Микропрепараты спирохет окрашивают по методу
Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы.
Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов: 1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий).
Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).
Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/
Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).
Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.
В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы
Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов.
Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.
Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.
Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы длительное время остаются живыми и способными к размножению. Существует несколько способов прижизненной окраски, в том числе и способ Nakanischi.
При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.
Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.
Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.
К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.
Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.
Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.
Раствор Б: КОН (0,01%) – 100мл.
Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.
Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.
В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.
Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.
По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение.
При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.
Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.
Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата.
Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.
Простой метод позитивного или негативного способа окраски микроорганизмов очень удобен для самых разнообразных целей (изучение формы и расположения клеток, определение размеров, обнаружение капсул у микробных клеток в мазках – отпечатках из органов инфицированного организма и пр.).
Однако простой метод окраски не позволяет дифференцировать микроорганизмы (в том числе и бактерии) сходные по форме и размерам, но принадлежащие к различным видам, простой метод окраски не позволяет обнаружить зрелые споры и цисты, высыпавшиеся из клетки в окружающуюся среду, простой метод окраски не позволяет обнаружить клетки со сложной структурой оболочки и пр.
В силу этого большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток.
Этот способ окраски называют дифференциальной окраской. В основе дифференциации микробов по Грамму лежит свойство клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны.
Основой клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов является пептидогликан. У грамположительных микробов пептидогликан имеет несколько слоев, у грамотрицательных - он однослоен.
У грамположительных микробов, обладающих плотным и многослойным пептидогликаном, образовавшийся комплекс при окраске кристаллическим фиолетовым и последующей обработке йодным раствором не вымывается спиртом, и клетки не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовый цвет. В то время как грамотрицательные микробы, имея тонкий слой пептидогликана, обесцвечиваются спиртом. При дополнительной окраске фуксином или сапранином грамотрицательные клетки окрашиваются в сиреневато – красный цвет.
Показатели дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов:
Грамположительные микроорганизмы не чувствительны к действию желудочного сока, имеют не сложную структуру. Резистентные к щелочам, чувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Иммуногенные свойства выражены слабо, оптимум роста при относительно высоком рН. В живом состоянии более проницаемы для красителей, чувствительны к электролитам. Могут быть кислотоустойчивыми и могут образовывать споры. Имеют многослойный пептидогликан и могут содержать тейхоевые кислоты. Клеточная стенка пористая, содержит мало белков, пептиды по составу аминокислот однообразны. Липидов мало, много гликопротеидов (99%).
Грамотрицательные микроорганизмы в большинстве случаев растворяются под действием желудочного сока, растворяются в 1% растворе КОН, чувствительны к кислотам. Малочувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Хорошо выражены иммуногенные свойства. Оптимум роста при низком рН среды. В живом состоянии плохо проницаемы для анилиновых красителей. Резистентны к слабым электролитам, спор не образуют. Основой клеточной стенки является однослойный пептидогликан, тейхоевая кислота отсутствует. Клеточная стенка малопористая, имеет сложную структуру, содержит все аминокислоты. Липидов много (до 22%), гликопротеидов мало (5 – 9%).
Растворы для окраски по методу Грамма:
1. Раствор А – кристаллический фиолетовый – 2,0г, этиловый спирт 95% - 20,0мл.
2. Раствор Б – щавелевокислый аммоний – 0,8г, дистиллированная вода – 80,0 мл.
Раствор А разводят дистиллированной водой (1:5) и затем смешивают его с равным объемом раствора Б.
3. Раствор Люголя – йод кристаллический – 1г, йодистый калий – 2,5г, дистиллированная вода – 80,0мл. Эту смесь оставляют на 24 часа для растворения йода.
4. Раствор для дополнительной окраски – сапранин или фуксин (2,5% раствор в 95% спирте) – 25 мл. Дистиллированная вода – 75мл.
Методика окраски по методу Грамма:
1. Фиксированный мазок, содержащий микробные клетки, окрасить генцианвиолетом (2 минуты).
2. Слить генцианвиолет, после чего нанести на препарат раствор Люголя (2 минуты).
3. Осторожно слить раствор Люголя и промыть препарат 95% этиловым спиртом (30 секунд. Клетки с многослойным пептидогликаном останутся окрашенными генцианвиолетом, с однослойным пептидогликаном – обесцветятся).
4. Препарат осторожно промыть струей воды.
5. Мазок окрасить раствором фуксина или сапранина (1 – 2 минуты).
6. Препарат осторожно промыть струей воды, высушить на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха над пламенем горелки, или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
7. Препарат исследовать при помощи микроскопа.
К сложным дифференциально – диагностическим методам окраски относится также и окраска по методу Циль – Нильсена (Ziehl – Naelsen), позволяющая отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от других, не обладающих этим свойством.
Этот метод применяется главным образом для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, имеющих своеобразный химический состав, а именно – высокое содержание в клетке липидов. Окраска по Циль – Нильсену применяется для окраски микобактерий туберкулеза и родственных им микроорганизмов из рода Mycobacterium.
Приготовление и окраска микопрепарата по Циль – Нильсену проводится следующим образом:
1. Готовят обычным способом фиксированный мазок из исследуемого материала (мокрота больного или чистая культура).
2. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и на нее наливают раствор карболового фуксина. Предметное стекло зажимают в пинцет Корне и препарат в течение 4-х минут нагревают над пламенем горелки (по мере испарения жидкости раствор красителя добавляется).
3. Через 4 минуты (по окончанию прогревания) фильтровальную бумагу осторожно снимают с препарата и на мазок на 30 секунд наносится 5 – 10% раствор серной или соляной кислоты приготовленный на 95% этиловом спирте.
4. Через 30 секунд препарат осторожно промывают струей холодной воды и дополнительно докрашивают раствором метиленовой сини.
Механизм окраски кислотоустойчивых микроорганизмов по Циль – Нильсену можно объяснить следующим образом: во время нагревания препарата воск, входящий в состав оболочки, размягчается, и благодаря этому краситель проникает в бактериальную клетку. Остывая, этот воск удерживает краситель, поэтому спирт, с кислотой вымывают краситель только из клеток, не обладающих кислотоустойчивостью. При дополнительной окраске метиленовым синим окрашиваются обесцвеченные клетки и на этом синем фоне будут отчетливо видны кислотоустойчивые бактерии, окрашенные в красный цвет.
Растворы для окраски по Циль – Нильсену:
1. Раствор А – основной фуксин – 0,3г, этилдовый спирт 95% - 10,0мл.
2. Раствор Б – фенол (расплавленные кристаллы) – 5,0г, дистиллированная вода – 95,о мл.
3. Раствор метиловой сини Леффлера или бриллиантовой зелени.
Растворы А и Б смешивают (карболовый фуксин). Смесь хорошо сохраняется.
В микроскопической практике при изучении мазков – отпечатков из органов, мазки из крови, при изучении спирохет, простейших, хламидий, культур тканей широко применяется еще один сложный метод окраски – окраска по Романовскому – Гимза.
Методика окраски по Романовскому – Гимза:
1. Препарат высушивается, фиксируется в жидком фиксаторе (метанол 3 – 5 минут).
2. Препарат высушивают и помещают в стаканчик с рабочим раствором красителя (экспозиция 20 25 минут при 37 градусах , концентрация раствора краски и экспозиция должны быть титрованы). Перекрашенный мазок дифференцируется этиловым спиртом (50 – 60 градусным), споласкивается осторожно водой, высушивается и микроскопируется.
Растворы красителей для окраски по Романовскому – Гимза:
1. Вариант А. Готовят раствор – 3,8г сухой краски, состоящей из смеси эозина и метиленовой сини, растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Раствор оставляют на несколько дней, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем добавляют 250 мл чистого глицерина и оставляют на 3 – 5 дней часто взбалтывая. Полученный раствор – краска Романовского – Гимза.
Перед употреблением краску оттитровывают в разведениях 1:1, 1:2, 1:3 и т.д., приготовленных на дистиллированной воде в течении 20 – 25 минут.
2. Вариант Б. Применяют окраску азур – эозином.
а) 1 г сухой краски Романовского – Гимза (азур и метиленовая синь) растворяют в одном литре дистиллированной воды.
б) 1 г эозина растворяют в одном литре дистиллированной воды.
Эти два раствора хранят отдельно в темном месте в стеклянных емкостях с притертыми пробками.
Для окрашивания препаратов ex tempore готовят рабочий раствор:
10 мл дистиллированной воды
4 мл раствора эозина
8 мл раствора краски Романовского
Необходимым условием для получения хорошей окраски препаратов является качество воды (рН воды должно быть нейтральным).
Выделяют простые и сложные методы окраски.
Простыми методами окрашивания называют окрашивание пре-
паратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.
Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.
При сложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).
Окраска по методу Грамаявляется самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.
Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.
Сущность метода. На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.
Этапы дифференцированного окрашивания по Граму:
· Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин.
· Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.
· Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с.
· Препарат быстро промывают водой (как описано выше).
· Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера).
· Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
· микроскопируют с иммерсионной системой.
· Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.
Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно. Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК. Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел с неправильными очертаниями, расположенные в центре или на полюсах клетки.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности микобактерий и нокардий.
Принцип метода. Кислотоустойчивость этих бактерий связана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются карболовым фуксином Циля при нагревании препарата в красный цвет и сохраняют эту окраску после обесцвечивания серной кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и в последующем докрашиваются метиленовым синим в синий цвет.
Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Бурри и Бурри-Гинса. В основе метода лежит негативное контрастирование. Так как капсула или тело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фон микропрепарата. Капсула видна как неокрашенная зона на темном фоне тушевого мазка. По методу Бурри-Гинса тела микробных клеток дополнительно окрашиваются в красный цвет фуксином.
Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.
Вопросы для самоконтроля
1 Перечислите основные морфологические типы клеток микроорганизмов.
2 Охарактеризуйте схематичное строение бактериальной клетки.
3 Перечислите этапы приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов, охарактеризуйте их.
5 Классифицируйте используемые в микробиологии красители, охарактеризуйте их.
Дата добавления: 2014-11-12 ; просмотров: 16942 . Нарушение авторских прав
1 Этап: приготовление мазка
- взять предметное стекло и обжечь в пламени горелки
- восковым карандашом отметить пределы будущего мазка
- положить предметное стекло на рельсы
- прокалить бактериальную петлю
- бактериальной петлей нанести в середину окружности каплю ИХН
- в каплю ИХН внести культуру бактерий
- тщательно эмульгировать смесь
- распределить смесь тонким слоем в пределах окружности
(Мазки из бульонных культур готовят без нанесения ИХН)
2 Этап: высушивание
- стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги
3 Этап: фиксация
Проводят для того, чтобы убить микроб, прикрепить его к предметному стеклу, повысить восприимчивость к красителю
- предметное стекло трижды накладывают на пламя горелки
4 Этап: окраска по Граму
- красить генцианвиолетом две минуты через фильтровальную бумагу
- слить краску с препарата
- налить раствор Люголя на 1 мин
- обесцветить препарат: погрузить несколько раз в 96% спиртовой раствор йода
- промыть препарат водой
- окрасить разведенным фуксином 1 мин
- высушить препарат фильтровальной бумагой
13. Методы окраски микропрепаратов. Дифференциальные методы окраски, практическое применение
Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.
Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.
Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – в красный
Окраска по Цилю-Нильсену.
Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску.
Метод Ожешко.
нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);
слить кислоту, промыть водой, высушить;
зафиксировать в пламени;
окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.
Окраска включения волютина (по Нейссеру).
Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные.
Окраска по Романовскому-Гимзе.
Относится к сложным методам окраски и применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и зерна волютина.
Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы – в краснофиолетовый.
РАСПИСАНИЕ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ
ПО МИКРОБИОЛОГИИ В ОСЕННЕМ СЕМЕСТРЕ
2012-2013 УЧЕБНОГО ГОДА
Лекция 8.30 по 2 нед. иммунология ауд. № 2
Лекция 10.30 по 2 нед. ауд. №2
Лекция 1 поток 15.00 ауд . №1 по 2 нед.
205 (Ут),206(Ми)(1и 2 н)
219(Со),220(Се)(1и 2 н)
Лекция 8.30 ауд. №2 по 2 нед.
211 (Ле),212(СЕ), (1и 2 н),
15.00 Лекция по 1 нед ауд №2 микробиология
Лекция поток 8.30 ауд №1 по 1 нед.
Лекция по 1 нед. ауд. №2
РАСПИСАНИЕ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ
ПО МИКРОБИОЛОГИИ В ВЕСЕННЕМ СЕМЕСТРЕ ПО ЦИКЛАМ ДЛЯ ЛЕЧЕБНОГО, ПЕДИАТРИЧЕСКОГО и МПФ
2012-2013 УЧЕБНОГО ГОДА
самостоятельной работы студентов лечебного, педиатрического и медико-профилактического факультетов в течение 3-х занятий по теме:
Занятие 1. Методы изучения морфологии микроорганизмов
1. Ознакомиться с методами изучения морфологии микроорганизмов.
2.Овладеть методами приготовления микропрепаратов и иммерсионной микроскопии.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Медицинская микробиология. Её значение в практической деятельности врача. Задачи предмета.
2. Оптическая микроскопия. Полезное увеличение. Разрешающая способность микроскопа.
3. Принципы иммерсионной, фазово-контрастной, флуоресцентной, электронной микроскопии.
4. Назначение и типы микропрепаратов из микроорганизмов: нативные, окрашенные (позитивно, негативно).
5. Зависимость границ человеческого познания от уровня научно-технического прогресса. Становление микробиологии как науки.
ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
а) ознакомиться с техникой фазово-контрастной и люминесцентной (флуоресцентной) микроскопии (Задание 1);
б) овладеть техникой микроскопии в иммерсионной системе (Задание 2);
в) обсудить схему и принципы действия иммерсионного и электронного микроскопов.
2.Методика изготовления окрашенных и неокрашенных микропрепаратов (Задание 2):
а) приготовить из агаровой культуры препарат и окрасить метиленовым синим или фуксином;
б) приготовить из взвеси дрожжей препарат и окрасить негативным методом.
задание для самостоятельной работы во внеучебное время
заполнить таблицу по микроскопическим методам исследования.
Занятие 2. Строение бактериальной клетки.
1. Освоить сложный метод окраски бактерий по Грамму.
2. Изучить строение бактериальной клетки.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Понятие о сложных методах окраски бактерий и их назначение. Механизм окраски по Граму.
2. Строение бактериальной клетки, как результат эволюционной адаптации (конкретные примеры: капсула, споры, жгутики и др.).
ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1.Сложные методы окраски - метод Грама. Окрасить по методу Грама препарат из смеси грамположительных и грамотрицательных бактерий (Задание 1).
2.Строение бактериальной клетки (Работа 3)
рассмотреть препарат из бактерий со жгутиками, окрашенный по Грею;
б) Капсула. Рассмотреть препарат из бактерий (клебсиелла с капсулой), окрашенный по Бурри-Гинсу;
в) Внутриклеточные включения. Рассмотреть препарат из дифтерийных палочек с зернами волютина, окрашенный метиленовой синькой;
г) Споры бактерий
рассмотреть препарат из палочек со спорами, окрашенный по Граму;
д) Клеточная стенка. Рассмотреть препарат плазмолиз дрожжей, окраска по Бурри-Гинсу.
задания для самостоятельной работы во внеучебное время
Обязательные и необязательные компоненты бактериальной кле тки
Занятие 3. Сравнительная морфология микроорганизмов.
1. Освоить сложный метод окраски бактерий по Цилю-Нильсену.
2. Изучить сравнительную морфологию групп микроорганизмов: простейших, грибов, бактерий, спирохет, риккетсий, вирусов.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Понятие о сложных методах окраски бактерий и их назначение. Механизм окраски по Цилю-Нильсену.
2. Основные группы микроорганизмов и их взаиморасположение в природе.
3. Связь формы и содержания, морфологии и функции на примере морфологии отдельных групп микроорганизмов.
4. Сравнительная морфология простейших, грибов, бактерий, спирохет, риккетсий, микоплазм, хламидий, вирусов.
ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1.Сложные методы окраски - метод Циля-Нильсена. Окрасить по методу Циля-Нильсена препарат их кислотоустойчивых и некислотоустойчивых бактерий (Работа 1).
2.Морфология микроорганизмов (Работа 2)
а) определить в готовых препаратах кокковидные и палочковидные формы бактерий;
б) рассмотреть лептоспиры в темнопольном микроскопе;
в) рассмотреть риккетсии в препарате из чистой культуры;
г) рассмотреть вирионы в препарате, обработанном по методу Морозова.
задания для самостоятельной работы во внеучебное время
Отличительные признаки основных групп микроорганизмов.
Место в системе
Занятие 1. Методы изучения морфологии микроорганизмов
1. Ознакомиться с методами изучения морфологии микроорганизмов.
2.Овладеть методами приготовления микропрепаратов и иммерсионной микроскопии.
Задание 1
Цель: Ознакомиться с различными методами микроскопии.
(материала для приготовления мазка)
Микроскопический метод исследования
Вывод: (ответить на вопросы: 1. Какие преимущества имеет метод флуоресцентной микроскопии? 2. Какой принцип лежит в основе фазово-контрастной микроскопии?
Цель: Овладеть методом приготовления, простой окраски и иммерсионной микроскопии микропрепаратов из чистой культуры бактерий.
I. Приготовление препарата из агаровой культуры
Для приготовления мазка необходимо взять чистое обезжиренное стекло. На предметном стекле обозначают стеклографом место нанесения материала. На обратную сторону стекла от обозначенного места наносят петлей каплю физиологического раствора. В левую руку берут пробирку с агаровой культурой, а в правую - петлю за петледержатель. Петлю обжигают на пламени горелки. Пробку прижимают к ладони 4 и 5 пальцами и медленными вращающими движениями извлекают из пробирки. Край пробирки обжигают. Петлю вводят в пробирку и остужают о стенки. Скользящим движением петлей берут материал и осторожно, не задевая о стенки, извлекают. Пробирку снова обжигают и закрывают пробкой.
В каплю физиологического раствора вносят исследуемую культуру и смешивают петлей до образования слегка мутноватой взвеси. Полученную взвесь равномерно распределяют на поверхности стекла, чтобы диаметр мазка был 1 – 1,5 см. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют, для этого проводят стекло над пламенем горелки три раза, при этом мазок должен быть сверху. Препарат окрашивают фуксином (1-2 мин) или метиленовой синькой (3-5 мин).
Для окраски негативным способом на стекло наносят каплю взвеси дрожжей в физиологическом растворе и смешивают с каплей туши. Препарат высушивают.
Окрашенные препараты рассматривают под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Подготовка микроскопа для работы : поднять конденсор до уровня предметного столика, полностью открыть диафрагму, поставить плоское (при естественном освещении) или вогнутое (при искусственном освещении) зеркало. Осветить поле зрения под контролем объектива х 8.
Нанести на препарат каплю масла, положить препарат на столик микроскопа и закрепить зажимами. Установить иммерсионный объектив. Под контролем зрения (смотреть на объектив сбоку!) медленно опустить объектив макровинтом до погружения в масло. Затем, глядя в окуляр, медленно поднимать объектив до появления объекта. Провести окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом, медленно вращая его только в пределах одного оборота.
Читайте также:
