипетки, а затем в лунки стрипа погружали зубцы гребенки (рис. 2а). Первоначально просматривали зубец-контроль на наличие клеток T.vaginalis, затем все остальные зубцы. При отсутствии живых форм T.vaginalis в лунке с препаратом штамм оценивали как чувствительный. При наличии живых форм T.vaginalis в лунке с препаратом штамм оценивали как резистентный.

Таблица 1.

Обозначения: R - резистентный, S - устойчивый.

Полученные результаты представлены в таблице 1. Из всех изолятов группы А только один обладал резистентностью к клотримазолу и ниморазолу. Напротив, значительная часть штаммов группы Б была устойчива к метронидазолу и другим лекарственным средствам, при этом один изолят обладал резистентностью сразу к четырем препаратам.

Разработана тест-система для определения чувствительности T.vaginalis к широкому спектру противопротозойных препаратов. Тест-система основана на простом и доступном для рутинной лабораторной работы методе. Эффективность метода обеспечивает 95 % чувствительности и 99 % воспроизводимости, что позволяет с наибольшей вероятностью подобрать препарат для терапии.

Разработанная тест-система принципиально отличается от существующего способа определения чувствительности тем, что отсутствуют стадии приготовления и разведения препаратов ex tempore, а стадия учета результатов упрощена и ускорена за счет использования витальной окраски и устройства для микроскопических исследований, разработанного нами. Все это позволяет стандартизовать процедуру проведения исследования на всех ее этапах.

Предлагается также использовать эту тест-систему для одновременного выявления T.vaginalis и определения чувствительности к препаратам, т.е. тест-система позволит еще на стадии выявления заболевания проводить подбор препарата лечения без повторного забора материала, поскольку входящая в состав набора среда СВТ позволяет накапливать и сохранять культуру T.vaginalis в течение недели.

Тестирование 109 штаммов показало, что штаммы, изолированные у пациентов с острой формой трихомонадной инфекции, как правило, чувствительны к действию метронидазола и других антипротозойных препаратов, в то время как культуры, выделенные от пациентов с хроническим трихомониазом, обладали резистентностью в 23,1 % (метронидазол) - 71,7 % (ниморазол) случаев. Такое различие свойств может объяснять довольно высокую распространенность трихомониаза среди населения нашей страны и свидетельствует о целесообразности определения чувствительности T.vaginalis к противопротозойным препаратам in vitro.

Работа поддержана грантом молодых ученых ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора.

Контактная информация: Махлай Наталья Сергеевна, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадозора, р.т. (812) 232-80-35.