Статистика по газовой гангрене

Несмотря на то, что антибиотики сегодня легко доступны, а в операционных для обеспечения асептики применяются новейшие средства, от гангрены избавиться пока не удается. Газовая гангрена – инфекция, вызванная анаэробными бактериями рода Clostridium. Эти микроорганизмы не нуждаются в кислороде и попадают в организм человека через раны. От газовой гангрены чаще всего страдают конечности – руки и ноги, но возможно и поражение живота, и даже матки.

Развивается газовая гангрена очень быстро. У страдающего гангреной обычно наблюдается снижение артериального давления, тахикардия, повышение температуры (до 38-39°), учащенное дыхание, обезвоживание, бессонница, подавленное состояние или наоборот сильное возбуждение, анемия. Есть и местные симптомы – сильные боли в ране, отек вокруг нее, изменение цвета кожи вокруг раны, волдыри. Через некоторое время появляются участки некроза, трупный запах, сгустки крови. Существует 4 формы заболевания:

Классическая газовая гангрена. При этой форме ткань в области повреждения отекает, постепенно мертвеет. Весь процесс сопровождается интенсивным газообразованием. Кожа вокруг раны бледная, с бурыми пятнами, гноя нет. Через несколько часов поврежденные ткани становятся серо-зелеными и приобретают трупный запах.
Отечно-токсическая форма. Эта форма сопровождается отеком, который довольно быстро распространяется на здоровые ткани. Газообразование при отечно-токсической форме слабое, гноя нет. Некроз мышц начинается практически сразу после травмы.
Флегмозная форма. Симптомы гангрены в этом случае выражены слабо. При этой форме поражается небольшой участок, отеков нет, пятен на коже нет, зато процесс сопровождается выделением гноя и сильным газообразованием.
Гнилостная форма развивается очень быстро. Процесс сопровождается бурным газообразованием и выделением гноя. Эта форма гангрены чаще всего локализуется в области средостения и прямой кишки. Быстрое развитие гангрены в этом случае происходит из-за симбиоза аэробных и гнилостных бактерий. При этом гнилостные бактерии выделяют токсин, разрушающий белки тканей и стенок сосудов. Из-за этого для гнилостной формы гангрены характерны кровотечения.

Также существуют и специфические симптомы:

Симптом Краузе – скопления газа на рентгенограмме располагаются в виде елочек
Симптом Мельникова – пораженный участок так сильно отекает, что уже через 15-20 минут после наложения лигатуры нить очень сильно впивается в кожу.
Симптом шпателя – при постукивании по пораженному месту металлическим шпателем раздается похрустывание.
Симптом пробки шампанского – при вытаскивании из раны ватного тампона можно услышать негромкий хлопок, напоминающий открытие бутылки шампанского.

Бактерии Clostridium perfringens, Cl. septicum, Cl. oedematiens и Cl. Histolitycum в норме присутствуют в кишечнике и мочеполовой системе человека. Кроме того, обитают они и в почве. В раны эти микроорганизмы попадают во время операций и в результате травм. Питаются они омертвевшими тканями, находящимися в ране, в процессе жизнедеятельности выделяют токсины и газ.

Благоприятные условия для развития гангрены – рваные, рвано-ушибленные, огнестрельные раны, загрязненные землей, кусками ткани. Чем больше разрушены мышцы, тем лучше в ране приживаются клостридии. А вот от размера зависит не так уж и много, осложниться анаэробной инфекцией может даже очень маленькая рана.

Симптомы развиваются примерно через 6 часов после заражения. У человека резко ухудшается состояние, настолько, что может наступить шок. Пораженные мышцы напоминают по виду вареное мясо и источают сладковато-гнилостный запах.

Диагноз ставится на основании характерной клинической картины раны. Также нужно учитывать, были ли у пациента в недавнем прошлом операции. Анализ крови показывает наличие инфекции, рентгенограмма – наличие газа в ране, микроскопический анализ отделяемого из раны – наличие клостридий.

Дифференциальный диагноз проводят с фасциальной газообразующей флегмоной, при которой, в отличие от гангрены, не поражаются мышцы.

Если лечение начато несвоевременно, то болезнь приводит к летальному исходу в течение 2-3 суток. Хотя бывает и мгновенная газовая гангрена, в результате которой смерть наступает быстрее. В этом случае спасти жизнь может только немедленное оперативное вмешательство.

Профилактика газовой гангрены заключается в своевременной хирургической помощи и тщательной обработке ран.

Страдающие газовой гангреной должны быть изолированы, для них необходимо организовать отдельный сестринский пост. Все белье и инструменты должно быть тщательно стерилизовано. Медперсонал отделения должен соблюдать личную гигиену, все процедуры должны проводиться в резиновых перчатках.

Потеря руки или ноги всегда тяжело переносится человеком как в психологическом, так и в физическом плане. Даже при длительном хроническом заболевании решение врача об ампутации часто становится шоком и для самого пациента, и для его родственников. Но даже в этом случае не стоит отчаиваться. Тысячи и миллионы людей ведут активную полноценную жизнь после ампутации. Они так же работают, любят, воспитывают детей и наслаждаются каждым новым днем.

Причины и показания к ампутации конечностей

Операцию по удалению конечности назначают при непосредственной угрозе для жизни пациента, когда все остальные методы лечения не дали результата.

К абсолютным показаниям для проведения ампутации относят:

травматические ампутации конечностей — полный или частичный отрыв конечности в результате травмы;
гангрена (отмирание) конечности из-за инфекции, обморожения, ожога, электротравмы, сосудистых заболеваний или диабета;
сочетание повреждения кости, крупных сосудов и нервов, мягких тканей на значительном протяжении.

Относительные показания, при которых вопрос об ампутации решают индивидуально, с учетом состояния пациента:

острая раневая инфекция — остеомиелит, тяжелая флегмона, тяжелый гнойный артрит;
злокачественные новообразования;
обширные трофические язвы, не поддающиеся лечению;
деформация конечности, паралич, врожденный порок развития;
сложная обширная травма конечности при неэффективности реконструктивной операции.

Наиболее частой причиной ампутации, помимо травм, становятся заболевания сосудов, которые приводят к ишемии и гангрене, осложнения сахарного диабета (трофические язвы и гангрена).

Например, атеросклероз сосудов нижних конечностей в 38–65% случаев приводит к критическому нарушению кровообращения (критической ишемии). В течение первого же года с момента установления диагноза критической ишемии у 25–50% пациентов развивается влажная гангрена, которая приводит к ампутации нижней конечности.

Не лучше и ситуация с сахарным диабетом. От 50 до 70% всех ампутаций в мире вызваны именно осложнениями этого заболевания: из-за нарушения кровообращения возникают незаживающие трофические язвы и гангрена. При сахарном диабете ампутация конечностей проводится в 10–20 случаях из тысячи.

Ампутация состоит из нескольких этапов.

На первом этапе консилиум врачей определяет уровень ампутации нижней или верхней конечности с учетом состояния пациента; берут согласие на операцию.
Второй этап — уже в операционной. Пациенту дают наркоз, хирург начинает операцию, разрезают мягкие ткани. Сосуды перевязывают, нервные окончания обрабатывают так, чтобы они не попали в рубцовые спайки. Затем врач отсекает кость. Существует несколько методов обработки костного спила, которые позволяют предотвратить осложнения.
На последнем этапе сформированная из мягких тканей культя закрывается кожными лоскутами. При этом рубец не должен находиться на опорной поверхности, которая будет испытывать основную нагрузку от протеза.

Реабилитация после ампутации конечностей не входит в этапы проведения операции, но является важным условием возвращения человека к нормальной жизни.

Уровень ампутации нижней и верхней конечности определяется индивидуально, с учетом объема здоровых тканей, таким образом, чтобы максимально сохранить функцию конечности, создать культю, пригодную к протезированию, предотвратить развитие фантомных болей и других осложнений.

В зависимости от того, как и когда будет реализован каждый из перечисленных этапов, в медицинской практике выделяют виды ампутации.

По количеству операций:

первичная;
вторичная (реампутация).

