Кольцевая проба с молоком на бруцеллез
Применяется КР с целью проверки благополучия стад на бруцеллез крупного рогатого скота и для проверки молока при продаже его на рынках.
Компонентами реакции являются:
- антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком, который представляет собой стандартизованную взвесь убитых бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет;
- сыворотка позитивная бруцеллезная.
В агглютинационные пробирки берут по два мл молока и добавляют по 0,1 мл антигена, затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с антигеном.
При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят контроли: с молоком от заведомо здоровой коровы; со смесью молока здоровой коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,05 мл сыворотки на 1 мл молока). Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водяную баню или термостат при 37-38°С на 1 час. Если в молоке имеются бруцеллезные антитела, то они образуют с антигеном комплекс, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывают вверх, образуя синее кольцо (остальная часть молока остается белой) – реакция положительная.
При отрицательной реакции столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после добавления к нему антигена, а слой сливок – белого или слегка желтоватого цвета.
Рис. 67. Капельная реакция агглютинации на предметном стекле: а – положительная; б – отрицательная
При получении положительного или сомнительного результата КР от всех животных берут кровь для исследования на бруцеллез в РБП или РА и РСК (РДСК), проводят эпизоотологическое обследование хозяйства, клинический осмотр и исследование животных на заболевание маститами.
К а п е л ь н ы й м е т о д РА применяют в основном для идентификации культур бактерий, а также для установления их принадлежности к определенным серогруппам и серовариантам. Так поступают при диагностике колибактериоза и сальмонеллезов. Техника постановки РА сводится к следующему. На предметное стекло наносят каплю сыворотки и каплю физиологического раствора (контроль). Петлю с бактериальной культурой увлажняют в капле сыворотки, затем культуру тщательно растирают рядом с каплей, смешивают с сывороткой и энергично 6-10 раз покачивают стекло круговыми движениями. Агглютинация наступает сразу или не позднее 1-2 мин. Реакцию агглютинации учитывают при хорошем освещении. Пользование лупой облегчает учет реакции.
Агглютинация проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.
При отрицательной реакции культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную взвесь (рис. 67). То же самое должно быть при проведении контроля (антиген + физиологический раствор).
Р о з-б е н г а л п р о б а (РБП)
Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз-бенгал антигеном применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у многих видов животных.
Компонентами РБП являются:
- испытуемые сыворотки крови;
- бруцеллезный антиген для РБП, изготовляемый на биопредприятиях, представляет собой стандартизированную суспензию в буферном растворе инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет;
- позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;
- 0,5%-ный карболизированный физиологический раствор.
Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18-30°С.
Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки. При исследовании сывороток крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, свиней в каждую лунку рядом с сывороткой вносят 0,03 мл антигена, а при исследовании сывороток других животных – 0,015 мл, тщательно смешивают покачиванием и легким вращением в течение 4 мин. Одновременно проводят контроли антигена с позитивной и негативной сыворотками, с физраствором.
Реакцию считают положительной при выраженной агглютинации окрашенных бруцелл в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена).
Р е а к ц и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РГА)
Эта реакция не относится к реакциям иммунитета, так как является результатом действия естественных гемагглютининов некоторых бактерий и вирусов на эритроциты, что влечет за собой их агглютинацию.
Реакцию ставят на плексигласовых панелях с лунками.
Исследуемый материал разводят физраствором и к этим разведениям добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов, после чего панели с реакцией помещают в термостат на 30 мин или оставляют при комнатной температуре на 1 ч.
Реакция гемагглютинации позволяет только выявить гемагглю-тинирующую способность бактерий и вирусов.
Для идентификации этих микроорганизмов в дальнейшем используют реакцию торможения гемагглютинации.
Р е а к ц и я т о р м о ж е н и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РТГА)
РТГА – иммунная реакция, в которой специфические антитела, взаимодействуя с антигеном, лишают его способности агглютинировать эритроциты.
Реакция проводится в два этапа. На первом этапе разводят специфическую сыворотку от 1:10 до 1:1280, К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем жидкости, содержащий антиген в четырехкратном титре, который определен в РГА. Если титр антигена равен 1:640, агглютинируют эритроциты, делают разведение в 4 раза концентрированнее – 1:160.
После инкубирования при 37°С в течение 30 мин на втором этапе к этой смеси добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов. Если сыворотки и антигена взято по 0,25 мл, то эритроцитов добавляют 0,5 мл.
Контролем является проба, где сыворотка заменена физраствором. Реакция читается после выдерживания в течение 30 мин в термостате или 45 мин при комнатной температуре.
Реакция используется для идентификации и типизации выделенного антигена, титрования вируссодержащих жидкостей и материалов и серологическом диагностики вирусных инфекций.
Р е а к ц и я н е п р я м о й (п а с с и в н о й) г е м а г г л ю т и н а ц и и (Р Н Г А)
Сущность этой реакции заключается в том, что на поверхность эритроцитов адсорбируют или антиген, или антитела (иммуноглобулины), которые приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфических антител или антигена.
Главными достоинствами РНГА – высокая чувствительность и специфичность, техническая простота, стабильность используемых компонентов.
РНГА применяют при диагностике инфекционных болезней:
1) для обнаружения в титрования антител в исследуемой сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
2) для идентификации неизвестного антигена с помощью известного иммуноглобулинного эритроцитарного диагностикума.
Учет РНГА проводится так же, как и при постановке РГА.
Задания для самостоятельной работы
1. Провести постановку и учет результатов реакции агглютинации капельным методом с неизвестным антигеном с использованием набора агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.
2. Провести постановку реакции агглютинации классическим (пробирочным методом) на бруцеллез с сыворотками крови крупного рогатого скота (учет результатов провести на следующем занятии).
3. Ознакомиться с результатами кольцевой реакции с молоком на бруцеллез, с реакцией гемагглютинации с Роз-бенгаловой пробой на бруцеллез.
Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
1. Как называются компоненты в реакции агглютинации?
3. Осадок, продукт соединения антигена с антителом.
2. Для постановки реакции агглютинации необходимо приготовить исходное разведение исследуемой сыворотки 1:25. Какой из приведенных вариантов удовлетворяет это условие?
А. 0,3 мл сыворотки + 4,7 мл физраствора.
Б. 0,2 мл сыворотки + 4,8 мл физраствора.
В. 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физраствора.
3. При чтении реакции агглютинации в одной из пробирок установлены следующие признаки – жидкость мутная (непрозрачная), на дне небольшой осадок. Дать оценку реакции агглютинации на плюсовой системе.
4. При чтении реакции агглютинации на бруцеллез с сывороткой крупного рогатого скота получены результаты:
1:50 +++, 1:100 +++, 1:200 ++, 1:400 ++. Дайте оценку реакции.
5. В лабораторию присланы пробы сыворотки крови крупного рогатого скота. Какие разведения сыворотки нужно приготовить для постановки реакции агглютинации на бруцеллез?
А. 1:50,1:100, 1:200, 1:400.
Б. 1:25, 1:50, 1:100, 1:200.
6. Какие изменения претерпевает антиген под действием специфических антител в реакции агглютинации?
А. Выпадает осадок на границе обеих жидкостей.
8. Проведена реакция агглютинации методом кольцевой пробы с молоком на бруцеллез, в результате чего проба молока стала белой и на его поверхности образовалось синее кольцо. Дайте оценку реакции.
Кроме основных методов, к которым относятся РА, РСК и РДСК, в практических условиях возникает необходимость применения вспомогательных методов серологической диагностики. Ниже излагаются наиболее изученные из этих методов.
Пластинчатый метод реакции агглютинации с антигеном, окрашенным краской Rose Bengal (RBPT). Разработан несколько лет тому назад в США и используется как официальный метод (Brewer) диагностики бруцеллеза в этой стране. Сущность реакции состоит в том, что окрашенный антиген, обработанный кислым буферным раствором, соединяется с плазмой крови, которую получают и небольших пробирках с кровью, и веществом, отделяющим плазму от клеток. Для постановки реакции Бревера берут кровь в небольшие пластиковые трубочки, содержащие гепарин и фитогемагглютинин, который способствует быстрому осаждению эритроцитов, освобождая плазму крови. В Англии используют вместо плазмы сыворотку крови. Антиген, рекомендованный для этой реакции Комитетом экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ, содержит буфер при pH 3,65 с плотностью клеток бруцелл, составляющей 8%. Реакцию ставят на плотном белом картоне или на плитках. Берут 0,03 мл неразведенной сыворотки или плазмы крови и такое же количество окрашенного антигена, хорошо смешивают стеклянной палочкой в обоих направлениях в течение 4 мин, после чего учитывают результат. Отмечают, что реакция может наступить и у небруцеллезных животных. В стадах, привитых ранее вакциной из штамма № 19, процент ложноположительных реакций может быть очень высоким.
Ценность метода состоит в том, что он может быть применен в полевых условиях. В Англии (Мак-Диармид, 1970) пробы, давшие положительный результат по пластинчатой реакции, исследуют по РСК, на которой предшествующая прививка животных вакциной из штамма № 19 отражается меньше, чем на РА.
Сущность пластинчатой реакции с антигеном, окрашенным краской Rose Bengal, подробно изучал Корбель (Corbel, 1972, 1973). Автор нашел, что основным фактором специфичности метода является pH среды, тогда как краситель Rose Bengal может быть без ущерба для результатов реакции заменен triphinyl-methane или акридинным оранжевым и другими красителями. Антиген для пластинчатой реакции он готовил из стандартных для пробирочной РА клеток Br. abortus, взвесь которых осаждал на центрифуге при 6000 об/мин в течение 20 мин. Затем взвесь бруцелл 3-кратно промывал на центрифуге в солевом растворе и вторично суспензировал в 0,15 М NaCl, имеющем разное значение pH — от 1 до 7 с лактатным или фосфатным буфером (т. е. ниже и выше значения pH 3,65, рекомендованного для стандартного антигена).
В опытах оказалось, что при значениях pH 1, 2, 3 феномен реакции агглютинации не наступал с позитивными сыворотками. При pH 3,65 и 4 показания были одинаковыми и самыми низкими по охвату инфицированных животных. При pH ниже 2 антигены проявляли тенденцию к аутоагглютинации. В опытах, где значение pH было 4,5, число сывороток, реагирующих с антигеном, стало увеличиваться и достигло максимального уровня при pH 6. Автор склонен считать, что этим методом выявляются антитела иммуноглобулинов класса IgG.
Реакция агглютинации с применением меркаптоэтанола. Методика реакции основана на введении в сыворотку 0,1 М 2-меркаптоэтанола. Реакцию ставят по схеме пробирочной РА. Альтон (1970) вначале исследовал экспериментально зараженных коз и их потомство обычной РА, разбавителем в которой был 5%-ный раствор хлорида натрия как для разведения сыворотки, так и для разведения антигена. Начальное разведение сыворотки было 1 : 10, а дальше производил последовательное разведение ее в 2 раза (1 : 20, 1 : 40 и т. д.). Разведенный антиген вводил в сыворотку в таком же объеме (0,5мл). Следовательно, в первой пробирке результат при наличии 50%-ного титра или выше расценивался как 20 МЕ/мл, во второй пробирке — 40 МЕ/мл и т. д. Положительные пробы исследовал с нормальным солевым раствором (0,85%-ным), в который вводил до 0,1 М меркаптоэтанолового спирта для разведения как сыворотки, так и антигена. Результаты оценивались на основании предположения, что стандартный тест РА выявляет общие агглютинины, а меркаптоэтаноловый — агглютинин IgG (7 S). Разница титров двух проб указывает на количество агглютинина IgM (19 S), присутствовавшего в данной сыворотке, но разрушенного меркаптоэтанолом.
Наджи, Сорейм (Nagy a. Sorheim, 1969) сравнивали показания РСК, РА с тепловой инактивацией и РА на меркаптоэтанолоном разбавителе. Было проверено 5763 головы крупного рогатого скота. Меркаптоэтаноловый тест ставили по технике пробирочной РА, но вместо формалинизированного нормального солевого раствора брали 0,1 М меркаптоэтанолового раствора в таком же (0,85%-ном) солевом растворе.
Тепловую реакцию агглютинации проводили так же, как и пробирочную, но стой разницей, что после соединения разведения сыворотки с разведением антигена пробирки выдерживали при 65° С в течение 15 мин, затем их охлаждали до 18° С в холодной воде, центрифугировали в течение 15 мин при 1000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, а в пробирки вводили 0,6 мл изотонического раствора хлорида натрия. РСК проводили с разведением сывороток 1:5, 1 : 10.
Все результаты оценивали эквивалентно к интернациональной стандартной сыворотке.
Получены следующие сравнительные данные. Совпадение меркаптоэтанолового теста с показаниями РСК отмечались в 96% случаев, 88% совпали с показаниями РА и в 86% с РА после тепловой инактивации сывороток.
Пиле и Тома (1969) на основании результатов опытов, проведенных с искусственным заражением и вакцинацией крупного рогатого скота, овец и крыс, пришли к выводу, что различить вакцинированных от зараженных вирулентной культурой животных было невозможно при применении медленной сероагглютинации и параллельного теста меркаптоэтанола.
Николетти (1969) сообщил о результатах исследования крупного рогатого скота, у которого бруцеллезная инфекция была подтверждена бактериологически и разными дополнительными серологическими методами. Оказалось, что стандартной классической реакцией агглютинации выявлено 52% животных-бруцеллоносителей; пластинчатой реакцией с окисленным и окрашенным Rose Bengal антигеном —95%; реакцией с применением 2-меркаптоэтанолового спирта (RBPT) — 97%; РСК — 98%; риванолевым преципитационным тестом —96%. Риванолевый тест осуществляется путем добавления в сыворотку раствора риваноля. Протеины сыворотки, отличающиеся от гамма-глобулинов, осаждают на центрифуге и удаляют, а супернатант (содержащий глобулины) исследуют быстрым пластинчатым или пробирочным методом.
Кольцевая реакция (КР). КР является наиболее апробированным и широко распространенным методом предварительного или разведывательного обследования на бруцеллез стад коров и отдельных животных. Этот метод применяется также для исследования молока овец. Большие опыты в этом направлении провели Эбанди (Ebandi, 1971), Матур (Mathur, 1970) и др. Особая ценность метода состоит в том, что можно проводить контроль на бруцеллез сборного молока в бидонах без особой затраты труда и средств. Причем этот контроль можно проводить постоянно, а не спорадически. Пробы молока для определения титра антител можно разводить молоком здоровых коров. Титры выше 1 : 10, по рекомендации Комитета экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ, считаются диагностическими. Колебания титров в отдельных четвертях вымени указывают на бруцеллезную инфекцию, а одинаковый титр во всех четвертях вымени — скорее на поствакцинальные титры. И хотя КР показывает иногда неспецифические положительные реакции и гораздо чаще дает отрицательный результат у зараженных бруцеллезом коров, Комитет экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ, основываясь на большом объеме информации из многих стран, рекомендует эту реакцию для широкого применения во всех странах в качестве дополнительного метода.
По данным Кисса (1972), в пробах молока с положительной кольцевой реакцией и в пробах с неспецифической реакцией обнаруживались иммуноглобулины IgG и IgM. В пробах молока с отрицательной КР эти глобулины установлены в относительно меньшем количестве.
Кольцевая реакция в СССР изучалась многими авторами и получила хорошую оценку.
Была установлена (П. А. Триленко, 1956) специфичность КР при исследовании до 20 000 проб молока в разных по эпизоотической характеристике хозяйствах. Особенно хороший результат был получен в свежеинфицированных стадах. Кроме того, КР можно применять для исследования сливок, разведенных 1 : 1 10%-ным раствором хлорида натрия или молоком здоровой коровы. Кислотность свыше 34° Т снижает показания КР, но ее легко устранить, добавив 1—2 капли насыщенного раствора гидрокарбоната натрия на 1 мл молока. Установлено, что молоко овец лучше разводить 1 : 1 10%-ным раствором хлорида натрия, что значительно улучшает результат исследования.
Этот метод регламентирован в СССР Министерством сельского хозяйства для установления предварительного диагноза на бруцеллез в стадах крупного рогатого скота и для исследования рыночного молока.
Была установлена также (П. А. Триленко, 1956) принципиальная пригодность КР для исследования сывороток крови на 711 пробах, в том числе крупного рогатого скота —- 599, овец — 62, лошадей — 18 и свиней — 32. Все пробы крови получены из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. Исследование проводили следующим образом. Молоко здоровой коровы разливали по 2 мл в 3 пробирки, в каждую из которых добавляли по 0,2 мл 20%-ного раствора хлорида натрия.
Затем вводили исследуемую сыворотку: в первую пробирку — 0,15 мл, во вторую — 0,1 мл и в третью — 0,05 мл; в заключение во все пробирки добавляли по 0,15 мл цветного антигена КР. Пробирки выдерживали 2 ч в термостате при 37—38 С, после чего учитывали результат. Из 711 проб крови по РСК было положительных — 136, по КР с сывороткой крови — 101 и по РА (пробирочный метод) — 64 пробы.
В литературе имеются указания на некоторое совершенствование КР. Так, например, Танвани и Патгак (Tanwani, Pathak) считают окраску антигена тетразолом более предпочтительной, чем окраску гематоксилином.
Холмс (1967) предлагает индивидуальные пробы молока исследовать в тонких пробирках, куда вначале нужно вводить 1 мл молока здоровой коровы, а затем 0,03 мл (одна капля) исследуемого молока и по 1 капле окрашенного антигена.
В СССР продолжает широко испытываться метод исследования сывороток крови кольцевой реакцией. Большие опыты проведены В. Т. Котовым, Л. С. Герман и Б. Т. Артемовым (1957, 1960), С. И. Муратовым (1966), Б. Т. Артемовым (1971), показавшими, что КР с сывороткой крови более удобная и чувствительная, чем пробирочная РА.
Антиглобулиновая проба (модификация реакции Кумбса). Эта проба основана на определении неполных антител. В настоящее время она испытывается в двух вариантах.
Первый вариант. В СССР М. И. Чернышова с соавторами (1969) вначале исследовала сыворотки в пробирочной РА в 5—8 разведениях (от 1 : 50 и выше). Бруцеллезный антиген авторы применяли типированный к интернациональной стандартной сыворотке. Затем по 3 пробирки с отрицательной и слабоположительной пробами в РА центрифугировали при 2 000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок дважды промывали в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия на центрифуге. К осадку добавляли 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,1 мл антиглобулиновой сыворотки, разведенной по титру (1 : 30 или 1 : 80). После встряхивания пробирки ставили в термостат на 24 ч, после чего учитывали результат. Контролем служили пробы отмытого антигена РА, смешанного с 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,1 мл антиглобулиновой сыворотки в титре. Антигеном для исследования проб крови крупного рогатого скота является антиглобулин крупного рогатого скота для исследования проб крови овец — аитиглобулин овец и т. д.
Выявление неполных антител методом Кумбса у крупного рогатого скота не нашло широкого практического применения, так как грань оценки между положительной и отрицательной пробами очень близка.
Второй вариант. Этот вариант (Хайди) отличается от первого тем, что исследуемую сыворотку вначале подогревают в течение 15 мин при 70° С, затем смешивают с бруцеллезным антигеном (РА). После выдерживания в термостате в течение 2—3 ч клетки промывают на центрифуге изотоническим раствором хлорида натрия и к осадку добавляют антиглобулиновую сыворотку данного вида животных в титре, выдерживают в термостате 14—16 ч и учитывают результат на следующий день.
Реакция Кумбса в указанных модификациях с сыворотками крупного рогатого скота применялась во многих странах, преимущественно с целью разведывательного метода. Для целей диагностики бруцеллеза рекомендована Комитетом экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ (1971 г.) только для овец в модификации Haidi (с прогретой сывороткой). По данным Комитета, эта методика специфична при исследовании сывороток крови непривитых овец, но выявляет в среднем 70% больных животных.
По данным Висниовски (Wisniovski, 1973), в Польше этот метод широко применяется для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Владельцы патента RU 2491545:
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики бруцеллеза. Способ диагностики бруцеллеза включает внесение в лунки диагностической пластины свежего или консервированного формалином молока, добавление антигена в дозе 0,015 мл, перемешивание компонентов, покачивание пластины в течение 4 минут, учет результатов реакции. В качестве антигена используют антиген для кольцевой реакции с молоком. Молоко вносят в количестве 0,03-0,04 мл. Положительный результат оценивают по образованию агглютината, собирающегося в виде колец различной ширины и интенсивности окрашивания по краю лунки. Способ позволяет быстро и точно диагностировать бруцеллез у животных. 3 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано в серологической диагностике бруцеллеза животных.
Известен способ выявления бруцеллезных антител в молоке крупного рогатого скота с помощью кольцевой реакции (КР) с антигеном, окрашенным гематоксилином или тетразолием [Наставление по диагностике бруцеллеза животных. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ, М., 2003, 64 с.].
Недостатком способа является необходимость проведения дополнительных исследований животных на мастит в целях исключения неспецифических показаний КР, за счет чего снижается охват диагностическими исследованиями поголовья животных, кроме того, обследованию в КР с молоком подлежат животные, непривитые противобруцеллезными вакцинами.
Наиболее близким по техническому решению является способ диагностики бруцеллеза, включающий внесение в лунки диагностической пластины свежего или консервированного формалином молока, добавление к 0,05-0,06 молока 0,015 мл 8-9%-ного раствора калия фосфорнокислого двухзамещенного трехводного на физиологическом растворе pH 8,0-9,7 и добавление 0,015 мл. антигена для Роз-бенгал пробы [SU 1697827 A1, 17.11.88]
Однако из-за разбавления молока раствором соли способ обладает недостаточной активностью, т.е. недовыявляет больных бруцеллезом животных, а у здоровых в отношении бруцеллезной инфекции коров с заболеванием молочной железы маститом проявляются неспецифические реакции.
Техническим результатом изобретения является повышение диагностической чувствительности, специфичности, а также возможность осуществления диагностики бруцеллеза у животных, привитых противобруцеллезными вакцинами при упрощении способа диагностики.
Технический результат достигается тем, что способ диагностики бруцеллеза включает внесение в лунки диагностической пластины свежего или консервированного формалином молока, добавление антигена в дозе 0,015 мл, перемешивание компонентов, покачивание пластины в течение 4 минут, учет результатов реакции, в качестве антигена используют антиген для кольцевой реакции с молоком, молоко вносят в количестве 0,03-0,04 мл, положительный результат оценивают по образованию агглютината, собирающегося в виде колец различной интенсивности окрашивания по краю лунки.
Способ осуществляется следующим образом. Проводят постановку реакции агглютинации (РА) пластинчатой, для чего в чистую эмалированную диагностическую пластину на дно лунки вносят 0,03-0,04 мл свежего или консервированного формалином молока и добавляют рядом с молоком антиген для кольцевой реакции в дозе 0,015 мл. Антиген в каждой лунке тщательно смешивают с молоком смесителем до получения однородной жидкости, после чего его промывают в горячей воде и промокают фильтровальной бумагой. Пластину с пробами молока и антигеном покачивают в течение 4 минут и учитывают результат. При положительном результате образуется агглютинат, собирающийся по краю лунки в виде кольца различной ширины и интенсивности окрашивания с просветлением жидкости в лунке, при отрицательном результате жидкость в лунке окрашена равномерно, по краю лунки кольцо отсутствует.
Результаты сравнительного испытания чувствительности и специфичности РА пластинчатой с разными объемами компонентов представлены в таблице 1.
Данные таблицы 1 показывают, что оптимальными дозами компонентов при постановке РА пластинчатой являются: молоко - 0,03-0,04 мл, антиген для кольцевой реакции - 0,015 мл, т.к. в этих соотношениях выявлено наибольшее количество реагирующих животных с четкими и ярко выраженными реакциями (оценка ++ и +++ креста).
Результаты сравнительного изучения чувствительности разных диагностических тестов представлены в таблице 2.
Анализ данных таблицы 2 показывает, что предлагаемый способ диагностики бруцеллезных антител в молоке - РА пластинчатая с антигеном для КР обладает более высокой диагностической чувствительностью и специфичностью в сравнении с аналогом - РБП с K2HPO4 при обследовании непривитых противобруцеллезными вакцинами животных, а также иммунизированных противобруцеллезными вакцинами в хозяйствах с различной эпизоотической обстановкой по бруцеллезу.
Более высокая диагностическая чувствительность и специфичность достигнуты за счет применения в пластинчатой РА антигена для КР с молоком. Результаты исследований проб молока от непривитых противобруцеллезными вакцинами коров, больных клиническими и субклиническими формами маститов из благополучных по бруцеллезу хозяйств, представлены в таблице 3.
| Таблица 3. | |||||
| Результаты исследований молока коров, больных маститами, из благополучных по бруцеллезу хозяйств | |||||
| № хозяйств | Количество обследованных коров | Реагировали в тестах с молоком: | Положительная проба с мастидином | ||
| КР с цельным молоком | РА пластинчатая с антигеном для КР (испыт.) | РБП с K2HPO4 (аналог) | |||
| 1 | 56 | 29 | - | 14 | 56 |
| 2 | 38 | 16 | - | 10 | 38 |
| 3 | 19 | 4 | - | 4 | 19 |
| итого | 113 | 49 | - | 28 | 113 |
| 43,4% | - | 24,8% | 100% |
Данные таблицы 3 показывают, что предлагаемый способ диагностики - РА пластинчатая с антигеном для кольцевой реакции с молоком является специфичным, поскольку позволяет проводить обследование на бруцеллез лактирующих коров с заболеванием молочной железы маститами в отличие от КР с молоком и РБП с K2HPO4.
Заявленный способ диагностики бруцеллеза относится к экспресс-тестам диагностики бруцеллеза, для его проведения не требуется лабораторное оборудование, реакцию можно осуществлять в полевых условиях, на животноводческих фермах.
Способ обладает специфичностью и более высокой чувствительностью, внедрение его обеспечит повышение эффективности диагностики бруцеллеза при обследовании непривитых животных и иммунизированных противобруцеллезными вакцинами за счет оперативного и более полного выявления больных коров, удешевит и ускорит осуществление теста за счет исключения дополнительных исследований молока на наличие маститов. Способ диагностики бруцеллеза апробирован в хозяйствах Омской области с высоким противоэпизоотическим эффектом.
Способ диагностики бруцеллеза, включающий внесение в лунку диагностической пластины свежего или консервированного формалином молока, добавление антигена в дозе 0,015 мл, перемешивание компонентов, покачивание пластины в течение 4 мин, учет результатов реакции, отличающийся тем, что в качестве антигена используют антиген для кольцевой реакции с молоком, молоко вносят в количестве 0,03-0,04 мл, положительный результат оценивают по образованию агглютината, собирающегося в виде колец различной ширины и интенсивности окрашивания по краю лунки.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к экспресс-методу диагностики бруцеллеза овец и коз в реакции непрямой гемагглютинации для исследования молока.
В доступной нам литературе мы не нашли данных по использованию реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с молоком и кольцевой реакции с молоком (КР с молоком) для выявления бруцеллеза у овец и коз. Кольцевая реакция с молоком официально применяется для исследования коров на бруцеллез. В связи с этим, в качестве аналога мы применяли кольцевую реакцию с молоком для исследования молока овец и коз.
Постановка кольцевой реакции
Перед исследованием молоко тщательно перемешивают путем энергичного встряхивания для равномерного распределения сливок.
Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока. В пробирки вносят по 2 мл молока. После взятия каждой пробы молока пипетку двукратно промывают теплой водой. Антиген вносят по 0,1 мл в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в каждые 10 проб штатив с пробирками энергично встряхивают для равномерного распределения антигена в молоке.
При постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят следующие контрольные пробы:
- молоко от заведомо здоровой коровы;
- смесь молока здоровой коровы с позитивной бруцеллезной сывороткой (0,1 мл сыворотки на 2 мл молока).
Штатив с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в термостат или водяную баню при температуре 37-38°С на один час и затем выдерживают 30 минут при комнатной температуре.
Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 минут после извлечения штативов из термостата (водяной бани) в крестах по следующей схеме:
+++ (3 креста) - четко выраженное синее или красно-вишневое кольцо (в зависимости от использованного антигена) в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;
++ (2 креста) - четко выраженное синее (красно-вишневое) кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый или бледно-розовый цвет;
+ (1 крест) - синее (красно-вишневое) кольцо в слое сливок выражено слабо и весь столбик молока имеет синий (розовый) цвет;
- (минус) - столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий (красно-вишневый) цвет.
Все пробирки молока, давшие кольцевую реакцию с оценкой 3 и 2 креста, считают положительными, 1 крест - сомнительными.
При получении отрицательных результатов КР по всему стаду коров его считают благополучным по бруцеллезу.
Преимущество КР с молоком заключается в простоте постановки, быстроте получения результатов и в том, что ее можно использовать для контроля благополучия дойных стад коров.
Недостатком КР является ее слабая чувствительность и возможность получения неспецифических реакций у больных маститом животных.
Кольцевая реакция с молоком овец и коз не входит в число официально принятых методов диагностики бруцеллеза мелкого рогатого скота и не используется в практике с этой целью. Данная реакция применяется для исследования коровьего молока и имеет диагностическое значение для выявления больных бруцеллезом коров. Она менее эффективна для диагностики бруцеллеза овец и коз.
Основная причина недостаточной эффективности кольцевой реакции с молоком овец и коз при диагностике бруцеллеза заключается в том, что более мелкие жировые шарики молока овец и коз менее активно, чем у крупного рогатого скота, абсорбируют агглютинированные окрашенные бруцеллы (бруцеллезный антиген для КР с молоком) в положительных молочных образцах и не поднимаются для образования типичного окрашенного кольца.
Имеется еще один недостаток КР с молоком овец и коз - низкое содержание специфических антител в молоке овец и коз и слабая серологическая активность их по сравнению с антителами, содержащимися в коровьем молоке.
В связи с указанными причинами, кольцевая реакция оказалась непригодной для диагностики бруцеллеза у овец и коз. Поэтому для диагностики бруцеллеза овец и коз путем исследования молока возникает необходимость в изыскании более чувствительного метода, пригодного для выявления специфических антител, содержащихся в молоке у животных этого вида.
В связи с тем что в специальной литературе нет сообщений о возможности исследования на бруцеллез молока овец и коз с помощью РНГА, целесообразно испытать эту реакцию для выявления бруцеллезных специфических антител в молоке и установить диагностическую ценность РНГА с молоком животных этого вида.
На основании изложенного, мы решили испытать РНГА с эритроцитарным бруцеллезным антигеном, разработанным ПЗНИВИ, ВГНКИ и ВНИИБТЖ, для исследования молока овец и коз, по сравнению с КР с молоком и сывороткой крови РА, РСК и РНГА.
Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности метода исследования на бруцеллез молока овец и коз.
При исследовании на бруцеллез молока коров в неблагополучном по бруцеллезу хозяйстве в РНГА выявлено гемагглютининов в молоке 44% больных, тогда как по КР реагировало 31%, что доказывает чувствительность РНГА. Полученные результаты были подтверждены при одновременном исследовании коров в РБП, РА, РСК и РНГА с сыворотками крови.
На большом фактическом материале при серологическом исследовании крупного и мелкого рогатого скота установлено, что РНГА с разработанным нами эритроцитарным антигеном для исследования сывороток крови реакция по диагностической эффективности значительно превосходит используемые в ветеринарной практике другие методы диагностики бруцеллеза (РА, РСК, РБП и РИД с ОП-С антигеном), вместе взятые, выявляет больных бруцеллезом животных в более ранние сроки после заболевания и может заменить все эти реакции.
По заключению республиканских, краевых и областных ветеринарных лабораторий, испытавших РНГА, эта реакция обладает специфичностью, высокой чувствительностью и пригодна для массовых исследований животных на бруцеллез.
Поэтому мы решили испытать возможность использования РНГА для исследования молока овец и коз по сравнению КР с молоком и другими серологическими реакциями, применяемыми в практике для исследования сывороток крови (РНГА, РБП, РА и РСК).
Специфичность РНГА с бруцеллезным эритроцитарным антигеном и КР для исследования молока изучали путем исследования 220 проб молока от овец и коз благополучных по бруцеллезу хозяйств.
Результаты исследования даны в таблице 1.
|
Как видно из таблицы 1, при исследовании 220 проб молока овец и коз в РНГА со всеми пробами молока здоровых животных получен отрицательный результат, что показывает ее специфичность, тогда как по КР в трех случаях получен положительный результат. При проверке животные, которые реагировали в КР с молоком положительно, оказались больными маститом.
В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах исследованию в РНГА и КР были подвергнуты молоко и сыворотки крови от 95 овец и коз. Результаты исследований представлены в таблице 2.
|
Как видно из приведенных в таблице 2 данных, РНГА с молоком по чувствительности не уступает РНГА с сывороткой крови и превосходит КР с молоком и РА, РСК с сывороткой крови. В частности, положительная РНГА с сывороткой крови получена у 12 (12,6%) овец и коз, которые положительно реагировали и в РНГА с молоком, тогда как с помощью КР с молоком бруцеллез был установлен у 5 (5,3%) овец и коз. В РА и РСК реагировало 8 (8,4%) животных.
Дополнительно к КР с молоком, РНГА с молоком выявила 7 больных бруцеллезом овец и коз.
Достоверность показаний РНГА с молоком была подтверждена положительными результатами ПНР и РНГА с антительным бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом проб молока и образцов биоматериала (экстракт гомогенизированных лимфоузлов и органов) от больных бруцеллезом животных. Эти данные свидетельствуют о высокой эффективности РНГА с эритроцитарным антигеном, разработанным Прикаспийским зональным НИВИ, ФГБУ ВГНКИ и ВНИИБТЖ для исследования на бруцеллез молока овец и коз.
Наряду с этим, нами было подвергнуто исследованию в РНГА молоко от 2 коз, принадлежащих частным владельцам г. Хасавюрт и с. Новый Параул, реагировавших положительно на бруцеллез в РНГА с сывороткой крови.
В обоих случаях с молоком этих коз получена положительная РНГА в титрах 1:200 и 1:4092. При этом было установлено, что владельцы животных, употреблявшие козье молоко, заболели бруцеллезом в острой форме.
Проведенными исследованиями установлено, что использование РНГА с эритроцитарным антигеном для обнаружения бруцеллезных гемагглютининов в молоке овец и коз позволяет своевременно установить диагноз на бруцеллез, выявлять источник возбудителя болезни для людей и животных и является высокочувствительным и специфичным методом, пригодным для осуществления контроля за благополучием овцепоголовья по бруцеллезу.
Читайте также:
