Анализ крови на риккетсиоз

При укусе клещи могут передавать человеку возбудители ряда заболеваний, в том числе и риккетсий — возбудителей клещевых риккетсиозов. До недавнего времени считалось, что на территории Западной Сибири единственным распространенным клещевым риккетсиозом является сибирский клещевой тиф, этиологическим агентом которого является Rickettsia sibirica. Однако в 2014 году на Алтае был отмечен случай риккетсиоза, вызванный видом Rickettsia heilongjiangensis, являющимся возбудителем дальневосточного клещевого риккетсиоза.

Новосибирские ученые в 2016 году провели исследование пациентов, попавших в инфекционную больницу после укусов клещей. В 2017 году результаты исследований легли в основу научной работы. У семи пациентов был выявлен возбудитель клещевого сыпного тифа и у трех пациентов была обнаружена ДНК риккетсий вида Rickettsia raoultii. Этот вид риккетсий широко распространен в клещах в азиатской части России, однако в образцах пациентов на территории России он был выявлен впервые.

В клещах риккетсии вида Rickettsia raoultii выявляют с 1999 года, и впервые они выявлены на территории России. До недавнего времени этот вид считался непатогенным. В 2012 году эти риккетсии были обнаружены у пациентов в Китае. Есть данные о возможной причастности этих риккетсий к заболеваниям у людей в Европе.

К сожалению, в большинстве случаев клещевых риккетсиозов не проводится определение вида риккетсий, вызвавших заболевание. Определить вид патогена можно при использовании ПЦР с последующим секвенированием. А в больницах диагноз риккетсиоз чаще всего ставится на основе клинических проявлений, поскольку большинство клещевых риккетсиозов имеют характерную симптоматику. Вполне возможно, что данный клещевой риккетсиоз и раньше существовал на территории области, просто из-за нетипичной симптоматики его не выявляли. Более того, возможно, что распространение данного клещевого риккетсиоза не ограничивается Новосибирской областью. В этом году мы выявили R. raoultii у пациента, которого клещ укусил на Алтае, — рассказала сотрудник лаборатории терапевтических белков и антител и инженер лаборатории молекулярной микробиологии ИХБФМ СО РАН Яна Иголкина.

Она отметила, что риккетсиоз, вызванный Rickettsia raoultii, протекал мягче, чем сибирский клещевой тиф: у пациентов наблюдалось лишь небольшое повышение температуры (до 37,7oС), у одного пациента отмечался кратковременный менингеальный синдром. Поскольку у пациентов не наблюдалось таких типичных для клещевых риккетсиозов симптомов, как сыпь и первичный аффект, диагноз клещевой риккетсиоз им поставлен не был. Все пациенты, у которых была обнаружена ДНК риккетсий, получили курс антибиотиков и выздоровели.

Поскольку риккетсиозы, вызванные Rickettsia raoultii, могут протекать без выраженных симптомов, число случаев заболеваний, вызванных этим возбудителем, может быть значительно больше. В связи с этим при наличии у пациентов нетипичной симптоматики после укусов клещами, по мнению ученых, следует проверять их на наличие риккетсиозной инфекции.

В этом году мы продолжили исследование пациентов и нашли еще несколько случаев инфекций, вызванных Rickettsia raoultii. (Это еще неопубликованные денные, поэтому пока точных данных нет). Ученые сейчас пытаются подтвердить, что Rickettsia raoultii является возбудителем клещевого риккетсиоза у людей в Новосибирской области, а также изучить клинические проявления заболевания и его распространение на территории Сибири, — резюмировала Яна Иголкина.

Справка: Клещевые риккетсиозы представляют собой острые инфекционные заболевания, заражение которыми происходит трансмиссивным путем, то есть через укусы клещей, содержащих в себе возбудителя болезни. Возбудителем болезни считаются облигатные внутриклеточные паразиты риккетсии (Rickettsia), занимающие промежуточное положение между бактериями и вирусами, относящиеся к биологической группе КПЛ (клещевой пятнистой лихорадки). Риккетсии длительное время могут находиться и передаваться по наследству в основных распространителях инфекции — иксодовых клещах, которые относятся к трем родам: Haemaphysalis, Dermacentor, Hyalomma. Носителями инфекции могут также являться сельскохозяйственные и дикие копытные животные, мелкие грызуны.

Лабораторное серологическое исследование, направленное на диагностику эпидемического сыпного тифа и болезни Брилла, представляющей рецидивную форму заболевания.

Риккетсии Провачека; эпидемический сыпной тиф; болезнь Брилла – Цинссера.

Синонимы английские

Rickettsia prowazekii; epidemic typhus; Briell-Zinser disease; reaction passive or indirect hemagglunation.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Эпидемический сыпной тиф (классический, вшивый, европейский) – это острая антропонозная трансмиссивная инфекция, поражающая людей любого возраста и характеризующаяся характерными клиническими проявлениями. Возбудителем инфекции является неподвижный грамотрицательный микроорганизм Rickettsia prowazekii, риккетсии Провачека, семейства Rickettsiaceae, рода Rickettsia. Они являются преимущественно внутриклеточными паразитами, выделяют гемолизины, эндотоксины.