По способу рассечения мягких тканей:

Круговая. Кожа и мягкие ткани рассекаются перпендикулярно кости. Применяется редко, так как не позволяет создать полноценную культю. Используется при газовой гангрене, анаэробных инфекциях, при необходимости срочного проведения операции.
Ампутация лоскутным способом (одно- и двухлоскутным). Применяется чаще всего. Этот способ позволяет создать нормально функционирующую и пригодную для протезирования культю.
Ситуативный способ применяют при сложных травматических повреждениях в случае первичной ампутации.

По способу обработки костной культи:

Надкостничный , при котором опил закрывается надкостницей.
Безнадкостничный , когда надкостница удаляется с края культи.
Костно-пластический способ , при котором опил кости закрывают фрагментом кости пациента. Это позволяет создать крепкую опорную поверхность культи.

По способу укрытия культи:

Фасциопластический метод. Наиболее приемлем при ампутации верхних конечностей. В состав лоскута включена фасция пациента, подкожная клетчатка и кожа. Дает возможность точно смоделировать форму культи.
Миопластический метод. В данном случае над опилом кости сшивают мышцы-антагонисты. Такой способ усложняет протезирование, так как сшитые мышцы перерождаются в рубцовую ткань.
Периопластический метод. В состав лоскута включают надкостницу. В основном применяют при операциях у детей и подростков, так как способ дает возможность синостизирования костей голени в единый блок.
Костно-пластический метод ампутации был предложен Н.И. Пироговым еще в 1852 году и до сих пор является непревзойденным по своим результатам. В состав лоскута входит фрагмент кости, покрытый надкостницей. Этот способ — лучший для создания опорной культи при ампутации нижней конечности.

Если ампутация проведена правильно, выбран адекватный уровень удаления конечности, осуществлена профилактика инфекции, серьезных осложнений возникнуть не должно. Однако существуют последствия ампутации конечностей, с которыми приходится справляться многим пациентам.

Болевой синдром. В первые дни после ампутации пациент испытывает боль в оперированной конечности. Тупая и тянущая боль сопровождает любую хирургическую операцию и возникает из-за повреждения мягких тканей. Через несколько дней боль притупляется.
Отек — это нормальная реакция организма на оперативное вмешательство, повреждение, чужеродный материал (нити, скобы). Обычно отек сохраняется в течение первых недель после операции.
Фантомные явления — тоже нормальная ситуация. Некоторое время после удаления конечности пациент может чувствовать ее. Фантомные боли могут появиться через несколько недель, месяцев и даже лет. Они могут возникать от прикосновений, изменения температуры или давления. Считается, что боли возникают из-за раздражения отсеченных нервных окончаний, образования невром, вовлечения нервов в рубцовый процесс.
Контрактура — ограничение движения в суставе. Контрактура может быть вызвана нарушением техники операции, травмой сустава или действиями самого пациента. Длительная иммобилизация культи, отказ от активности могут привести к развитию контрактуры и дальнейшей невозможности протезирования.

Каждый день врач и медицинская сестра осматривают швы, проводят их обработку и снова забинтовывают оперированную конечность. Примерно через 5–7 дней убирают гипсовую повязку. В этот момент рубец на конечности еще очень нежный и тонкий.

После заживления рубца на культю надевают специальный компрессионный чехол. Это позволяет придать конечности нужную для протезирования форму.

Примерно через 12–15 дней пациента выписывают. Дома нужно каждый день осматривать культю на наличие воспаления или раздражения, проводить гигиенические процедуры. Следует создать для пациента доступную среду: убрать пороги и торчащие провода, о которые можно споткнуться, установить в ванной и санузлах поручни.

Примерно через 30–40 дней опасности инфекционных осложнений больше нет и можно сосредоточиться на реабилитации после ампутации конечности и освоении протеза.

В задачи реабилитации входит:

подготовка культи к протезированию;
подгонка протеза под индивидуальные параметры человека;
обучение жизни с протезом, возвращение человека к трудовой деятельности, создание условий для активного участия в социальной жизни.

Это может звучать парадоксально, но именно ампутация для многих становится началом новой активной жизни, новой карьеры, помогает найти свое призвание, встретить единомышленников и друзей. Стоит только посмотреть на паралимпийцев: людей, которые вовсе не считают отсутствие конечности своим физическим недостатком.

Реабилитацию после ампутации нижней и верхней конечности можно разделить на несколько общих этапов:

Оценка состояния культи. Для использования протеза культя должна быть хорошо сформирована, иметь правильную форму.
Подбор протеза. Подбор первого временного протеза можно начинать примерно через 6–8 недель после ампутации.
Обучение жизни с протезом. Первые дни пользоваться протезом может быть очень сложно и даже больно. Но нельзя забрасывать тренировки. Через несколько дней проходит боль, появляются навыки пользования протезом.
Тренировка самообслуживания. После ампутации важная цель для человека — восстановить навыки ухода за собой, не чувствовать себя беспомощным. Начать стоит с малого — научиться ходить по квартире с поддержкой, затем пробовать заняться привычными делами, гигиеническими процедурами и т.д.
Адаптация окружающей среды. Как уже упоминалось, нужно создать больному доступную среду: положить необходимые вещи так, чтобы не нужно было тянуться к ним, установить опоры и поручни в квартире.
Работа с психологом. Часто после такой тяжелой (и в психологическом плане — тоже) операции человек замыкается в себе, считает себя неполноценным, теряет смысл жизни. Работа с психологом поможет вернуть веру в себя, восстановить мотивацию, увидеть новые возможности и вернуться к активной социальной жизни.
Работа на тренажерах. Для восстановления тонуса мышц, обучения работе с протезом и восстановления навыков ходьбы используются тренажеры, работающие по принципу биологической обратной связи (БОС). Система поддержки тела, такая как Vector, позволяет быстро восстановить конечности после ампутации.
Физиотерапевтические процедуры позволяют улучшить кровообращение, восстановить тонус мышц культи, снять боль, уменьшить отек.

Государственные и частные реабилитационные центры предлагают комплексные программы для восстановления функции утраченной конечности и для психологической реабилитации. Нужно помнить, что ампутация — это не конец жизни, а лишь ее новый этап. И насколько полной и активной будет жизнь после операции, зависит не только от усилий врачей, но и от самого пациента.

Более чем у половины пациентов после ампутации конечности наблюдаются депрессивные состояния: у 52% — легкие, у 8% — тяжелые (по шкале депрессии Гамильтона). Это еще раз подчеркивает, насколько важны для больного посещение психолога или психотерапевта, а также переоценка межличностных отношений с близкими. В восстановительных центрах должны вести работу не только с пациентами, но и с их родными, обучая последних уходу за больным и умению поддержать человека в трудном положении.

Что необходимо знать об одном из самых коварных и опасных заболеваний

Столбняк — коварная, полузабытая, неистребимая и необычная болезнь. Благодаря десятилетиям успешной вакцинопрофилактики мы очень редко слышим о столбняке. Это что-то очень страшное, но вроде бы из другой жизни. Разбив молотком палец в кровь, мы обычно не задумываемся, защитит ли нас от столбняка последняя школьная прививка, сделанная 10 лет назад. Давайте разберемся, насколько серьезна проблема этого инфекционного заболевания.

В 2015 году, согласно оценкам, около 209000 человек заболели и более 56000 заболевших умерли от столбняка. Бремя болезни распределено неравномерно: подавляющее количество случаев заболевания и смерти приходится на Африку к югу от Сахары, Южную и Юго-Восточную Азию.

В России с 2002 по 2012 год столбняком заболели 213 человек (8-35 в год), 70 случаев — с летальным исходом. Согласно Росстату, в 2014 году от него умерли четыре жителя страны, в 2017-м — два.

Симптомы столбняка страшны и узнаваемы. Казалось бы, каждый случай должен регистрироваться и попадать в статистику. Но эпидемиологи считают, что в мире учитывается лишь около 10 процентов реальной заболеваемости, даже в США CDC знает примерно о половине случаев. То есть о масштабе проблемы мы знаем приблизительно.

Глобальная заболеваемость столбняком (голубые столбцы) и охват вакцинации АКДС по совокупным национальным оценкам (синий график) и оценкам ВОЗ (красный график), 1980-2017

Без лечения столбняк приводит к смерти почти всегда. Современная терапия снижает летальность до 15-20 процентов, но в развивающихся странах этот показатель может переваливать за 50 процентов. По данным, приведенным выше, можно подсчитать, что в России в указанные годы умирал каждый третий заболевший.

Неонатальный столбняк (19937 смертей в 2015 году) элиминирован в десятках стран, включая Россию.

Инкубационный период 3–21 дня (в среднем 8 дней).
Ранние признаки: боль в ране, спазм жевательных мышц (тризм), нарушение глотания (дисфагия), ригидность мышц шеи.
Основные симптомы: Ригидность мышц и спазмы распространяются нисходяще от жевательных к мышцам конечностей. Спазмы нарастают постепенно, могут приводить к остановке дыхания, переломам костей, вывихам, рабдомиолизу. Спазм гортани может вызвать асфиксию. Повышенная чувствительность к звуку и свету.
Опистотонус — характерная поза с резким выгибанием спины, запрокидыванием головы, вытягиванием ног и сгибанием рук.
Сардоническая улыбка (risus sardonicus) — судорожное сокращение мимических мышц с оттягиванием углов рта вниз и назад. Брови и крылья носа приподняты.
Другие симптомы: лихорадка, потливость, повышенное артериальное давление, тахикардия.
Основные причины смерти — асфиксия, остановка сердца.

• Генерализованный столбняк, наиболее распространенная форма.
• Локализованный столбняк развивается гораздо реже, обычно поражает конечность с зараженной раной.
• Цефалический столбняк — редкая форма, обычно связана с повреждениями головы или инфекций среднего уха. Прогноз обычно плохой.
• Неонатальный столбняк (столбняк новорожденных, пупочный). Эта генерализованная форма развивается при заражении пуповины C.tetani. Смертность достигает 70 процентов.

Столбнячная палочка (Clostridium tetani), являющаяся возбудителем столбняка, — грамположительная бактерия, анаэроб. В присутствии воздуха она образует споры, устойчивые ко многим антисептикам и кипячению. Ее вегетативная форма имеет вид палочки со жгутиками, а споры напоминают по форме теннисные ракетки.

C.tetani обнаруживают в фекалиях 10-20 процентов лошадей, 25-30 процентов собак и морских свинок, а также в кишечнике овец, коров и мелких млекопитающих. У людей в разных исследованиях частота носительства столбнячной палочки в кишечнике составляла от 0 до 40 процентов.

Вегетативная форма бактерии вырабатывает два экзотоксина:

C.tetani принадлежит к семейству, включающему в себя образцовых производителей токсинов чудовищной силы. Ее родственниками являются возбудители ботулизма (C. Botulinum), газовой гангрены (C.Perfringens) и псевдомембранозного колита (C. Difficile). Ботулотоксин — самый мощный биологический яд, тетаноспазмин — второй по силе.

Человек не может заражаться столбняком от других людей и животных. Бактерия попадает в организм через раны и другие повреждения из почвы, прямо или опосредованно. Массовая, не спорадическая, заболеваемость связана с войнами и катастрофами.

В 1913 году Journal of the American Mediсal Assoсiation сообщил, что количество смертей от столбняка после фейерверков на День независимости сократилось со 102 случаев на 1000 повреждений до трех на 1000 благодаря использованию противостолбнячной сыворотки при повреждениях (источник). Однако тогда его применение не было рутиной в армиях, участвовавших в Первой мировой войне, что привело к огромной заболеваемости в первые месяцы боевых действий.

В немецких госпиталях с 1 августа по 31 октября 1914 года столбняк развился у 1744 из 27677 раненных солдат, летальность доходила до 100 процентов. С нормализацией поставок сыворотки этот показатель упал до одного случая на 1000 раненных. Наблюдения, сделанные врачами на той войне, дали доказательную базу для улучшения лечения столбняка.

US Army Medical Department, Office of Medical History / British Medical Journal.

Перед Второй мировой войной в некоторых регионах уже практиковалась иммунизация против столбняка. Ее преимущества были наглядными. В американские госпитали в течение войны попали 2,7 миллиона человек с ранениями и повреждениями, только у 12 из них развился столбняк, пять из них умерли. В то же время, при освобождении Манилы в 1945 году 473 человека, или четыре процента из примерно 12000 пострадавших гражданских, заболели столбняком.

Споры столбняка попадают в организм через повреждения кожи различного характера. Особую опасность представляют колотые раны, поскольку в них проще создаются анаэробные условия. Это способствовало появлению мифа, что столбняк вызывается уколом непременно ржавым гвоздем. Опасны любые раны, загрязненные землей. Однако важно знать, что около половины травм, приводящих к столбняку, люди получают в помещении.

Заражение может происходить при укусах животных, ожогах, открытых переломах, занозах, язвах на коже, хроническом дерматите, при автомобильных катастрофах, внебольничных абортах, гангрене, карбункулах и так далее.

Далеко не каждое повреждение вызывает опасение и побуждает людей обратиться за медицинской помощью. Исследование заболеваемости столбняком во Вьетнаме показало, показало, что примерно в 20 процентах случаев ворота инфекции определить не получается: по всей видимости, болезнь может развиться даже после несущественных повреждений.

Тетаноспазмин проникает в длинные отростки двигательных нейронов и поднимается к спинному мозгу. Это занимает 2-14 дней, в это время болезнь себя не обнаруживает. В спинном мозге токсин поражает тормозные нейроны: он расщепляет белок синаптобревин, который помогает везикулам с нейромедиаторами (ГАМК и глицином) выходить в синаптическую щель. Двигательные нейроны остаются без тормозного влияния, что приводит к спазму и ригидности мышц. Ослабляется тормозное действие на автономную нервную систему, что обусловливает, кроме прочего, повышенную чувствительность к свету и шуму.

Механизм действия столбнячного токсина: 1) связывание тетаноспазмина с альфа-мотонейроном в нервно-мышечном синапсе, его проникновение в нейрон; 2) ретроградный аксонный транспорт; 3) проникновение токсина в тормозной нейрон (обратный захват везикулы); 4) токсин не дает везикулам с тормозными медиаторами открыться в полость синапса.

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Сыворотка противогангренозная ФС.3.3.1.0041.15

поливалентная лошадиная Взамен ГФ Х, ст.610,

ФС 42-3616-98

Настоящая фармакопейная статья распространяется на сыворотку противогангренозную поливалентную лошадиную, представляющую собой иммуноглобулиновую фракцию сыворотки крови лошадей, содержащую специфические антитела, нейтрализующие токсины возбудителей газовой гангрены рода Clostridium (C. perfringens типа A, C. novyi и C. septicum).

Cыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная предназначена для экстренной профилактики и лечения газовой гангрены.

ПРОИЗВОДСТВО

Производство сыворотки противогангренозной поливалентной лошадиной должно быть валидировано с целью подтверждения установленных требований, гарантирующих ее качество и безопасность применения.

Сыворотку получают из плазмы лошадей, гипериммунизированных гангренозными токсинами/анатоксинами. Для получения очищенной концентрированной иммуноглобулиновой фракции плазмы лошади, содержащей антитела (антитоксины), нейтрализующие гангренозные экзотоксины, применяют методы солевого фракционирования, ферментолиза и мембранной фильтрации.

ИСПЫТАНИЯ

Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость с желтоватым оттенком, без осадка. Определение проводят визуально.

Показатель оптической плотности не должен превышать 0,05. Определение проводят фотометрическим методом при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 3 мм против контрольного раствора – воды очищенной, если нет других указаний в нормативной документации.

Показатель оптической плотности не должен превышать 0,15. Определение проводят фотометрическим методом при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 3 мм против контрольного раствора – воды очищенной, если нет других указаний в нормативной документации.

Не менее 700 международных единиц (МЕ) каждого типа гангренозных антитоксинов в 1 мл. Специфическую активность сыворотки по каждому типу гангренозных антитоксинов определяют в тесте нейтрализации соответствующих токсинов.

Определение опытных доз гангренозных токсинов. Опытная доза токсина (L+/) представляет собой наименьшее количество токсина, которое в смеси с определенным количеством соответствующего антитоксина при внутривенном введении белым мышам вызывает гибель не менее 50 % животных.

Опытную дозу токсина C. perfringens (L+_/10) определяют по отношению к 0,1 МЕ антитоксина С. perfringens, токсина C. septicum (L+_/5) – по отношению к 0,2 МЕ антитоксина С. septicum, токсина C. novyi (L+_/50) – по отношению к 0,02 МЕ антитоксина C. novyi.

Для определения опытных доз для каждого из гангренозных токсинов готовят не менее 4 последовательных разведений, отличающихся между собой по содержанию токсина на 10 – 20 %. К 0,1 МЕ референс-препарата (или стандартного образца активности) антитоксина С. perfringens, или 0,2 МЕ референс-препарата (или стандартного образца активности) антитоксина С. septicum, или 0,02 МЕ референс-препарата (или стандартного образца активности) антитоксина C. novyi, взятых в объеме 0,2 мл, добавляют подготовленные разведения токсинов в объеме 0,3 мл. Смеси готовят из расчета на 5 мышей (1 мл стандартного образца активности антитоксина и 1,5 мл токсина).

Полученные смеси перемешивают и выдерживают при температуре от 18 до 22 °С в течение (45 ± 1) мин, затем каждую вводят по 0,5 мл внутривенно 4 белым мышам.

При определении опытной дозы токсинов C. perfringens и C. septicum наблюдают за животными в течение 48 ч, а при определении опытной дозы токсина C. novyi – в течение 96 ч, отмечая количество выживших мышей в каждой группе.

Определение специфической активности (титра) сыворотки противогангренозной С. perfringens. Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки в 0,9 % растворе натрия хлорида с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, 0,1 МЕ содержалось в 0,2 мл раствора. К 1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина C. perfringens, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6 – 8 разведениями сыворотки (например, 1:1300; 1:1400; 1:1500 и т.д.), отличающимися по своей предполагаемой активности одно от другого на 10 – 20 %.

Каждый опыт титрования (приготовления разведений испытуемой сыворотки) сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,1 МЕ стандартного образца активности антитоксина С. perfringens. После выдерживания при температуре от 18 до 22 °С в течение (45 ± 1) мин смесь из каждой пробирки вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 48 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50 % взятых в опыт мышей. Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 100 % мышей в данной группе, содержит 0,1 МЕ в 0,2 мл, т.е. 0,5 МЕ в 1 мл.

Титр антитоксина С. perfringens в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если максимальное разведение сыворотки, защищающее от гибели 100 % мышей, соответствует 1:1300, то 1 мл этого разведения содержит 0,5 МЕ антитоксина С. perfringens, следовательно, 1 мл испытуемой сыворотки содержит 0,5 МЕ 1300 = 650 МЕ антитоксина С. perfringens.

Определение титра антитоксина С. septicum. Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки в 0,9 % растворе натрия хлорида с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, в 0,2 мл разведенной сыворотки содержалось 0,2 МЕ. К 1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина C. septicum, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6 – 8 разведениями сыворотки (например, 1:650; 1:700; 1:750 и т.д.), отличающимися по своей предполагаемой активности одно от другого на 10 – 20 %.

Каждый опыт титрования испытуемой сыворотки сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,2 МЕ стандартного образца активности антитоксина С. septicum. После выдерживания при температуре от 18 до 22 °С в течение (45 ± 1) мин смесь токсина с каждым разведением сыворотки вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 48 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50 % взятых в опыт мышей. Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 100 % мышей в группе, содержит 0,2 МЕ в 0,2 мл, т.е. 1 МЕ в 1 мл. Титр антитоксина С. septicum в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если максимальное разведение сыворотки, защищающее от гибели 100 % мышей, соответствует 1:700, то 1 мл этого разведения содержит 1 МЕ, следовательно, 1 мл неразведенной сыворотки содержит 1 МЕ 700 = 700 МЕ антитоксина С. septicum.

Определение титра антитоксина С. novyi. Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки в 0,9 % растворе натрия хлорида с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, 0,02 МЕ содержались в 0,2 мл раствора. К 1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6 – 8 разведениями сыворотки (например, 1:6500; 1:7000; 1:7500 и т.д.), отличающимися по предполагаемой активности одно от другого на 10 – 20 %. Каждый опыт титрования сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,02 МЕ стандартного образца активности антитоксина С. novyi. После инкубирования при температуре от 18 до 22 °С в течение (45 ± 1) мин каждую смесь вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 96 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50 % взятых в опыт мышей.

Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 100 % взятых в опыт белых мышей, содержит 0,02 МЕ в 0,2 мл, т.е. 0,1 МЕ в 1 мл. Титр антитоксина С. novyi в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если максимальное разведение сыворотки, защищающее от гибели 100 % мышей, соответствует 1:8000, то в 1 мл этого разведения содержится 0,1 МЕ антитоксина С. novyi. Следовательно, 1 мл неразведенной сыворотки содержит 0,1 МЕ 8000 = 800 МЕ антитоксина С. novyi.

Активность каждого компонента поливалентной сыворотки рассчитывают, исходя из разведения с наименьшей концентрацией сыворотки, которое в смеси с опытной дозой токсина обеспечивает 100 % выживаемость взятых в опыт животных.

Специфическую активность (титр) поливалентной сыворотки выражают по компоненту с наименьшей активностью. В данном примере – по антитоксину С. perfringens.

Не менее 500 МЕ на 0,1 г белка каждого типа антитоксина C. perfringens, С. novyi, C. septicum.

Удельную активность (Х) рассчитывают по формуле:

Т – титр сыворотки, МЕ/мл;

С – концентрация белка, г/мл;

10 – постоянный коэффициент

Не более 0,025 %. Определение проводят колориметрическим методом. К 5 мл испытуемого образца и 5 мл рабочего эталонного раствора прибавляют по 0,5 мл 5 % раствора бария хлорида и перемешивают. Через 15 мин пробы перемешивают и измеряют оптическую плотность суспензий при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора, содержащего 5 мл образца и 0,5 мл воды очищенной, для эталонного раствора – вода очищенная (5 мл).

Испытание проводят в 2 повторностях. Для расчета используется среднее значение.

Расчет содержания сульфат-ионов (X) в процентах производят по формуле:

Аопыт – значение оптической плотности испытуемого образца;

Аэталон – значение оптической плотности рабочего эталонного раствора.

Приготовление основного раствора калия сульфата (1 мг/мл сульфат-ионов). В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяю 1,8140 г калия сульфата, высушенного до постоянной массы при температуре 100 – 105 °C, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 1 года.
Приготовление рабочего эталонного раствора калия сульфата (0,002 % сульфат-ионов). В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл основного раствора калия сульфата, доводят водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Не более 0,1 %. Определение проводят колориметрическим методом, основанным на способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, которое дает цветную реакцию.

В пробирки вносят по 0,1 мл испытуемого образца и образца сравнения (0,1 % раствор хлороформа), добавляют 0,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, 2 мл 20 % раствора натрия гидроксида, 1 мл 10 % раствора резорцина и перемешивают. Содержимое пробирок перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 мин. Пробы осторожно охлаждают до температуры 15 – 18 0 С, затем измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, состоящим из 1 мл воды очищенной, 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и 2 мл 20 % раствора натрия гидроксида. Раствор резорцина в контрольный раствор не добавляют, т.к. продукты его окисления окрашиваются в зеленый цвет.

Расчет содержания хлороформа проводят путем сравнения оптической плотности испытуемого образца и образца сравнения (0,1 % раствор хлороформа).

Содержание хлороформа (Х) в процентах в испытуемом образце вычисляют по формуле:

А_исп – значение оптической плотности испытуемого образца;

А_ст – значение оптической плотности образца сравнения — 0,1 % раствора хлороформа.

Приготовление 0,1 % раствора хлороформа. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,1 мл хлороформа, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор используют через 24 часа.
Приготовление 10 % раствора резорцина. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5 г резорцина, растворяют в 30 мл воды очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

При температуре от 2 до 8 ºС, если не указано иначе в нормативной документации. Замораживание не допускается.

Читайте также: