Бета лактамаза продуцирующий стафилококк

Резистентность микроорганизмов, обусловленная бета-лактамазами, и способы ее преодоления

В настоящее время бета-лактамные антибиотики являются наиболее часто применяемыми препаратами для лечения бактериальных инфекций, однако их эффективность может снижаться вследствие возникновения к ним устойчивости, наиболее частым механизмом развития которой является продукция бета-лактамаз. Для преодоления данного специфического механизма резистентности были синтезированы ингибиторы бета-лактамаз, способные подавлять активность широкого ряда бета-лактмаз, вырабатываемых грамположительными, грамотрицательными и анаэробными патогенами. В данной статье будут рассмотрены механизм действия и спектр активности одного из наиболее часто применяемых ингибиторозащищенных бета-лактамов — амоксициллин/клавуланата.

Семейство бета-лактамных антибиотиков включает четыре основные группы антимикробных препаратов: пенициллины, цефалоспорины, монобактамы и карбапенемы.

Бета-лактамные антибиотики действуют на клетку бактерии двумя основными путями. Во-первых, они встраиваются в стенку бактериальной клетки и подавляют активность фермента транспептидазы, участвующего в завершающем этапе построения стенки бактерии. Во-вторых, они связываются с пенициллинсвязывающими белками (ПСБ), которые в норме подавляют гидролазы бактериальной клетки и таким образом высвобождают эти гидролазы, что приводит к лизису бактериальной стенки. Для борьбы с этими основными механизмами действия бета-лактамов бактерии приобрели способность вырабатывать специальные ферменты бета-лактамазы, способные гидролизировать бета-лактамное кольцо, а также изменять тип строения ПСБ [1].

Синтез бета-лактамаз кодируется или хромосомами (конститутивный тип), например Pseudomonas aeruginosa, или плазмидами (индуцибельный тип), например Aeromonas hydrophila и Staphylococcus aureus. Плазмиды могут передаваться от одной бактерии к другой, способствуя быстрому распространению резистентности.

Механизм действия бета-лактамаз

Бета-лактамазные ферменты разрушают бета-лактамное кольцо двумя основными механизмами. Первый механизм, присущий лактамазам классов А, С и D (деление на классы проводится в зависимости от последовательности аминокислот в структуре фермента), заключается в связывании с субстратом благодаря наличию специального гибкого активного участка (рис. 1). Происходит необратимое связывание с углеродом карбонильной группы бета-лактамного кольца и нарушение его целостности, что переводит антибиотик в неактивное состояние и попутно обеспечивает регенерацию бета-лактамазы. Эти классы бета-лактамаз активны в отношении многих пенициллинов, цефалоспоринов и монобактамов. Второй механизм присущ менее распространенной группе бета-лактамаз, которые относятся к классу В. Ферменты этого класса называются также металло-бета-лактамазами, поскольку содержат подвижный двухвалентный ион металла, чаще всего ион цинка, который способен связываться с карбонильной группой большинства пенициллинов, цефалоспоринов и карбапенемов, но не монобактамов [1].

Классификация бета-лактамаз

Начиная с 60-х годов XX века предлагалось несколько классификаций бета-лактамаз, исходя из их биохимических и функциональных особенностей и различий в молекулярном строении (табл. 1) [3–5].

Большинство клинически значимых бета-лактамаз принадлежат к классам А и С. В частности, класс А включает хромосомные бета-лактамазы Klebsiella spp., Citrobacter diversus, Proteus vulgaris и большинство Bacteroides spp., а также практически все плазмидные бета-лактамазы. Класс С содержит хромосомные цефалоспориназы AmpС, класс В — ферменты ОХА, которые широко распространены в плазмидах Enterobacteriaceae. Класс В содержит, как уже упоминалось ранее, несколько бета-лактамаз, имеющих ион цинка [3].

Хромосомные бета-лактамазы присутствовали в бактериях изначально, еще до создания антибиотиков (АБ): они принимают участие в метаболизме микробной клетки, а также защищают бактерии от бета-лактамаз, вырабатываемых в природных условиях грибками. Однако в настоящее время основным фактором отбора штаммов — продуцентов бета-лактамаз является использование бета-лактамных АБ, которые способствуют искусственному отбору бактерий по следующим направлениям: 1) продуцирование большего количества бета-лактамаз; 2) наличие дополнительных бета-лактамаз, кодируемых плазмидами; 3) мутация имеющихся бета-лактамаз с расширением их спектра активности. Такой искусственный отбор благоприятствовал селекции целых видов или отдельных штаммов бактерий — продуцентов бета-лактамаз, причем процесс отбора с выработкой новых бета-лактамаз происходил параллельно созданию новых антибактериальных препаратов, целью которого являлось наличие устойчивости к бета-лактамазам. Преодоление данного механизма резистентности бактерий осуществлялось по двум направлениям: химическая модификация антибиотиков и комбинирование бета-лактамов с ингибиторами бета-лактамаз.

Первым возбудителем, приобретшим способность продуцировать бета-лактамазы, стали стафилококки: если в 1944 году бензилпенициллин был активен в отношении 95 % штаммов Staphylococcus aureus, всего 5 % штаммов вырабатывали бета-лактамазы и были к нему устойчивы, то через 5 лет удельный вес бета-лактамазопродуцирующих штаммов возрос до 50 %, а спустя годы — до 90 % за счет передачи генов и селекции устойчивых штаммов. Создание в 60-е годы XX века метициллина и оксациллина, устойчивых к стафилококковым бета-лактамазам и до сих пор сохраняющих свою клиническую эффективность в отношении метициллиночувствительных штаммов, может служить примером подхода, направленного на химическую модификацию АБ [6].

Впоследствии проблемы устойчивости к АБ, обусловленной продукцией бета-лактамаз, затронули в большей степени грамотрицательные палочки, что связано в значительной мере с разработкой новых АБ (табл. 2) [3]. Некоторые грамотрицательные бактерии имели природную устойчивость к бета-лактамам вследствие продукции большого количества хромосомных бета-лактамаз: Klebsiellа spp. устойчива к аминопенициллинам (ампициллин, амоксициллин) и карбоксипенициллинам (карбенициллин и тикарциллин). Однако по мере внедрения бета-лактамных АБ, активных в отношении грамотрицательной флоры, клиническое значение приобрели микроорганизмы, имеющие приобретенную устойчивость за счет синтеза индуцибельных бета-лактамаз класса А (P.vulgaris, C.diversus) и индуцибельных бета-лактамаз AmpC (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providencia spp., Serratia spp., Pseudomonas aeruginosa), что обеспечило им устойчивость к аминопенициллинам и цефалоспоринам I поколения. Наиболее клинически важным следствием применения бета-лактамов, активных в отношении грамотрицательной флоры, явилось распространение плазмидных бета-лактамаз, преимущественно ТЕМ-1, среди видов, исходно чувствительных к этим АБ. В настоящее время до 60 % штаммов Enterobacteriaceae продуцируют этот тип бета-лактамаз, частота которого превышает частоту всех остальных типов (ТЕМ-2, SHV-1, OXA-1) более чем в 10 раз. С середины 70-х годов бета-лактамаза ТЕМ-1 распространилась и на другие грамотрицательные палочки, псевдомонады и Vibrio cholerae . Этот тип фермента остается единственным представителем плазмидных бета-лактамаз у гонококков, обнаруживаясь у 1–40 % его штаммов. Этот же фермент продуцируют 2–40 % штаммов Haemophilus influenzae в зависимости от географического региона и капсулярного типа, причем его частота превышает частоту другого типа бета-лактамазы данного микроорганизма (ROB-1) в 10 раз. И только у псевдомонад и Moraxella catarrhalis ТЕМ-1 теряет свое первенство, уступая его PSE-1 и PSE-4 у псевдомонад и BRO-1, BRO-2 у М.сatarrhalis. В настоящее время свыше 80 % штаммов М.сatarrhalis продуцируют бета-лактамазы. Все вышеперечисленные бета-лактамазы (TEM-1, TEM-2, SHV-1, PSE-1, PSE-4, BRO-1, BRO-2) принадлежат к классу А, обеспечивая сходный уровень устойчивости к амино-, карбокси-, уреидо- и пиперазинпенициллинам, а также цефалоспоринам I поколения [7].

После создания новых поколений цефалоспоринов устойчивость к ним появилась у Enterobacte r spp., C.freundii, Serratia spp., M.morganii, P.aeruginosa вследствие усиленного синтеза (гиперпродукции) бета-лактамаз AmpC, причем частота таких штаммов в некоторых странах Европы достигает 70 %. Позднее этот фермент был выявлен у E.coli и Klebsiella spp.

В середине 80-х годов XX века были выявлены бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), большинство из которых появилось вследствие мутаций ферментов типа TEM-1, TEM-2, SHV-1. Чаще всего эти бета-лактамазы встречаются у Klebsiella spp. [8].

Карбапенемы обладают наибольшей среди всех бета-лактамов устойчивостью ко всем плазмидным бета-лактамазам классов А, С и D. Однако в настоящее время отмечается выработка новых бета-лактамаз, преимущественно класса С, способных инактивировать карбапенемы. Из них наибольшее значение имеют ферменты, вырабатываемые Stenotrophomonas maltophilia, и широкое использование карбапенемов может способствовать дальнейшей селекции этого штамма. Также опасения вызывает появление у Enterobacteriaceae, P.aeruginisa, Serratia marcescens, K.рneumoniae плазмидного фермента класса В (IMP-1), который обеспечивает устойчивость ко всем бета-лактамным антибиотикам, кроме монобактамов [9].

Наиболее эффективной стратегией, направленной на преодоление специфического механизма резистентности, обусловленного продукцией бета-лактамаз, в настоящий момент является использование ингибиторозащищенных бета-лактамов. Их широкий спектр активности обусловлен способностью ингибиторов инактивировать широкий круг бета-лактамаз, вырабатываемых грамположительными, грамотрицательными и анаэробными микроорганизмами.

И хотя они не являются надежным средством в отношении бета-лактамаз расширенного спектра, их применение вместо цефалоспоринов способствует снижению селекции продуцентов этого типа бета-лактамаз.

Ингибиторы бета-лактамаз представляют собой бета-лактамные структуры, которые необратимо связываются с ферментами, сами при этом разрушаясь, вследствие чего они получили название суицидных ингибиторов. В настоящее время клиническое значение имеют три таких ингибитора: клавулановая кислота (клавуланат) и два производных пенициллановой кислоты — сульбактам и тазобактам.

Все ингибиторы бета-лактамаз инактивируют большинство бета-лактамаз класса А, особенно хромосомные ферменты Bacteroides spp., C.diversus, Klebsiella spp., P.vulgaris, стафилококковые пенициллиназы, а также бета-лактамазы TEM и SHV — классические и расширенного спектра (табл. 3) [3]. Однако активность клавуланата и тазобактама в отношении ТЕМ-ферментов почти в 10 раз превосходит активность сульбактама. Клавуланат и производные пенициллановой кислоты также активны в отношении некоторых бета-лактамаз класса D, активность в отношении класса С у них низкая или отсутствует.

Клавуланат был первым ингибитором бета-лактамаз, получившим клиническое применение. Он высокоактивен в отношении бета-лактамаз класса А, особенно хромосомных бета-лактамаз Bacteroides spp., C.diversus, Klebsiella spp., P.vulgaris, P.mirabilis, Moraxella catarrharalis, стафилококковых пенициллиназ, а также бета-лактамаз TEM и SHV, которые часто вырабатываются представителями семейства Enterobacteriaceae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae. Хотя наблюдается рост устойчивости, обусловленной продукцией бета-лактамаз, большинство клинически значимых бета-лактамаз сохраняет свою чувствительность к клавуланату (табл. 2) [3].

Клавуланат также проявляет собственную антибактериальную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также анаэробов, причем механизм этой активности не связан с ингибированием бета-лактамаз (табл. 4) [10]. Наименьшую активность клавуланат проявляет в отношении Pseudomonas aeruinоsa и энтерококков, более выраженную — в отношении Enterobacteriaceae и H.influenzae, наибольшую — в отношении Bacteroides fragilis и других анаэробов, M.catarrhalis, стафилококков и стрептококков. Клавуланат также проявляет активность в отношении Neisseria spp. и демонстрирует хорошую активность в отношении таких атипичных бактерий, как Chlamydia spp. и Legionella spp. [10].

Активность клавуланата исследовалась в комбинации с другими антимикробными препаратами, включая тикарциллин и пенициллин, однако поскольку амоксициллин/клавуланат является наиболее часто применяемой комбинацией, большинство исследований изучало активность клавуланата именно в комбинации с амоксициллином.

С клинической точки зрения интерес представляет антипневмококковая активность амоксициллин/клавуланата, поскольку наблюдаемый в некоторых регионах рост резистентности Staphylococcus pneumoniae вызывает серьезные опасения. Исследования in vitro показали, что клавуланат может повышать антипневомококковую активность бета-лактамных антибиотиков благодаря дополнительному связыванию с ПСБ. Например, добавление клавуланата снижает минимальную подавляющую концентрацию (МПК) пенициллина на 1/3, а пенициллинустойчивые штаммы пневмококка в его присутствии изменяют форму и объем микробных клеток. Таким образом, дополнительное связывание с ПСБ придает амоксициллин/клавуланату более выраженную по сравнению с амоксициллином антипневмококковую активность [10].

Клавуланат также имеет высокую активность in vitro в отношении Legionella pneumophila, причем синергизм между клавауланатом и амоксициллином в отношении этого патогена обусловлен не столько бета-лактамазной активностью клавуланата (легионелла продуцирует бета-лактамазы с низкой активностью), сколько дополнительным связыванием клавуланата и амоксициллина с ПСБ. Благодаря более выраженной по сравнению с пенициллинами способности проникать внутрь клетки клавуланат значительно эффективнее амоксициллина действует на внутриклеточно расположенные Legionella pneumophila [10].

Клавуланат также обладает способностью значительно, на 70–80 %, уменьшать внутриклеточный пул Chlamydia trachomatis. Активность клавуланата в отношении атипичных возбудителей, выявленная in vitro , нашла свое подтверждение и in vivo на экспериментальных моделях пневмонии у мышей, вызванной Chlamydia trachomatis и Legionella pneumophila, причем при легионеллезной пневмонии активность амоксициллин/клавуланата была сопоставима с активностью эритромицина и доксициклина.

Также имеются данные о более высокой активности амоксициллин/клавуланата по сравнению с амоксициллином в отношении штаммов периодонтальной флоры (Actinobacillus actinomycetemcomitans и Enterococcus faecalis) и E.coli, не продуцирующих бета-лактамазы.

Клиническая эффективность антибиотика зависит не только от собственно антимикробных свойств препарата, но и от его взаимодействия с факторами иммунной защиты макроорганизма. Результаты исследований in vitro продемонстрировали усиление защитных свойств макроорганизма за счет повышения захвата микроорганизмов полиморфноядерными клетками и последующей гибели возбудителя, а также усиление хемотаксиса и адгезии полиморфноядерных клеток. Положительное влияние амоксициллин/клавуланата на иммунный ответ макроорганизма может оказывать положительное влияние и на клинический исход пневмококковых инфекций, при которых полиморфноядерные клетки являются первой линией защиты [10].

Положительным свойством клавуланата является независимость его эффективности от рН среды. Кроме того, амоксициллин/клавуланат (АМО/К) сочетает свойства ингибитора бета-лактамаз, хорошую биодоступность и широкий спектр антимикробной активности амоксициллина, что делает его на сегодняшний день единственным представителем ингибиторозащищенных пенициллинов, приемлемых для пероральной терапии. Наличие формы для парентерального введения делает его оптимальным препаратом среди всех ингибиторзащищенных пенициллинов для ступенчатой терапии.

1. Samaha-Kfoury J.N. , Araj G.F. Recent developments in -lactamases and extended spectrum β-lactamases // BMJ. — 2003. — 27. — 1209-1213.

3. Livermore D.M. β-Lactamase-mediated resistance and opportunity for its control // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. — 1998. — 41 (suppl. D). — 25-41.

4. Bush K., Jacoby G.A., Medeiros A.A. A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrobial Agents and С hemotherapy. — 1995. — 39. — 1211-33.

5. Richmond M.H., Sykes R.B. The β-lactamases of Gram-negative bacteria and their possible physiological role // Advances in Microbial Physiology. — 1973. — 9. — 31-88.

6. Lacey R.W. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus and streptococci // British Medical Bulletin. — 1984. — 40. — 77-83.

7. Livermore D.M. Do β-lactamases trap cephalosporins? // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. — 1985. — 15. — 511-4.

8. Jacoby G.A., Han P., Alvarez M., Tenover F. Survey of extended-spectrum-lactamase (ESBL) production in US clinical isolates // Program and Abstracts of the 35th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. — American Society for Microbiology, Washington, DC. — San Francisco, CA. — 1995. — Abstract C40. — P. 46.

9. Osano E., Arakawa Y., Wacharotayankun R., Ohta M., Horii T., Ito H. et al. Molecular characterization of an enterobacterial metallo- β-lactamase found in a clinical isolate of Serratia marcescens that shows imipenem resistance // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. — 1994. — 38. — 71-8.

При оценке чувствительности Staphylococcus spp. в первую очередь необходимо тестировать препараты, имеющие основное клиническое значение: бета-лактамы, макролиды, фторхинолоны, аминогликозиды и ванкомицин.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности Staphylococcus spp. (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 14.

Таблица 14.

Бета-лактамы

Препаратами выбора для лечения стафилококковых инфекций (вызванных как Staphylococcus aureus, так и коагулазанегативными стафилококками) являются бета-лактамные антибиотики, следовательно, в первую очередь необходимо определять чувствительность стафилококков к этим препаратам.

Устойчивость стафилококков к бета-лактамным АБП связана либо с продукцией бета-лактамаз, либо с наличием дополнительного пенициллино-связывающего белка - ПСБ2а. Выявление и дифференцировка этих двух механизмов резистентности позволяет надежно прогнозировать активность всех бета-лактамных антибиотиков без непосредственной оценки чувствительности к каждому из этих препаратов. При этом необходимо учитывать следующие закономерности:

• Штаммы Staphylococcus spp., лишенные механизмов резистентности, чувствительны ко всем бета-лактамным АБП.
• Бета-лактамазы (пенициллиназы) Staphylococcus spp. способны гидролизовать природные и полусинтетические пенициллины за исключением оксациллина и метициллина. Чувствительность или резистентность к бензилпенициллину является индикатором активности природных и полусинтетических амино-, карбокси- и уреидопенициллинов. Остальные бета-лактамы с потенциальной антистафилококковой активностью (антистафилококковые пенициллины, цефалоспорины I, II и IV поколений и карбапенемы) сохраняют активность в отношении бета-лактамазпродуцирующих штаммов.
• Штаммы Staphylococcus spp, обладающие ПСБ2а, клинически устойчивы ко всем бета-лактамным АБП. Маркером наличия ПСБ2а является устойчивость к оксациллину и метициллину. Такие штаммы исторически получили название метициллинорезистентных стафилококков (methicillin-resistant Staphylococcus spp -MRSS). Другими терминами для обозначения подобных штаммов являются MRSA - methicillin-resistant S.aureus и MRSE - methicillin-resistant S.epidermidis.
• Метициллин в настоящее время в клинической практике и в лабораторной диагностике не применяется, его практически полностью вытеснил оксациллин, соответственно появился термин "оксациллинорезистентность", являющийся полным синонимом термина "метициллинорезистентность".

Таким образом, определение чувствительности Staphylococcus spp. к бета-лактамным АБП должно включать выполнение двух тестов:

• Определения чувствительности к бензилпенициллину или выявления продукции бета-лактамаз (пенициллиназ).
• Определения чувствительности к оксациллину или выявления ПСБ2а или кодирующего его гена mecA.

Определение чувствительности к бензилпенициллину или выявление продукции бета-лактамаз (пенициллиназ)

Определение чувствительности Staphylococcus spp. к бензилпенициллину несколько затруднено тем фактом, что синтез бета-лактамаз у этого микроорганизма является индуцибельным процессом (продукция фермента усиливается после контакта с антибиотиком). В результате этого при использовании стандартных методов серийных разведений и ДДМ возможно получение результатов ложной чувствительности.

Решением данной проблемы может быть использование метода непосредственного выявления бета-лактамаз, основанного на использовании дисков с нитроцефином. Нитроцефин представляет собой хромогенный цефалоспорин, который легко гидролизуется под действием всех бета-лактамаз с образованием окрашенного продукта.

Для проведения исследования используют чашку, на которой оценивали чувствительноcть исследуемого штамма Staphylococcus spp. к пенициллину и/или оксациллину ДДМ. С границы зоны ингибиции роста вокруг диска с оксациллином бактериологической петлей забирается незначительное количество культуры и наносится на предварительно увлажненный диск с нитроцефином. Диск инкубируют при комнатной температуре до 1 ч.

Появление красного окрашивания свидетельствует о продукции бета-лактамаз исследуемым штаммом микроорганизма.

Штамм, продуцирующий бета-лактамазу, рассматривают как устойчивый к природным и полусинтетическим пенициллинам (за исключением оксациллина) независимо от конкретных результатов тестирования к перечисленным АБП.

При определении чувствительности к оксациллину стандартными методами необходимо учитывать некоторые особенности:

• для приготовления инокулюма используют только прямой метод суспендирования колоний;
• длительность инкубации до момента учета результатов определения чувствительности к оксациллину должна составлять не менее 24 ч.

• Необходимо использовать диски, содержащие 1 мкг оксациллина.
• При учете результатов необходимо обращать внимание даже на единичные мелкие колонии стафилококков, обнаруженные в пределах зоны подавления роста.

• В питательную среду целесообразно добавлять NaCl (до конечной концентрации 2 %).

• Штаммы стафилококков, резистентные к оксациллину, должны рассматриваться как устойчивые ко ВСЕМ бета-лактамным АБП.
• Результаты определения чувствительности стафилококков к оксациллину и к другим бета-лактамным АБП могут быть противоречивыми, при этом результаты определения чувствительности к оксациллину являются решающими.
• Определять чувствительность стафилококков к бета-лактамным АБП, кроме бензилпенициллина и оксациллина, нецелесообразно.
• Для метициллинорезистентных стафилококков характерно наличие ассоциированной резистентности к АБП других групп. Выявление у стафилококков множественной резистентности при чувствительности к оксациллину требует проведения повторных исследований.
• Следует обратить внимание на различия в критериях метициллинорезистентности для S.aureus и коагулазанегативных стафилококков.
• При получении сомнительных результатов необходимо использовать дополнительные методы (скрининг на агаре - метод приведен ниже, прямое выявление гена mecA или белка ПСБ2а).

• При выделении пенициллино- и метициллино-чувствительных штаммов стафилококков микроорганизм считается чувствительным ко всем бета-лактамным АБП, а препаратами выбора будут природные и аминопенициллины.
• При выявлении продукции бета-лактамаз и чувствительности к оксациллину микроорганизм является резистентным к природным пенициллинам, амино-, карбокси- и уреидопенициллинам, но чувствителен к оксациллину, ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам I - II поколений, которые являются препаратами выбора в данном случае. В отношении данных штаммов будут также активны цефалоспорины IV поколения и карбапенемы, однако преимуществами в сравнении с препаратами выбора они не обладают.
• При выявлении метициллинорезистентности штамм считается устойчивым ко ВСЕМ бета-лактамным антибиотикам, для лечения необходимо использовать препараты других групп, из которых препаратами выбора считаются гликопептиды.

Наиболее надежным методом выявления метициллинорезистентнсти у стафилококков является непосредственное определение наличия гена mecA молекулярно-генетическими методами (с помощью полимеразной цепной реакции - ПЦР). Кроме того, разработан коммерческий метод выявления дополнительного пенициллиносвязывающего белка - ПСБ2а в реакции агглютинации.

В то же время скрининг на агаре для выявления метициллинорезистентности является высоко чувствительным и специфичным методом, легко выполнимым в условиях рутинной работы микробиологической лаборатории, однако он может быть использован только для штаммов S.aureus.

Для проведения скрининга готовят чашки с агаром Мюллера-Хинтон, содержащие 4 % NaCl и 6,0 мкг/мл оксациллина. Хлористый натрий вносят в питательную среду в необходимом количестве до автоклавирования. Рабочий раствор оксациллина добавляют в питательную среду после автоклавирования и охлаждения среды до 45 - 50 °С. Для приготовления рабочего раствора оксациллина используют субстанцию АБП с известной активностью.

Микробную взвесь следует готовить только методом прямого суспендирования из нескольких однотипных изолированных колоний стафилококка, выросших на чашке с неселективным питательным агаром, в стерильном физиологическом растворе и доводить до мутности 0,5 по Мак-Фарланду (1,5 x 10 8 КОЕ/мл).

Для инокуляции чашек с агаром можно использовать два метода: с помощью микропипетки или с помощью стерильного ватного тампона.

• готовят разведение 1:100 стандартного инокулюма, соответствующего стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду, для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5 x 10 6 КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физиологического раствора);
• с помощью микропипетки наносят каплю (10 мкл) разведенной стандартной суспензии на поверхность агара с оксациллином.

• стерильный ватный тампон погружают в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по Мак-Фарланду), затем отжимают избыток влаги о стенку пробирки;
• культуру наносят тампоном либо на ограниченную поверхность (диаметром 10 - 15 мм), либо на всю поверхность агара с оксациллином в чашке Петри.

Штаммы S.aureus инкубируются при температуре 35 °С в течение полных 24 ч, а коагулазанегативных стафилококков - в течение 48 ч.

После инкубации чашки тщательно просматривают в проходящем свете:

• появление видимого роста более 1 колонии или вуалеобразного роста на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину (метициллину);
• при отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый штамм учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину).
• при сомнительных результатах, а также для штаммов, выделенных у больных с клинически неэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecA.

• Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллера-Хинтон с 4 % NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
• Параллельно с исследуемыми тестируют также контрольные штаммы: S.aureus ATCC 38591 - резистентный; S.aureus ATCC 29213 - чувствительный.

Макролиды и линкозамиды являются альтернативными препаратами для лечения стафилококковых инфекций. В исследование необходимо включать:

• Одного из представителей 14-ти и 15-членных макролидов. Полная перекрестная резистентность между отдельными представителями.
• Клиндамицин. Полная перекрестная резистентность между 16-членными макролидами и линкозамидами.

Приведенный выбор препаратов определяется закономерностями перекрестной резистентности между антибиотиками указанных подгрупп.

В последнее время отмечается повышение интереса к фторхинолонам как к препаратам для лечения стафилококковых инфекций (особенно кожи и мягких тканей). Новые представители этой группы АБП (антипневмококковые фторхинолоны - левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и др.) обладают повышенной активностью в отношении Staphylococcus spp. в сравнении с традиционными препаратами. Между перечисленными подгруппами препаратов нет полной перекрестной резистентности. Антипневмококковые препараты часто сохраняют активность в отношении штаммов, устойчивых к другим фторхинолонам.

На практике необходимо учитывать некоторые особенности интерпретации результатов, полученных in vitro. Так, при детекции устойчивости к гентамицину выделенный штамм следует рассматривать как устойчивый ко всем аминогликозидам. В этой связи гентамицин должен включаться в набор для тестирования в обязательном порядке. В тоже время крайне редко могут встречаться штаммы, устойчивые к другим аминогликозидам при чувствительности к гентамицину.

Ванкомицин является одним из препаратов выбора (наряду с оксазолидинонами) для лечения инфекций, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами. Появление сообщений об устойчивости стафилококков к гликопептидам требует внимательного отношения к оценке результатов исследования.

Оксазолидиноны являются важным достижением в лечении инфекций, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами, в том числе и устойчивыми к гликопептидам. В то же время, необходимо иметь ввиду, что уже известно о формировании устойчивости к антибиотикам этой группы.

• Ко-тримоксазол.
• Хлорамфеникол.
• Фузидиевая кислота.
• Тетрациклины.
• Рифампицин.

Значение перечисленных препаратов в лечении стафилококковых инфекций, вызванных метициллинчувствительными штаммами, невелико, так как они уступают по активности бета-лактамам. Их клиническая эффективность при инфекциях, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами, изучена недостаточно.

Рифампицин, ко-тримоксазол и фузидиевую кислоту нельзя рекомендовать как средство монотерапии из-за высокой частоты селекции резистентности в процессе лечения.

Формировать конкретный набор антибиотиков для оценки антибиотикочувствительности стафилококков наиболее целесообразно на основании данных о частоте распространения в стационаре метициллинрезистентности. При отсутствии или низкой частоте метициллинрезистентности вполне достаточно ограничиться оценкой чувствительности к оксациллину (в плане надзора), макролидам и, возможно, еще к 1 - 2 препаратам, реально применяемым в конкретном стационаре для лечения стафилококковых инфекций. В случае же высокой частоты распространения метициллинрезистентности в исследование необходимо включать достаточно широкий круг антибиотиков.