Лабораторная диагностика инфекции helicobacter pylori

Проблемы с желудком доставляют огромный дискомфорт и подчас мешают вести привычный образ жизни. Боли в области живота, тошнота, отрыжка, тяжесть в желудке способны разрушить любые планы и надолго выбить из колеи. Ситуация серьезно осложняется, если такие явления обретают хронический характер. В чем может крыться причина желудочных расстройств и как ее устранить? Давайте в этом разберемся.

Что такое хеликобактер пилори и зачем нужен анализ

Очень часто проблемы с желудком вызывает коварная бактерия — хеликобактер пилори ( Helicobacter pylori ). Она имеет спиралевидную форму, является патогенной бактерией-паразитом, производит множество токсинов, поражающих слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки — именно в этих органах она обитает. Хеликобактер пилори приводит к воспалительным процессам, таким как гастрит, язва и ряду других, появление которых еще не так давно объясняли генетической предрасположенностью и нарушением здорового питания. Доказано, что в ряде случаев гастрит и язва вызваны именно инфицированием этой бактерией. То есть этими заболеваниями, оказывается, можно так же легко заразиться, как и гриппом.

Причем если большинство бактерий гибнет в кислой желудочной среде, то хеликобактер пилори в ней очень даже жизнеспособна. Она легко приспосабливается к агрессивной среде и без особого труда передвигается по стенкам внутренних органов благодаря специальным жгутикам на ее поверхности.

В России распространенность бактерии очень велика — в разных регионах инфицировано от 70 до 90% населения, что значительно выше показателей Европы и США. Это объясняется сравнительно низким уровнем жизни большинства россиян, как следствие — пренебрежение правилами гигиены, проживание в антисанитарных условиях. В Москве, как наиболее развитом городе России, количество инфицированных не превышает 60% (речь идет о зарегистрированных гражданах).

Как правило, поводом для назначения анализа на хеликобактер пилори становятся следующие симптомы:

• Боли в желудке после приема пищи.
• Частая отрыжка.
• Повторяющаяся изжога.
• Затруднение во время глотания пищи.
• Метеоризм и урчание в животе.
• Тошнота и рвота.
• Частая диарея и запоры, длящиеся более двух суток.
• Нарушение аппетита и потеря веса без видимой причины.
• Появление крови во время рвоты и дефекации.

Разумеется, перечисленные симптомы вовсе не указывают на инфекцию. Подтвердить или опровергнуть ее присутствие может только лабораторный анализ.

Выявить присутствие коварной бактерии в организме можно разными способами.

Этот анализ является качественным, то есть отвечает на вопрос, есть ли хеликобактер пилори в организме или нет. Исследование проводится в лаборатории методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Анализ отличается высокой точностью — до 95%. Данный анализ является самым простым видом диагностики. Его рекомендуют детям, пожилым людям и тяжелобольным пациентам.

Точность результатов исследования зависит не только от лаборатории, но и от соблюдения ряда простых правил подготовки к анализу.

Кал собирают в специальный контейнер, купленный в аптеке. Если контейнер будет заполнен на 1/3, этого будет достаточно для анализа. Ни в коем случае нельзя брать кал из унитаза — в биоматериал могут попасть дезинфицирующие средства. Доставить материал в лабораторию для анализа нужно как можно быстрее. Максимальное время его хранения — 10–12 часов при температуре +2…-8 градусов Цельсия.

Накануне анализа следует избегать физических и эмоциональных нагрузок, отказаться от алкоголя и жирной пищи. Кровь берут из вены натощак в утренние часы. Сама по себе процедура достаточно безболезненна и длится всего несколько минут. Однако пациенты по-разному ее переносят. Поэтому если организм ослаблен, то сразу после забора крови рекомендуется выпить сладкий чай или съесть кусочек черного шоколада — это поможет избежать головокружения. Чтобы не образовалась гематома на месте ввода иглы, после процедуры руку нужно несколько минут подержать согнутой в локте.

Результаты анализов на хеликобактер пилори может интерпретировать только врач, он же ставит окончательный диагноз и назначает подходящую терапию. Однако некоторые выводы можно сделать и самостоятельно изучив бланк с результатами.

• Иммуноферментный анализ. Результаты анализа на антитела готовятся в течение одного дня, не считая дня сдачи анализа. При необходимости возможна срочная подготовка результатов, она займет всего 2–3 часа. В разных лабораториях могут использоваться разные единицы измерения. Одна из наиболее распространенных — Ед/мл.

Результаты трактуются следующим образом:

>1,1 Ед/мл
Высокий риск развития язвенной болезни или язвенная болезнь; высокий риск развития рака желудка.

0,9–1,1 Ед/мл
Рекомендуется повторный анализ через две недели.

Бак­те­рия хе­ли­ко­бак­тер пи­ло­ри — свое­об­раз­ная тем­ная ло­шад­ка, на се­год­няш­ний день ма­ло изу­чен­ная и тем — бо­лее опас­ная. До сих пор оста­ет­ся мно­жест­во от­кры­тых во­про­сов: по­че­му не­ко­то­рые ин­фи­ци­ро­ван­ные лю­ди за­бо­ле­ва­ют яз­вой или гаст­ри­том, а дру­гие — нет; на­сколь­ко при­сут­ст­вие этой бак­те­рии в ор­га­низ­ме уве­ли­чи­ва­ет риск раз­ви­тия ра­ка же­луд­ка? Оче­вид­на не­об­хо­ди­мость раз­ра­бот­ки вак­ци­ны для про­фи­лак­ти­ки ин­фек­ции, по­иск ан­ти­био­ти­ков на­прав­лен­но­го дейст­вия, уби­ва­ю­щих бак­те­рию, — ведь у не­ко­то­рых лю­дей раз­ви­ва­ет­ся ре­зис­тент­ность к су­щест­ву­ю­щим ви­дам те­ра­пии. Единст­вен­ное, что мы мо­жем на­вер­ня­ка сде­лать во бла­го сво­е­му здо­ровью, — сдать про­фи­лак­ти­чес­кий ана­лиз.

Комплексный анализ, предназначенный для выявления H . pylori у пациентов с подозрением на гастрит, язву желудка или двенадцатиперстной кишки, включающий основные серологические тесты и метод РТ-ПЦР.

Комплексная диагностика геликобактериоза.

H. pylori diagnostic panel, H. pylori Abs, IgA, IgG, H. pylori, PCR.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь, кал.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Исследование рекомендуется проводить до начала приема антибиотиков и других антибактериальных химиотерапевтических препаратов.
• Исключить прием слабительных препаратов, введение ректальных свечей, масел, ограничить (по согласованию с врачом) прием медикаментов, влияющих на перистальтику кишечника (белладонна, пилокарпин и др.), и препаратов, влияющих на окраску кала (железо, висмут, сернокислый барий), в течение 72 часов до сбора кала.
• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

H. pylori – это грамотрицательный, факультативно-анаэробный микроорганизм, способный инфицировать слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки. В большинстве случаев инфицирование H. pylori (геликобактериоз, или хеликобактериоз) носит постоянный, хронический характер. Геликобактериоз очень распространен: бактерия H. pylori может быть выявлена у 50 % людей земного шара. При этом H. pylori-ассоциированные заболевания (гастрит, язва желудка или двенадцатиперстной кишки, аденокарцинома желудка, MALT-лимфома) возникают только у 15-20 % инфицированных пациентов. Особенностью этих заболеваний является их благоприятный прогноз при условии их ранней диагностики и полной эрадикации H. pylori. Ведущее значение в диагностике геликобактериоза принадлежит лабораторным методам исследования.

Существует несколько методов выявления H. pylori. Прямые методы позволяют непосредственно выявить сам микроорганизм. Для большинства прямых методов необходим образец ткани слизистой оболочки (биоптат) и/или содержимое желудка и двенадцатиперстной кишки (аспират), которые обычно получают во время эндоскопического исследования. Таким образом, прямые методы исследования, как правило, являются инвазивными. В отличие от этого, непрямые методы выявляют не сам микроорганизм, а косвенные признаки инфекции, например специфические антитела в сыворотке крови (серологические тесты) или содержание меченого атома углерода в выдыхаемом воздухе (дыхательный уреазный тест). Так как для проведения непрямых тестов не требуется эндоскопического исследования, они называются неинвазивными. Как прямые, так и непрямые тесты на H. pylori, имеют свои преимущества и недостатки. Для точной диагностики геликобактериоза требуется сразу несколько тестов. В связи с этим особенно удобным для врача и пациента является комплексный анализ, включающий все необходимые тесты на H. pylori.

Одним из самых чувствительных методов выявления H. pylori является полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (РТ-ПЦР). РТ-ПЦР – это метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в образце ткани) фрагменты генетического материала (ДНК) возбудителя инфекции. Так как анализ основан на выявлении генетического материала, РТ-ПЦР позволяет выявлять присутствие любых форм H. pylori (не только активных спиралевидных, но и неактивных кокковых, некультивируемых), в результате чего исследование характеризуется очень высокой чувствительностью, превосходящей чувствительность метода бактериологического посева. Теоретически для осуществления РТ-ПЦР достаточно присутствие 1 молекулы ДНК. На практике концентрация возбудителя в образце должна составлять около 10-100 КОЕ/мл. Такая высокая чувствительность теста означает, что получение отрицательного результата исследования позволяет исключить H. pylori как причину заболевания. Это имеет принципиальное значение при дифференциальной диагностике НПВС-ассоциированных, стрессовых и ишемических гастритов и язв.

Следует отметить, что, несмотря на очень высокую чувствительность теста (85-98 %), ложноотрицательные результаты все же возможны. Так, например, ложноотрицательный результат может быть получен, если бактериальная нагрузка очень низкая (например, на фоне приема некоторых антибиотиков). Ошибок диагностики можно избежать при комбинации этого прямого теста с серологическими исследованиями.

Инфицирование H. pylori сопровождается значительным нарастанием иммуноглобулинов класса IgG и IgA в сыворотке крови. Эти иммуноглобулины (антитела) определяются в крови с помощью непрямых тестов. IgG обнаруживаются в 95-100 % случаев геликобактериоза, а IgA – в 68-80 %. Исследование позволяет определить титр антител, то есть является количественным. Как правило, высокие титры антител более характерны для активной, текущей инфекции. Следует отметить, однако, что четкой корреляции между титром антител и степенью тяжести инфекции нет.

Серологические тесты, как и метод РТ-ПЦР, имеют некоторые ограничения. Так, результат анализа зависит от особенностей иммунного ответа пациента. Иммунный ответ пациентов, принимающих цитостатические препараты, и пожилых людей характеризуется пониженной выработкой специфических антител (любых, в том числе к H. pylori). По этой причине во избежание диагностических ошибок серологические тесты целесообразно дополнять прямыми тестами. Эта особенность была учтена при составлении комплексного анализа на H. pylori.

Таким образом, комплексный анализ на H. pylori – это комбинация необходимых и достаточных тестов для выявления этого микроорганизма. Комплексный анализ не предназначен для контроля лечения. Результат как РТ-ПЦР, так и исследования иммуноглобулинов IgG и IgA будет оставаться положительными даже в случае полной эрадикации H. pylori. Ложноположительный результат РТ-ПЦР в этом случае обусловлен способностью этого метода выявлять ДНК любых, даже разрушенных микроорганизмов, ложноположительный результат серологических тестов − особенностями динамики иммунного ответа.

Для чего используется исследование?

• Для выявления H. pylori у пациентов с подозрением на гастрит, язву желудка или двенадцатиперстной кишки.

Когда назначается исследование?

• При обследовании пациента с признаками диспепсии: дискомфорт или боли в эпигастральной области, тошнота, рвота, нарушение аппетита.

Что означают результаты?

Для каждого показателя, входящего в состав комплекса:

Статья просмотрена: 34628 раз

Инфекция Helicobacter pylori имеет глобальное значение и широкое распространение в мире, в том числе и в России, где по эпидемиологическим данным инфицированы более 80% взрослого населения. Воспаление слизистой оболочки желудка, вызванное Helicobacter pylori, составляет 90% среди всех форм гастритов. В статье представлены современные методы диагностики хронического Helicobacter pylori -ассоциированного гастрита, основанные на рекомендациях международных консенсусов по диагностике заболеваний, ассоциированных с инфекцией Helicobacter pylori, а также по материалам консенсуса Маастрихт IV (Флоренция, 2010).

Ключевые слова: хронический гастрит, Helicobacter pylori, инвазивные и неинвазивные методы диагностики.

Helicobacter pylori infection is a global concern and widespread in the world, including in Russia, where the epidemiological data are infected with more than 80% of the adult population. Inflammation of the mucous membrane of the stomach caused by Helicobacter pylori, 90% of all forms of gastritis. The paper presents methods of diagnosis of chronic Helicobacter pylori-associated gastritis, based on the recommendations of an international consensus on the diagnosis of diseases associated with infection Helicobacter pylori, as well as based on consensus Maastricht IV (Florence, 2010).

Key words: chronic gastritis, Helicobacter pylori, invasive and non-invasive diagnostic methods.

Хронический Helicobacter pylori (НР)-ассоциированный гастрит — одно из наиболее часто встречающихся гастроэнтерологических заболеваний в связи с тем, что распространенность инфицирования Helicobacter pylori прогрессивно возрастает. В России около 80% случаев хронического гастрита ассоциировано с Helicobacter pylor i [1]. Международное агенство по изучению рака классифицировало Helicobacter pylori как канцероген I класса в отношении рака желудка кишечного типа [2]. Хронический НР-ассоциированный гастрит все чаще выявляется у людей молодого трудоспособного возраста, включая их в группу высокого риска развития рака желудка кишечного типа. Неуклонное прогрессирование атрофии слизистой оболочки желудка у пациентов с хроническим НР-ассоциированным гастритом может привести к развитию дисплазии/неоплазии [3]. Разработка алгоритмов ранней и точной диагностики хронического НР-ассоциированного гастрита позволит улучшить качество лечения и диспансерного наблюдения за данной категорией пациентов.

В соответствии со стандартами диагностики и лечения ассоциированных с H elicobacter pylori заболеваний [4], наиболее точный диагноз хронического НР-ассоциированного гастрита может быть установлен после морфологического исследования биоптатов слизистой оболочки желудка. Такой подход позволяет оценить состояние слизистой оболочки желудка, дать характеристику воспалительного процесса и оценить прогноз развития рака желудка на основании выраженности атрофических изменений слизистой оболочки желудка, что дает возможность клиницисту персонифицировать программу наблюдения больного хроническим НР-ассоциированным гастритом [2].

По требованиям Модифицированной Сиднейской системы для того чтобы правильно интерпретировать состояние слизистой оболочки желудка, необходимо минимум пять биоптатов: 2 из антрального отдела на расстоянии 2-3 см от привратника по большой и малой кривизне, 2 из тела желудка на расстоянии 8 см от кардии по большой кривизне и на 4 см проксимальнее угла по малой кривизне, 1 - из угла желудка [2]. Заключение должно содержать сведения об активности и выраженности воспаления, степени атрофии, метаплазии и о наличии Helicobacter pylori [5]. Современный подход для установления уровня выраженности атрофических изменений слизистой оболочки желудка предполагает определение стадии хронического гастрита согласно современной классификации хронического гастрита OLGA — Operative Link for Gastritis Assessment [6]. Модифицированный вариант OLGA system — Российский пересмотр классификации хронического гастрита был утвержден III Съездом Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009), где для интегральной оценки атрофии слизистой оболочки использована визуально-аналоговая шкала, разработанная в виде таблицы стадий хронического гастрита [7]. Принципиально важным для практического использования предлагаемой оценки стадии хронического гастрита является прогнозирование риска развития рака желудка, возможное на основании оценки лишь атрофических изменений слизистой оболочки, то есть еще до появления признаков эпителиальной дисплазии/неоплазии [7]. Известно, что с нарастанием стадии атрофии увеличивается риск рака желудка кишечного типа, так как на стадии III-IV риск рака желудка кишечного типа возрастает в 6 раз [7]. Следовательно, врач, наблюдающий больного НР-ассоциированным гастритом, должен проводить эрадикационную терапию с целью предупреждения появления атрофических изменений слизистой оболочки желудка.

На этапе диагностики хронического НР-ассоциированного гастрита принципиальное значение имеет выявление этиологического фактора, а именно – Helicobacter pylori [8]. Все методы верификации Helicobacter pylori подразделяют на прямые и непрямые, инвазивные и неинвазивные (Табл.1).

(требуют проведения эндоскопического исследования с прицельной биопсией и дальнейшим изучением гастробиоптатов)

(эндоскопическое исследование не требуется)

• прямые: гистологический метод, молекулярно-генетический метод – ПЦР в биоптате, бактериологический метод;
• непрямые: быстрый уреазный тест (Хелпил-тест).

• Иммунологические методы: исследование кала на наличие антигенов H elicobacter pylori с применением моноклональных антител; серологический метод (выявление антител IgG к H elicobacter pylori)
• биохимический метод: уреазный дыхательный тест с 13 С-мочевиной.

Основой гистологического метода является микроскопическое морфологическое и морфометрическое исследование парафиновых срезов, окрашенных различными способами: гематоксилин-эозином, по Гимзе, толуидиновым синим, по Вартину-Старри и др. При этом специфичность метода составляет 93-94%, чувствительность - 95% [9].

С использованием метода ПЦР возможно выделение высокопатогенных и низкопатогенных штаммов H elicobacter pylori. Это важно для определения прогноза заболевания и эффективности эрадикации. Специфичность метода - 95%, чувствительность - 94% [8,9].

Культуральное исследование и стандартное определение чувствительности H elicobacter pylori к антибиотикам перед терапией первой линии важно проводить в регионах или популяциях с высокой резистентностью к кларитромицину (более 15-20%), если планируется использовать стандартную трехкомпонентную эрадикационную терапию, одним из компонентов которой является кларитромицин. Бактериологический метод с определением чувствительности к антибиотикам также необходимо применять при неэффективности терапии второй линии [10]. Специфичность метода составляет практически 100%, чувствительность — 76-90% [9].

Основой быстрого уреазного теста является определение H elicobacter pylori по уреазной активности микроорганизма в биоптатах слизистой оболочки желудка. H elicobacter pylori продуцирует уреазу, под влиянием которой происходит гидролиз мочевины с образованием иона аммония. При этом увеличивается рН среды, что можно зафиксировать с помощью изменения цвета индикатора. Биоптаты слизистой оболочки желудка помещают в раствор, содержащий мочевину и индикатор, изменение цвета которого косвенно свидетельствует о наличии H elicobacter pylori [8]. Специфичность - 96%, чувствительность - 95% [9].

В клинической практике для выявления H elicobacter pylori используется несколько неинвазивных диагностических тестов. Уреазный дыхательный тест, основанный на определении 13 С-мочевины, является лучшим тестом для диагностики инфекции H elicobacter pylori [10]. Это быстрый и высокоточный метод определения инфицированности H elicobacter pylori слизистой оболочки желудка по уреазной активности микроорганизма: способности уреазы разлагать мочевину до NH 4+ и HCO 3- с последующим образованием из HCO 3- углекислого газа, который, попадая в кровоток, затем выделяется через легкие и может быть определен спектрометром в выдыхаемом воздухе. Специфичность метода - 93-100%, чувствительность - 95-97% [9].

Серологический метод – третий среди неинвазивных диагностических тестов для диагностики инфекции H elicobacter pylori. Учитывая хронический характер инфекции, следует определять только IgG . Предпочтительным методом является иммуноферментный анализ (ИФА). Серологическое определение антител IgG к H elicobacter pylori в сыворотке крови является простым и доступным методом первичного скрининга инфекции [8]. Учитывая, что антитела к H elicobacter pylori сохраняются в течение многих месяцев после эрадикации микроорганизма, использование серологического метода не рекомендуется для оценки эффективности проведения эрадикационной терапии [10].

Врачу, осуществляющему первичную диагностику хеликобактериоза с помощью инвазивных тестов, необходимо помнить, что может быть получен ложноотрицательный результат при низкой плотности обсеменения слизистой оболочки желудка H elicobacter pylori, что часто имеет место на фоне приема ингибиторов протонной помпы (ИПП), антибиотиков и препаратов висмута, а также при выраженном атрофическом гастрите. В таких случаях рекомендуется обязательная комбинация инвазивных методов с определением антител к Helicobacter pylori в сыворотке крови [11].

Гастрин-17 вырабатывается G-клетками антрального отдела желудка, и при атрофии в этом отделе уровень гастрина снижается. В случае атрофического гастрита тела желудка при отсутствии атрофии в антруме содержание гастрина-17 возрастает (> 10 пмоль/л) в связи с включением механизма отрицательной обратной связи регуляции кислотопродукции через гастрин. При атрофии тела желудка снижается уровень сывороточного пепсиногена-I, который продуцируется главными клетками тела желудка. Пепсиноген-II вырабатывается во всех отделах желудка и в двенадцатиперстной кишке, и при атрофическом гастрите тела желудка снижается отношение пепсиноген-I/пеп­синоген-II. Повышение уровня антител IgG к H elicobacter pylori до 42 ЕI U (EIU — иммуноферментные единицы) и более свидетельствует о наличии хеликобактерной инфекции [12].

Основные ссылки

Вы здесь

Чтобы просмотреть текст книги нажмите на нужную главу в оглавлении

Для выбора варианта лечения необходима своевременная и достоверная диагностика Н.Рylori.

Все способы диагностики Н.Pylori, используемые в настоящее время, условно можно разделить на прямые и не прямые (косвенные). На инвазивные и неинвазивные [5, 7]. Инвазивные методы требуют проведения биопсии слизистой оболочки желудка при эндоскопическом обследовании, неинвазивное – не требуюет биопсии. Прямые методы позволяют непосредственно выявить H.Pylori. Косвенные методы регистрируют не саму бактерию, а последствия ее персистирования в организме.

Большинство прямых методов, основаны на инвазивных способах забора материала. Прямая диагностика инфекции H.Pylori, является достаточно трудоемким и отсроченным во времени процессом [13].

После принятия Маастрихтского консенсуса [14] несколько лет в странах Европы существовала концепция "тестирования и эндоскопии" ("testing and endoscopy") [15]. Последняя заключалась в том, что при первичном обращении пациента тестировали на наличие инфекции H. Pylori, и при положительных результатах, обязательно проводили эндоскопическое исследование. Однако, опыт повседневной практики показал неоправданное увеличение количества гастроскопий, которое не компенсировалось положительными эффектами в виде улучшения симптоматики или же повышения качества жизни пациентов. Необходимость в проведении гастроскопии при желудочной диспепсии диктуется онконастороженностью врачей. Вместе с тем, известно, что для пациентов молодого возраста при отсутствии тревожных симптомов в виде потери массы тела или анемии в превалирующем большинстве случаев злокачественные новообразования желудка не характерны. Поэтому для первичных пациентов с язвенной болезнью начали использовать как обязательную концепцию "тестировать и лечить" ("test and treat"), принятую на Маастрихтском консенсусе II в 2000 году [10, 16-19]. Руководящие органы здравоохранения многих стран рекомендуют такой же подход для ведения первичных пациентов молодого возраста. Возрастные границы в рекомендациях варьируют в зависимости от уровня заболеваемости раком желудка в конкретной популяции (таблица 1). Возрастной порог составляет 45 - 55 лет 23.

Таблица 1. Пороговый возраст при использовании концепции "test and treat"

Дуоденальная/желудочная язва (активная или неактивная, включая осложненное течение)

Состояние после резекции желудка по поводу рака

Пациенты, являющиеся родственниками первой линии пациентов с раком желудка

Кого лечить: желательные показания

в соответствии с Маастрихским консенсусом-2

Показания ( H . pylori -пациенты)

В таблице 2 представлены показания, для которых Маастрихским консенсусом-2, предложены желательные показания к назначению антихеликобактерной терапии и степень научной доказанности по результатам проведенного метаанализа литературных данных.

Приведенные рекомендации в большей степени относятся к взрослым, чем к детям, так как такие заболевания как мальтома или рак встречаются в основном у взрослых. Однако атрофические процессы слизистой оболочки желудка у детей под влиянием Нр могут формироваться значительно быстрее, чем у взрослых, что может быть предрасполагающим фактором для развития пролиферативных процессов в слизистой, в том числе и рака желудка уже во взрослом состоянии.

По результатам литературных данных и собственных исследований предложены мероприятия по предупреждению осложнений при Нр-инфекции.

Мероприятия, направленные на предупреждение осложнений Нр-инфекции

- Выявление генетических особенностей микроорганизма Н. pylori

- Выявление генетических особенностей макроорганизма

- Достоверная ранняя диагностика Нр-инфекции

- Определение возможных исходов предполагаемой терапии

- Контроль за проведенной терапией

Из перечисленных выше мероприятий, предупреждающих осложнения Нр, особое значение отводится диагностике Нр-инфекции.

Лабораторная диагностика хеликобактерной инфекции во многих странах мира в настоящее время получила широкое распространение. В России это направление в практическом здравоохранении только начинает внедряться. В связи с чем отсутствие эффективной лабораторной диагностики в стране не позволяет судить о распространенности Нр-инфекции в России среди больных гастродуоденальной патологией и его эпидемиологической значимости. Хотя во многих работах отечественных авторов представлены результаты исследований по этой проблеме, но пока они остаются отчетами исследователей о проделанной работе на небольшой группе пациентов. Решение вопроса об эффективной диагностике Нр затруднено отсутствием единого подхода к выявлению Нр.

Рекомендуемые методы диагностики H . pylori

1. Бактериологический метод

2. Морфологический метод

3. Дыхательный уреазный тест

4. Уреазный тест

5. Молекулярный метод - полимеразная цепная реакция

6. Серологический метод – ИФА

7. Скрининг-методы (основанные на разных принципах работы)

Методы диагностики можно разделить по признаку инвазивности (эндоскопической) при получении материала исследования: инвазивные и неинвазивные.

Методы диагностики H . pylori – 1

· Бактериологический метод (материал – биоптат СОЖ или 12-ти перстной кишки)

· Гистологический метод (материал – биоптат СОЖ или 12-ти перстной кишки)

(материал – биоптат СОЖ или 12-ти перстной кишки)

(материал – биоптат СОЖ или 12-ти перстной кишки, желудочный сок)

· Дыхательный уреазный тест

(материал – выдыхаемый воздух пациента, после приема мочевины меченной изотопами углерода: С 13 , С 14 )

(материал – зубной налет, копрофильтраты)

(материал – сыворотка крови)

Методы диагностики Нр условно можно разделить на прямые, которые определяют возбудитель или его генетический материал, и непрямые (косвенные), которые выявляют продукты метаболизма микроорганизма.

Методы диагностики H . pylori –2

• Бактериологический метод
• Морфологический метод
• Молекулярный метод

• Уреазные тесты

(дыхательный, с биоптатом)

• Серологические методы

Типичные колонии - негемолитические, плоские, реже выпуклые, подобные каплям росы, влажные, прозрачные или полупрозрачные, с блестящей поверхностью на чашке с неселективной средой и с золотисто-желтым отливом на чашке с селективной средой. При микроскопии мазков окрашенных по Граму - клетки H.pylori грамотрицательные, мелкие, изогнутые или спиралевидные. При микроскопии в темном поле клетки H.pylori обладают характерной стремительной подвижностью.

Для изучения чувствительности H.pylori к кларитромицину, амоксициллину и метронидазолу используются следующие тесты: Е-тест, дискодиффузный метод, метод диффузии в агар для определения минимальной поглощающей концентрации (МПК). Несмотря на то, что этот метод самый точный, он редко используется в обычной клинической практике из-за длительности анализа (средняя продолжительность исследования 7 дней), сложности его постановки и высокой цены. Чаще всего бактериологический метод используют в качестве референсного для оценки точности других методов.

Гистологический метод (ГМ) позволяет непосредственно визуализировать Нр. Используя специальные окраски: по Вартину-Старри, Гимзе, Генте можно добиться высокой вероятности микроскопической идентификации микроорганизмов по сравнению с окраской гематоксилином и эозином. Материалом исследования является биоптат СОЖ или ДПК. Преимуществом ГМ является простота исполнения, удобство хранения, транспортировки. При исследовании биоптата возможно определение степени обсемененности: выявление до 20 микроорганизмов в поле зрения - 1 степень, до 50 бактерий – 2 степень, свыше 50 бактерий 3 степень. Кроме этого оцениваются морфологические изменения слизистой оболочки, активность процесса с определением местонахождения полиморфноядерных лейкоцитов. Нейтрофилы могут инфильтрировать собственную пластинку, эпителий, заполнять просветы желез, образуя так называемые ямочные абсцессы. О хронизации процесса свидетельствуют лимфоциты, которые в норме в СОЖ содержатся не более 2-5 в поле зрения (объектив ×40) или 2-3 мононуклеара в одном валике. Наличие даже 1-2 плазмоцитов свидетельствует о хроническом воспалении. Для получения оптимальной информации рекомендуется обязательно проводить множественные биопсии. Их должно быть не менее пяти: по две из антрального отдела (2-3 см от привратника по большой и малой кривизне), по две из тела желудка (по большой и малой кривизне, примерно в 8 см от кардии) и по одной из угла желудка. Биопсии из тела важны при контроле за лечением. При неудачной антихеликобактерной терапии и лечении блокаторами протонового насоса Нр нейтрофилы часто исчезают из антрума, но появляются в теле желудка. Необходимо помнить, что ценность диагностической эндоскопии без правильно взятых биопсий весьма сомнительна, так как сама по себе не способна дать нозологического диагноза. Однако кроме достоинств у гистологического метода есть и свои недостатки: обнаружить Нр удается только на достаточно тонких и хорошо окрашенных средах. Трудно обнаружить Нр при его низкой обсемененности. Сложно отличить кокковую форму Нр от других форм микроорганизмов, которые тоже могут иметь спиралевидную форму.

Цитологический метод является одним из вариантов гистологического исследования. Материалом являются мазки-отпечатки биоптатов СОЖ, взятых при ЭГДС, которые в последующем высушиваются и окрашиваются по методу Романовского-Гимзе.

Возможные морфологические изменения, характерные для инвазии H . pylori .

1. Бактерии образуют межгликокалисные связи с клеточной мембраной без ее нарушения.

2. Плотный контакт бактериальной оболочки и клеточной мембраны вплоть до слияния их мембран.

3. Инвазия бактерии в собственную пластинку СО (как правило возникает при снижении общего иммунитета)

Метод флуоресцентной гибридизации in situ предоставляет возможность совершенствовать морфологическое определение микроорганизма. Для этого исследуемые срезы обрабатывают нуклеотидами с флуоресцентной меткой. Меченые нуклеотиды могут быть подобраны для детекции 16 S рибосомальной РНК (определение Нр) или определения 23 S рибосомальной РНК (выявление резистентности к макролидам).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) впервые была осуществлена в 1985 году на фирме Cetus , а последующее использование в ПЦР термостабильной ДНК-полимеразы существенно расширило возможности её применения в научных целях, и в клинике.

ПЦР метод, который позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации и многократно размножить его. Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК и комплементарного дополнения обеих цепей ДНК. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в том, что, маркировав такими блоками специфический только для данного вида участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок.

Проводятся перспективные исследования по модификации молекулярного метода с появлением новых технологий и современного оборудования. “ Real - time ” ПЦР продолжение совершенствования молекулярной диагностики с использованием прибора типа LightCykler , который позволяет в реальном времени осуществлять детекцию Нр и его мутации, приводящие к резистентности к антибиотикам.

Большое внимание уделяется исследованиям по выявлению ДНК Нр с последующей детекцией из копрофильтратов. Развитие данного направления, в случае получения достоверных результатов, значительно упростило бы диагностику Нр-инфекции с использованием неинвазивного метода. Однако пока существуют технологические трудности разработки данной методики.

1. Дыхательный уреазный тест.

2. Быстрый уреазный тест

Биопсийный материал СОЖ помещается в жидкую среду теста. Стандартной средой для быстрой диагностики Нр является 2% бульон мочевины по Кристенсену. В состав жидкой среды входит мочевина и индикатор. Мочевина ферментируется уреазой H.pylori на аммиак и углекислый газ, вызывая изменение рН среды, в результате чего индикатор окрашивается от желтого до малинового цвета. Экспозиция биоптата в среде занимает от 5 до 25 минут.

Разновидность уреазного теста промышленного изготовления. Представляет собой гелеобразную таблетку, содержащую мочевину, феноловый красный (индикатор рН) и бактериостатический агент. Биоптат помещают на поверхность таблетки. При наличии в исследуемом материале уреазы, мочевина гидролизируется, защелачивая среду. Это приводит к изменению окраски - от желтой до малиновой. Оценка результата проводится через 20 минут.

В основе метода лежит регистрация изотопов углерода С 13 , С 14 в выдыхаемом воздухе. Проба проводится натощак. Перед приемом мочевины, с мечеными углеродами, у пациента отбирают 2 пробы с интервалом в 1 минуту. Затем пациент принимает внутрь лёгкий пробный завтрак и тестируемый субстрат, содержащий мочевину, меченную С 13 , С 14 . В течение 1 часа с интервалом 15 минут собирают 4 пробы выдыхаемого воздуха в специальную пробирку-контейнер. Концентрацию С 13 , С 14 в полученных образцах, исследуют на масс-спектрометре. Полученные данные выражают в процентах и соотносят со степенью инфицированности.

Легкая степень – менее 3,5 % С 13 или С 14 в выдыхаемом воздухе

Средняя степень – 3,5-6,4% С 13 или С 14 в выдыхаемом воздухе

Тяжелая степень – 6,5% - 9,4% С 13 или С 14 в выдыхаемом воздухе

Крайне тяжелая степень – более 9,5% С 13 или С 14 в выдыхаемом воздухе

Нормальным содержанием С 13 или С 14 в выдыхаемом воздухе считается не более 1% от общего содержания СО₂ .

Разновидностью радиоизотопного метода диагностики Нр является определение изотопа N 15 в моче обследуемого. Метод неинвазивный и с высокой чувствительностью и специфичностью, привлекает внимание как перспективный для использования в педиатрии.

Иммунологическая диагностика Helicobacter pylori основывается на определении антител разных классов, которые продуцируются под воздействием антигенов, расположенных на клеточной мембране и жгутиках микроорганизма.

На сегодняшний день разработано большое количество методов серологической диагностики. Разновидностью этих методов является ИФА – иммуноферментный анализ, относительная простота в исполнении которого, позволяет проводить широкие эпидемиологические обследования до начала лечения.

Определение специфических антител к Helicobacter pylori методом ИФА выявляет факт инфицирования не только при манифестных, но и субклинических формах инфекции, а также в стадии ремиссии заболевания. Иммунологические тесты диагностики используются для проведения эпидемиологических исследований и при длительном (на протяжении нескольких лет) наблюдении за больными после лечения. Тест остается положительным после лечения до 6 месяцев. Поэтому для контроля за эрадикацией Нр-инфекции серологические тесты использованы быть не могут.

Оценка результатов анализа:

Результат считается отрицательным , если в верхней контрольной зоне окна видна только одна красно-фиолетовая полоса, демонстрирующая пригодность реагентов набора к работе.

Результат считается положительным , если в нижней тест-зоне окна появляется вторая красно-фиолетовая полоса, свидетельствующая о присутствии в образце Ig G -антител к H.pylori. Причем, даже слабоокрашенная полоса указывает на положительный результат.

Результат считается неопределенным , если отсутствует полоса в контрольной зоне.

Лабораторно-диагностические методы позволяют не только определить одну из причин гастродуоденальной патологии, но и контролировать эффективность лечения, оценивать эрадикацию возбудителя. Оценивая информативность, доступность и экономические затраты на проведение различных методов диагностики, небходимо отметить, что следует руководствоваться принципом выбора метода, который с большой вероятностью даст точный результат за короткое время, или если есть возможность сочетания методов, информационно дополняющих друг друга.

Таким образом, диагностика Нр-инфекции является необходимым этапом в работе с пациентом, страдающим гастродуоденальной патологией, ассоциированной с Нр-инфекцией. С позиции доказательной медицины эффективность эрадикации Нр необходимо подтверждать лабораторно-диагностическими методами. Широкое внедрение диагностических тестов в практическую медицину для детекции Нр-инфекции даст возможность разрабатывать профилактические мероприятия, направленные на снижение заболеваний, ассоциированных с Нр-инфекцией у детей и взрослых. Перспективный подход в диагностике данной инфекции, вероятно, будет включать не только определение возбудителя и его особенностей (генетические и как следствие биохимические свойства), но и состояние макроорганизма, его иммунологический статус. Дальнейшие исследования по оптимизации диагностических комбинаций позволят упростить контроль за одной из широко распространенных инфекций человечества.