Инфекция передается преимущественно трансмиссивным путем передачи от больного человека платяными или головными вшами, которые выделяют риккетсии с инфицированными экскрементами. В организм человека возбудители попадают через поврежденные кожные покровы, в результате расчесов и раздавливания насекомых, а также через слизистую оболочку верхних дыхательных путей и конъюнктиву глаз.

Инкубационный период заболевания длится от 5 до 25 дней, в среднем составляет 10-14 дней. Основными клиническими проявлениями сыпного тифа являются лихорадка в течение 3-4 дней без тенденции к снижению, головная боль, гепатоспленомегалия, нарушение сна, тошнота, поражение сердечно-сосудистой системы, генерализованное поражение сосудов кожи и слизистых оболочек. На слизистой оболочке мягкого неба возможно появление сыпи (энантемы) или кровоизлияний, характерная сыпь на конъюнктиве. На 4-5-й день болезни у 90 % больных появляется характерная петехиальная сыпь на боковых поверхностях туловища, спине, подмышечных областях, на сгибательных поверхностях предплечий. Для данной инфекции также характерно поражение сосудов центральной нервной системы с вовлечением серого вещества, проявляющееся нарастающей головной болью, бредом, возбуждением, наличием менингеальной симптоматики, присоединением менингоэнцефалита. Различают легкую, средней тяжести и тяжелую форму заболевания. Возможно развитие стертой и латентной форм. Болезнь Брилла – Цинссера представляет собой рецидивную форму эпидемического сыпного тифа. Она имеет сходную клиническую картину, как и при первичной инфекции, но с менее выраженной интенсивностью патологичных симптомов.

Диагностика заболевания основывается на данных эпидемиологического исследования, специфических клинических проявлениях и на оценке лабораторных данных. В клиническом анализе крови отмечается лейкоцитоз с нейтрофильным сдвигом лейкоцитарной формулы. Возможно повышение скорости оседания эритроцитов.

Большое значение в лабораторной диагностике активных форм сыпного тифа и болезни Брилла – Цинссера имеет серологическая диагностика. Она заключается в определении специфических антител с помощью реакции пассивной, или непрямой, гемагглютинации (РПГА). Данная реакция основана на склеивании антигенов (клеток или частиц-носителей антигена) при взаимодействии со специфическими антителами к этим антигенам. Рекомендуется выявление нарастания титра специфических антител в парных сыворотках, взятых на 6-7-й день болезни и через 12-20 дней (в среднем через две недели) от ее начала. У больных сыпным тифом диагностический титр антител составляет 1:1000 и определяется к концу первой недели заболевания, достигая максимума к 15-му дню с возрастанием титров антител 1:32000-1:64000. Для болезни Брилла – Цинссера также характерно нарастание титра специфических антител в РПГА с сыпнотифозным диагностикумом риккетсий Провачека (Rickettsia prowazekii).

Для чего используется исследование?

Для диагностики активных форм эпидемического сыпного тифа;
для диагностики болезни Брилла – Цинссера – рецидивной формы эпидемического сыпного тифа.

Когда назначается исследование?

При клинических проявлениях и подозрении на эпидемический сыпной тиф и болезнь Брилла – Цинссера: лихорадка, головная боль, гепатоспленомегалия, нарушение сна, тошнота, поражение сердечно-сосудистой системы, генерализованное поражение сосудов кожи (петехиальная сыпь на боковых поверхностях туловища, спине, подмышечных областях, на сгибательных поверхностях предплечий) и слизистых оболочек (мягкого неба и конъюнктивы), поражение центральной и периферической нервной системы, менингоэнцефалит;
для оценки диагностического титра антител в начале заболевания и его нарастания на 14-15-й день болезни;
в комплексной диагностике эпидемического сыпного тифа и болезни Брилла – Цинссера.

Что означают результаты?

Причины положительного результата (повышение титра):

эпидемический сыпной тиф, активная форма;
болезнь Брилла – Цинссера, активная форма;
текущее инфицирование возбудителем Rickettsia prowazekii или перенесенная ранее инфекция, протекающая в латентной форме.

Причины отрицательного результата:

отсутствие инфицирования возбудителем Rickettsia prowazekii;
ранние сроки заболевания эпидемическим сыпным тифом, первые 6-7 дней от момента инфицирования возбудителем;
ложноотрицательные результаты.

Что может влиять на результат?

Форма заболевания, период заболевания от момента инфицирования.

Для комплексной оценки полученных результатов их необходимо сопоставлять с эпидемиологическими, клиническими и другими лабораторными данными.

22 Лейкоцитарная формула

43 Белок общий в ликворе

25 Глюкоза в ликворе

Кто назначает исследование?

Инфекционист, кардиолог, невролог, офтальмолог, оториноларинголог, дерматолог, терапевт, врач общей практики.

Литература

Покровский В.И., Творогова М.Г., Шипулин Г.А. Лабораторная диагностика инфекционных болезней. Справочник / М. : БИНОМ. – 2013.
Шувалова Е.П. Инфекционные болезни / М.: Медицина. – 2005. – 696 с.
Fauci, Braunwald, Kasper, Hauser, Longo, Jameson, Loscalzo Harrison’s principles of internal medicine, 17th edition, 2009.

Полный текст:

1. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Гранитов В.М., Арсеньева И.В., Тарасевич И.В., Fournier P.-E. и др. Выявление альфа1-протеобактерий в иксодовых клещах и образцах от больных в России. Омский научный вестник. 2006; 3 (37): 32 - 37.

2. Mediannikov O.Yu., Sidel’nikov Yu., Ivanov L., Mokretsova E., Fournier P.-E., Tarasevich I. Acute tick-borne rickettsiosis caused by Rickettsia heilongjiangensis in Russian Far East. Emerg. Infect. Dis. 2004; 10 (5): 810 - 817.

3. Гранитов В.М., Арсеньева И.В., Бесхлебова О.В., Дедков В.Г., Карань Л.С., Васильева О.А., Шпынов С.Н. Первый клинический случай клещевого риккетсиоза, вызванного Rickettsia heilongjiangensis, на территории Сибири. Инфекционные болезни. 2014; 12 (3): 91 - 94.

5. Jia N., Jiang J.F., Huo Q.B., Jiang B.G., Cao W.C. Rickettsia sibirica subspecies BJ-90 as a cause of human disease. N. Engl. J. Med. 2014; 369 (12): 1176 - 1178.

6. Рудаков Н.В., Шпынов С.Н., Решетникова Т.А., Пеньевская Н.А., Абрамова Н.В., Кумпан Л.В. Новые данные о патогенности Rickettsia sibirica subsp. BJ-90. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014; 5: 10 - 13.

8. Shpynov S.N., Fournier R-E., Rudakov N.V., Samoylenko I.E., Reshetnikova T.A., Yastrebov V.K. et al. Molecular identification of a collection of spotted fever group rickettsiae obtained from patients and ticks from Russia. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2006; 74 (3): 440 - 443.

9. Еремеева М.Е., Шпынов С.Н., Токаревич Н.К. Современные подходы к лабораторной диагностике риккетсиозов. Инфекция и иммунитет. 2014; 4 (2): 113 - 34.

10. Рудакова С.А., Коломеец А.Н., Самойленко И.Е., Кузьминов А.М., Рудаков Н.В. Экспресс-индикация трансмиссивных патогенов как основа дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Бюллетень СО РАМН. 2007; 4: 116 - 119.

11. Методические рекомендации. Эпидемиологический надзор за клещевым риккетсиозом. Иммунодиагностика заболевания и методы выявления возбудителя, утв. Минздравом СССР 22.10.91.

13. Brouqui R, Bacellar F., Baranton G., Birtles R.J., Bjodorff A., Blanco J.R. et al. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10: 1108 - 1132.

14. Абрамова Н.В., Рудаков Н.В., Пеньевская Н.А., Седых Н.Н., Кумпан Л.В., Самойленко И.Е. и др. Апробация иммуноферментного анализа для серологической диагностики инфекций, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2010; 1 (50): 17 - 22.

15. Рудаков Н.В., Абрамова Н.В., Пеньевская Н.А., Самойленко И.Е., Шпынов С.Н., Решетникова Т.А. Способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза с использованием иммуноферментного анализа для определения антител к антигену Rickettsia sibirica. Патент РФ № 2477860 от 20.03.2013 г.

16. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Тарасов В.А., Rarola R, Raoult D. Генотипирование риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в клещах рода Dermacentor на территориях Омской и Новосибирской областей. Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы 2-й Регион. научно-практ. конф., посвящ. 80-летию ОГМА. Омск; 2001: 290 - 294.

17. Иголкина Я.П., Фоменко Н.В., Ливанова Н.Н., Астанин В.Б., Гостеева Л.А., Черноусова Н.Я., Рар В.А. Выявление различных видов риккетсий у иксодовых клещей, в крови людей и мелких млекопитающих на юге Западной Сибири и на Урале. Бюллетень сибирской медицины. 2006; 5 (1): 121 - 125.

18. Пуховская Н.М., Рар В.А., Иванов Л.И., Высочина Н.П., Иголкина Я.П., Фоменко Н.В. и др. Выявление методом ПЦР возбудителей природно-очаговых инфекций, переносимых клещами, на полуострове Камчатка. Мед. паразитол. и паразит. болезни. 2010; 4: 36 - 39.

19. Григорьева Я.Е., Карань Л.С., Рудакова С.А., Федорова М.В., Журенкова О.Б., Скрынник С.М. и др. Разработка набора реагентов для дифференциальной детекции патогенных риккетсий РРВ-ПЦР. Молекулярная диагностика. 2014; 1: 518, 519.

20. Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В., Горелова И.Б., Воробьева И.Н. Микроорганизмы порядка Rickettsiales у таежного клеща

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

Фото Олега Кузьмина

В этом году центр гигиены и эпидемиологии Красноярского края ввел дополнительные исследования клещей – на риккетсиоз и бабезиоз. По словам специалистов, опасность заразиться этими инфекциями у жителей края также существует. Всего сейчас делают исследования на шесть заболеваний, в том числе клещевой энцефалит.

Как же обезопасить себя от членистоногих, присасывание которых может иметь серьезные последствия?

Осторожней на платформе

Специалисты уже отчитались о том, что на площади около 213 га были проведены акарицидные обработки, но это не отменяет необходимость строго исполнять все правила безопасности. Тем более собираясь на дачу или в лес. Верхнюю часть одежды следует заправить в брюки, манжеты рукавов должны плотно прилегать к руке. На голову лучше надеть капюшон, плотно пришитый к куртке. Клещи находятся в лесной подстилке, на траве – очень редко они поднимаются на высоту более 70 сантиметров. Вспомните об этом, когда соберетесь расстелить покрывало на траве и посадить туда ребенка.

Не выше травы

В управлении Роспотребнадзора по Красноярскому краю считают, что зачастую люди, выезжая за город, ведут себя очень беспечно и дают возможность клещу присосаться:

– Осматривать себя нужно не только после того, как пришли домой. Это необходимо делать еще на даче или в лесу через определенные интервалы времени: он ползет снизу вверх очень долго, пока не найдет открытый участок тела. Если правильно одеться и применить необходимые репелленты, то вероятность укуса значительно снижается. Не стоит надеяться, что иммуноглобулин обеспечит полную безопасность, – это препарат, к которому нужно относиться с осторожностью и без крайней необходимости не принимать.

К сожалению, многие уповают именно на него, покупая страховку. Но не все знают, что иммуноглобулин изготавливается на основе донорской крови. Ее сдают люди, уже переболевшие энцефалитом, имеющие в организме соответствующие антитела. Применение может быть небезопасным, особенно для людей, имеющих аллергические реакции на введение препаратов крови человека.

Врачи рекомендуют вводить иммуноглобулин не позднее 72 часов с момента укуса. Позже уже бесполезно. Вирус попадает в кровь сразу после присасывания клеща, и смысл в иммуноглобулине есть только на этом этапе. Когда через несколько дней вирус начинает внедряться в клетки нервной системы и поражать их, антитела сыворотки будут уже бессильны.

Врачи рекомендуют выработать собственные антитела к энцефалиту с помощью вакцинации. Это надежный способ защититься от одного из самых опасных заболеваний, переносчиком которого является клещ.

Где сделают анализ?

Чем раньше вы осторожно вытащите присосавшегося клеща, тем меньшая порция вируса попадет в организм.

Снятого клеща необходимо поместить в емкость на ватный диск, смоченный водой (высохшие насекомые на исследование не принимаются), и плотно закрыть крышку. В тот же день нужно постараться доставить его на исследование. Если сразу приехать не получается, хранить емкость нужно в дверце холодильника.

В Красноярском крае начали работу пункты приема клещей по следующим адресам:

– Красноярск, ул. 26 Бакинских Комиссаров, 29;

– Ачинск, ул. Толстого, 23;

– Лесосибирск, ул. Мира, 5;

– Минусинск, ул. Комарова, 1;

– Шарыпово, 2-й мкр-н, 8/4;

– Канск, ул. Эдеймана, 9;

– Заозерный, ул. Мира, 54, пом. 27;

– Балахта, ул. Советская, 113а.

ВАЖНО

Задать вопрос по профилактике клещевого энцефалита специалистам управления Роспотребнадзора по Красноярскому краю можно по телефону горячей линии 8 (391) 226-89-50 с 10:00 до 12:00 и с 13:00 до 16:00. Линия работает каждый день до 15 мая.

СПРАВКА

Риккетсиоз – острое инфекционное заболевание, характеризующееся лихорадкой и сыпью. Осложнения – бронхиты, ларингиты.

Бабезиоз – острое инфекционное заболевание человека и животных, характеризующееся интоксикацией, лихорадкой, развитием анемии. Может осложниться острой почечной недостаточностью.

Эксперты спрогнозировали раннюю активность клещей в Красноярском крае

Эксперты предупредили: в крае сохраняется опасность присасывания клещей

Четверть клещей в Красноярском крае оказались зараженными боррелиозом

Активность клещей на территории Красноярского края продолжает снижаться

РНГА с сыпнотифным диагностикумом (anti-Ricketsia prowazeki)

Исследование предназначено для определения наличия в крови пациента специфических антител к Ricketsia prowazeki - возбудителю сыпного тифа. Анализ является серологическим маркером болезни Брилла-Цинссера (спорадического сыпного тифа).

Серологический анализ проводится методом РНГА (реакцией непрямой гемагглютинации). В лунках лабораторной планшетки серолог разводит исследуемую сыворотку с поэтапным удвоением. Затем добавляет в образцы стандартные эритроциты, сенсибилизированные риккетсиями. При наличии в пробах иммунных антител к антигену возбудителя инфекции, эритроциты слипаются и равномерно покрывают все дно лунки – реакция считается положительной, при отрицательной реакции эритроциты располагаются на дне в виде маленькой пуговки.

Подготовка к исследованию:

Анализ проводится утром, натощак.
С последнего приема пищи должно пройти не менее 8 часов.
Исключить прием алкоголя не менее чем за 24 часа до взятия биоматериала.
Не рекомендуется сдавать кровь на серологию после флюорографии, рентгена, физиотерапевтических процедур.

Тип биоматериала: венозная кровь

Синонимы (rus): Серодиагностика с эритроцитарным сыпнотифозным (риккетсиозным Провачека) диагностикумом

Синонимы (eng): Detection of anti-typhus Рrowazeki antibodies in patient serum

Методы: Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Сроки выполнения: 7-8 дней

Сыпным или вшивым тифом называют острую инфекцию, вызываемую внутриклеточными паразитами - риккетсиями провачека (Ricketsia prowazeki). Это название мелкая грамотрицательная бактерия, унесшая миллионы жизней, получила по фамилиям двух ученых, разгадавших тайну смертельного заболевания - американского биолога Говарда Тейлора Риккетса и чешского естествоиспытателя Станислава Провачека.

Источник инфекционного процесса - больной человек, от которого заражение передается здоровому человеку платяными и головными вшами. Расчесывая укусы этих специфических паразитов, человек втирает их экскременты, содержащие риккетсии, в клетки кожных покровов. Сыпной тиф распространяется из-за плохих социальных условий, скученности, тесноты. Именно поэтому наиболее страшные эпидемии инфекции возникали в военное время и при стихийных катастрофах.

После выздоровления у человека вырабатывается иммунный барьер к возбудителю, однако он способен сохраняться в организме длительный период и спустя много лет рецидивировать. Повторный сыпной тиф имеет те же клинические проявления, но в более легкой форме. При заражении риккетсиями в организме продуцируются специфические антитела, концентрация которых нарастает с каждой неделей заболевания и остается повышенной длительный период. Для эндогенной рецидивирующей инфекции (болезни Брилла) также характерно выраженное повышение уровня иммунных антител.

Опытные инфекционисты проводят серологическое исследование при наличии у пациента:

сильной головной боли;
высокой температуры (до 40°С);
бессонницы, раздражительности;
потери аппетита;
характерных высыпаний на коже - на боках туловища и сгибах конечностей;
симптомов поражения сердечной, нервной и сосудистой систем - учащенное сердцебиение, снижение кровяного давления, нарушение сознания.

Негативная РНГА считается отрицательным результатом - заражения риккетсиями нет. Положительным результатом считается диагностический титр 1:640 - текущий или перенесенный в прошлом риккетсиоз (сыпной или спорадический тиф).

Рекомендовано проводить РНГА - исследование в парных образцах биоматериала: первое - на седьмой день инфекционного процесса, второе - спустя две недели.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СЫПНОГО ТИФА

Методические указания об иммунологических способах диагностики риккетсиозов, составленные К.Н. Токаревичем и Л.Д. Васильевой, были изданы институтом в 1960 и 1961 годах. С тех пор накоплен большой дополнительный материал, характеризующийся введением в практику все более чувствительных и специфических методик.

В связи с эпидемиологическим и клиническим своеобразием спорадических случаев сыпного тифа (болезни Брилля-Цинссера) современные лабораторные методы диагностики этой инфекции приобрели особенно важное значение . Они позволяют не только надежно подтверждать сыпнотифозную природу заболеваний, но и решать важные вопросы эпидемиологического характера, например, выявление источника инфекции, обнаружение зараженных переносчиков, дифференцирование эпидемического (передающегося через вшей) и спорадического (рецидивного) сыпного тифа, определение иммунной прослойки к сыпному тифу среди населения и т.д. Этим способам и посвящено настоящее издание.

I. ВЫДЕЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЫПНОГО ТИФА ОТ БОЛЬНЫХ

Возбудитель сыпного тифа - риккетсии Провачека может быть обнаружен в крови заболевшего в последние дни инкубации, в продроме и в течение всего лихорадочного периода; риккетсии исчезают из крови после падения температуры, в первые дни реконвалесценции, когда в крови больного специфические антитела достигают высокой концентрации. Наибольшее количество риккетсий циркулирует в крови в первые дни лихорадки и поэтому ранние сроки заболевания особенно перспективны для выделения возбудителя.

Риккетсии Провачека - облигатные внутриклеточные паразиты; они не растут на обычных питательных средах и могут размножаться лишь в живых или переживающих клетках. Выделение возбудителя из крови больного производят путем заражения восприимчивых лабораторных животных, обычно морских свинок, или при помощи инфицирования вшей, выращенных в лаборатории.

а) Выделение возбудителя при помощи

биологической пробы на морских свинках

Морским свинкам весом 250 граммов, которым предварительно в течение нескольких дней проверяют температуру, вводят внутрибрюшинно дефибринированную кровь больного в объеме 3 - 5 мл или взвесь в физиологическом растворе сгустка свернувшейся крови в том же объеме. (Сыворотка, отделенная от сгустка, может быть использована для иммунологического исследования.)

При наличии риккетсии Провачека в исследуемой крови подопытные морские свинки начинают лихорадить спустя примерно 5 - 15 дней и при этом теряют в весе. Лихорадочное состояние животных, хорошо воспроизводимое в цепи пассажей, продолжается от 2 - 3 до 8 - 10 дней. Ежедневное термометрирование свинок проводится ректально специальным термометром в течение 30 дней.

Длительность инкубации и лихорадочного периода, а также высота лихорадки зависят в основном от концентрации возбудителя в исследуемой крови больного.

Для подтверждения сыпнотифозной природы лихорадки у животного, после падения температуры, через 3 - 4 недели после заражения, морских свинок исследуют серологически. Наличие комплементфиксирующих антител или агглютининов к риккетсиям Провачека убеждает в специфичности заболевания. Риккетсиальная этиология перенесенной экспериментальной инфекции может быть подтверждена также испытанием иммунности свинок путем заражения их риккетсиями Провачека спустя полтора-два месяца после прекращения лихорадки.

Поддержание возбудителя на животных производится путем пассажей мозговой тканью. С этой целью морскую свинку забивают на высоте лихорадки, из черепной коробки стерильно извлекают мозг и подвергают его гомогенизации в физиологическом растворе (обычно в банке со стеклянными бусами). Введение внутрибрюшинно 1 - 2 мл 10-процентной мозговой взвеси здоровым животным воспроизводит лихорадку у последних.

При экспериментальной сыпнотифозной инфекции возбудитель визуально не обнаруживается в мазках-отпечатках из органов морских свинок. Только при внутрибрюшинном введении им концентрированных взвесей риккетсий Провачека (например, из инфицированных вшей или легких интраназально зараженных мышей) удается вызвать у животных перитонеальный риккетсиоз, а у самцов периорхит. В этих случаях в мазках-отпечатках из туника вагиналис или из соскоба с брюшины удается обнаружить возбудителя. Для сохранения и выделения риккетсий в визуальной форме мозговой взвесью лихорадящей морской свинки заражают куриные эмбрионы, белых мышей (интраназально), поддерживаемых в лаборатории вшей или культуру ткани.

б) Выделение риккетсий Провачека путем заражения переносчика

Платяная вошь является переносчиком риккетсий Провачека. Возбудитель сыпного тифа вызывает заболевание этих насекомых, заканчивающееся их гибелью. Вошь, напитавшаяся кровью сыпнотифозного больного в период риккетсиемии, уже в первые дни становится заразной. На второй-третий день после заражения при помощи иммунлюминесцентного метода (см. ниже) удается уже обнаружить в мазках из кишечников вшей единичные риккетсии. В дальнейшем наблюдается интенсивное размножение этих микроорганизмов, причем на 5 - 6 день после кровососания риккетсии в кишечнике обнаруживаются в больших количествах. Максимальное накопление их наблюдается на 8 - 10 день. Размножение возбудителя в эпителиальных клетках кишечника насекомых приводит к разрушению инфицированных клеток, что вызывает нарушение процесса пищеварения. Нередко за 1 - 2 дня до гибели вошь приобретает красный цвет вследствие проникновения крови через разрушенные клетки кишечника в полость тела. В мазках-отпечатках из кишечников больных вшей при окраске по Романовскому-Гимза или по Здродовскому обнаруживается огромное количество риккетсий Провачека в виде полиморфных, главным образом палочковидных образований. Быстрота развития риккетсиоза у вшей, так же как и гибель насекомых, зависят от интенсивности риккетсиемии у больных людей. Выделение возбудителя из крови больного может быть проведено путем непосредственного кормления лабораторных насекомых на больном.

При необходимости исследования вшей, снятых с больного или собранных в его окружении, выделение возбудителя может быть проведено двумя способами: внутрибрюшинным заражением морских свинок взвесью растертых насекомых или заражением этой же взвесью лабораторных ("паспортных") вшей. Последнее осуществляется при помощи вскармливания однодневных личинок вшей через эпидермомембрану по Пшеничнову или же по методу Вейгля (при помощи микроклизм). В дальнейшем наблюдение за насекомыми проводят при помощи микроскопии окрашенных препаратов из кишечника последних.

Приведенное краткое описание приемов выделения культуры риккетсий Провачека из крови больных показывает сложность применяемых для этого методик, которые могут быть осуществлены только в обстановке специальных лабораторий.

Метод биопроб на морских свинках довольно широко применялся для выявления возбудителя в начале изучения сыпного тифа в эпоху эпидемического его распространения при классических формах этой инфекции. При заражении животных кровью таких больных на ранних днях болезни удавалось весьма часто воспроизводить экспериментальную инфекцию у морских свинок. При спорадическом же сыпном тифе (болезни Брилля) биологические пробы на морских свинках в очень редких случаях бывают положительными.

Более эффективным методом является вскармливание переносчика на больном в первые дни лихорадки. Однако и при этом способе у больных болезнью Брилля удается обнаружить риккетсии только при тяжелых формах заболеваний. При этом вследствие низкой концентрации риккетсий в крови больных в большинстве случаев при болезни Брилля удается обнаруживать их во вшах лишь после пассажа через эпидермомембрану.

Культивирование риккетсий Провачека в лабораториях необходимо для приготовления диагностикумов и вакцин, а попытки выделения новых штаммов не потеряли своего значения и в настоящее время для изучения их биологических особенностей.

II. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СЫПНОГО ТИФА

Из иммунологических способов диагностики риккетсиозов в настоящее время ведущее место занимают серологические.

При сыпном тифе серологический анализ используют как для распознавания заболеваний, так и для решения эпидемиологических вопросов, связанных с данной инфекцией.

Основным методом серодиагностики сыпного тифа является реакция связывания комплемента, которая характеризуется высокой специфичностью. Используют также реакцию агглютинации риккетсий и реакцию непрямой гемагглютинации. Постановка этих серологических проб предусмотрена отечественными официальными инструкциями. Они должны применяться в лабораториях инфекционных больниц и санэпидстанций. Согласно утвержденным Минздравом СССР Инструктивно-методическим указаниям (N 310 от 23.04.1968) с целью наиболее полного выявления больных сыпным тифом серологическому обследованию должны подвергаться:

лица, лихорадящие в течение 5 дней и более с диагнозами, не позволяющими полностью отвергнуть сыпной тиф;

провизорно госпитализированные с подозрением на сыпной тиф;

лица, бывшие в контакте с заболевшими сыпным тифом, в том числе:

а) при отсутствии у них педикулеза - перенесшие в течение последних 3-х месяцев какое-либо лихорадочное заболевание;

б) при наличии педикулеза - все находившиеся в контакте с больными сыпным тифом.

У сыпнотифозных больных, не леченных антибиотиками, специфические антитела в крови могут быть обнаружены в невысоких титрах начиная с 5 - 7 дня болезни; к 10 дню они могут быть выявлены почти у всех больных, причем титры антител достигают наивысшего уровня к 15 - 20 дню от начала лихорадки, после чего постепенно снижаются. При получении негативного ответа или положительной реакции в низких титрах при первом обследовании серологическое исследование необходимо повторить через 3 - 5 дней.

Кроме перечисленных серологических реакций, для серодиагностики сыпного тифа используют иммунлюминесцентный метод исследования, а также реакцию преципитации. Весьма чувствительной пробой является реакция нейтрализации токсической субстанции риккетсий, позволяющая выявлять наличие в крови больных и болевших вируснейтрализующих антител. Эта реакция может быть применена лишь в специализированных лабораториях, т.к. она ставится с живыми риккетсиями, содержащими токсическое вещество.

Для серологических исследований кровь берут в стерильную пробирку из локтевой вены в количестве 3 - 5 мл. Ее свертывают в термостате при 37° в течение 15 - 30 минут, а для отстаивания сыворотки пробирку помещают в комнатный холодильник. В тех случаях, когда взять кровь из вены не удается (например, у детей), кровь берут из пальца.

Кончик пальца протирают спиртом и прокалывают иглой, кровь набирают микропипеткой 0,2 мл и вносят в пробирку с 1,8 мл стерильного физиологического раствора, содержащего 0,25% лимоннокислого натрия, что соответствует разведению сыворотки 1:10. Для осаждения форменных элементов взвесь центрифугируют при 1 - 2 тысячах об . / м ин. в течение 5 - 10 минут или оставляют в рефрижераторе до следующего дня.

При невозможности проведения исследований на месте сыворотки пересылают в лабораторию в запаянных ампулах.

Сыворотки могут быть доставлены также и в высушенном виде на фильтровальной бумаге или на стекле. В первом случае 0,2 - 0,4 мл прозрачной (не содержащей эритроцитов) сыворотки наносят градуированной пипеткой на фильтровальную бумагу и высушивают при комнатной температуре. В лаборатории участок бумаги с нанесенной сывороткой вырезают, измельчают ножницами и помещают в пробирку с физиологическим раствором, взятым в таком объеме, чтобы получить исходное разведение сыворотки 1:10. В термостате при 37° в течение часа происходит полное растворение сыворотки; ее отсасывают и используют для постановки реакции по обычной методике.

Высушивание на стекле проводят в соответствии с инструкцией Министерства здравоохранения СССР, предложенной для серодиагностики сифилиса: на тщательно вымытое предметное стекло наносят 0,2 мл сыворотки, которая свободно растекается по поверхности при покачивании стекла. Последнее накрывают чашкой Петри и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Высохшую сыворотку соскабливают и помещают в пакетик. В день постановки реакции содержимое пакетика высыпают в пробирку и заливают 1,8 мл физиологического раствора, что создает разведение 1:10. Пробирки ставят на час в термостат, после чего сыворотку инактивируют и готовят необходимые разведения.

Примечание. С этими сыворотками можно ставить реакции связывания комплемента и гемагглютинации, но они непригодны для постановки реакции агглютинации.

Каждую пробу сыворотки должны сопровождать следующие данные о больном: фамилия, имя, возраст, профессия (место работы), день болезни, дата взятия крови, предполагаемый диагноз, анамнез в отношении перенесения сыпного тифа в прошлом.

1. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

С АНТИГЕНАМИ ИЗ РИККЕТСИЙ ПРОВАЧЕКА

Широкое применение серологических методов исследования со специфическими антигенами из риккетсий Провачека стало возможным благодаря разработке способов культивирования и накопления риккетсий.

Достоверность серологических методов исследования при риккетсиозах определяется качеством выпускаемых централизованно риккетсиальных антигенов. Они представляют собой очищенные и стандартизированные взвеси риккетсий Провачека, выращенных в желточных оболочках куриных эмбрионов по Коксу или культивируемых во вшах.

Риккетсиальные антигены, применяемые в серологических реакциях, выпускают в виде корпускулярных взвесей, растворимых субстанций, или цельных антигенов, состоящих из корпускул риккетсий и растворимых фракций.

Корпускулярные антигены применяют для реакции агглютинации, цельные же и растворимые - для реакции связывания комплемента, а также для реакции преципитации.

Ввиду малой стойкости жидких антигенов (лизис и аггрегация риккетсий) в настоящее время их выпускают в сухом виде в запаянных ампулах, что обеспечивает неизменность их свойств на протяжении длительного времени при хранении при +4 - +10 °С.

В день постановки реакции антигены разводят физиологическим раствором согласно указаниям на этикетке ампул или в прилагаемом к препарату наставлении.

Сухие антигены, подвергнутые лиофильному высушиванию, должны иметь вид сухого порошка, хорошо отстающего от стенок ампул, или сухой пористой массы. Если содержимое ампулы плохо растворяется и выпадает в виде хлопьев, это указывает на недоброкачественность антигена (дефекты высушивания или нарушение вакуума).

Срок годности диагностикума указывается на этикетке ампул: по прошествии его антигены подлежат обязательной проверке с 2 - 3 заведомо положительными сыворотками средних титров и с 2 - 3 отрицательными сыворотками.

Каждая вновь полученная серия антигена перед введением ее в опыт также должна быть проверена с заведомо положительными и отрицательными инфекционными или иммунсыворотками.

а) Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента имеет целью определение в исследуемых сыворотках специфических комплементсвязывающих антител.

Сущность реакции заключается в связывании комплемента специфически комплексом (антиген + антитело), что обнаруживается в присутствии индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. При образовании комплекса антиген + антитело последний связывает комплемент и вследствие этого после добавления гемолитической системы не возникает гемолиза. Если же комплекс антиген + антитело не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, положительный результат РСК характеризуется отсутствием или задержкой гемолиза, а отрицательный - феноменом гемолиза (рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся).

Реакцию связывания комплемента можно ставить при 37° и путем длительного связывания на холоде (при +4°). Последний способ чувствительнее первого, но требует несколько большего срока для завершения исследования (около суток); поэтому для диагностических целей обычно применяют метод постановки РСК в условиях термостата, что позволяет закончить исследование в течение одного дня.

Для постановки РСК необходимо 5 ингредиентов: 1) испытуемая сыворотка; 2) антиген; 3) комплемент; 4) гемолитическая сыворотка; 5) эритроциты барана. Реакцию ставят в общем объеме 1 мл, т.е. берут по 0,2 каждого ингредиента. Обязательным условием постановки РСК является использование точно оттитрованных компонентов.

Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо вымытой и высушенной в сухожаровом шкафу.

Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку. Все разведения делают стерильным физиологическим раствором (0,85-процентный раствор химически чистой поваренной соли в дистиллированной воде).

Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30 минут при 56 - 58° для разрушения комплемента.

Риккетсиальный антиген и гемолитическую сыворотку титруют те институты, которые их готовят. В соответствии с данными титрования на этикетке сухого антигена указывают объем жидкости, в котором он должен быть растворен, а на этикетке гемолитической сыворотки указывают ее титр.

Комплемент употребляют или сухой (выпускаемый в ампулах), или жидкий. Для получения последнего берут по 2 - 3 мл крови из сердца нескольких морских свинок в стерильную посуду и после отстаивания сыворотки ее разливают в пробирки и хранят в леднике (при +4°). Комплемент консервируют химическими смесями, например, 0,05 г сернокислого натрия и 0,04 г кристаллической борной кислоты на 1 мл сыворотки (Гинзбург, Калинин, 1947), или замораживанием в рефрижераторе при температуре минус 20°. Сухой комплемент применяется согласно прилагаемой к этому препарату инструкции. Как свежий, так и консервированный комплемент следует титровать каждый раз перед постановкой опыта.

При работе с риккетсиальными антигенами основным разведением комплемента является обычно 1:10.

Гемолитическая сыворотка выпускается в ампулах; это сыворотка кролика, иммунизированного по определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. В опыт гемолитическую сыворотку вводят в тройном титре: например, рабочий титр, указанный на этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку, разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра производят следующим образом. Готовят основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно разливают по 0,2 мл разведений сывороток, начиная с 1:1000; в каждую пробирку добавляют комплемент в разведении 1:10 в объеме 0,2 мл и по 0,2 мл 3-процентной взвеси бараньих эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,4 мл физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в термостате при 37° в течение часа. По наличию полного гемолиза эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.

Читайте также: