Вирус опухоли молочной железы мышей

Инфекция и жизненный цикл

Несколько напряжений мыши несут вирус эндогенно, но он также передан вертикально через молоко от матери щенку. Это содержится как провирус ДНК, объединенный в ДНК молочных лимфоцитов. Вирусы становятся транспортируемыми через желудочно-кишечный тракт к участкам Пейера, где они заражают макрофаги нового хозяина, и затем лимфоциты.

Вирус опухоли груди мыши (MMTV) был раньше классифицирован как простой ретровирус; однако, это было недавно установлено, что MMTV кодирует дополнительный саморегулирующий экспортный белок mRNA, Rem, с подобием преподобному ВИЧ Вируса иммунодефицита человека белок, и является поэтому первым сложным крысиным ретровирусом, который будет зарегистрирован.

MMTV кодирует для ретровиральных структурных генов и дополнительно для суперантигена. Это стимулирует лимфоциты T с определенным типом V бета цепей в их клеточном рецепторе T, который в свою очередь стимулирует пролиферацию клеток B, увеличивающую население клеток, которые могут быть заражены. Во время половой зрелости вирус входит в грудные гланды с мигрирующими лимфоцитами и заражает распространяющиеся грудные эпителиальные клетки железы.

Когда вирусный геном вставлен в геноме хозяина, это тогда в состоянии расшифровать свои собственные вирусные гены. Во Ф. У. Реуссе и Дж. М. Коффине (2000) эксперименты упомянуто, что выражение вирусного генома активировано элементом усилителя, который присутствует в области U3 длинного предельного повторения генома. Кроме того, выражение генома активировано определенно в грудных клетках железы. Эстроген в состоянии далее активировать выражение вирусного генома. Выражение гена перекоса, который присутствует у провируса, ответственно за производство суперантигена.

MMTV может быть передан или через внешний или эндогенный маршрут. Если вирус передан внешне, он передан от мыши матери ее щенкам через ее молоко.

Альтернативно, щенки могут быть заражены вертикально через эндогенную инфекцию, наследуя вирус непосредственно от их матери в зародышевой линии. У мышей, которые становятся зараженными таким образом, есть более высокие показатели возникновения опухолей. Ретровирус эндогенный своему хозяину, как только провирусная ДНК вставлена в хромосомную ДНК. В результате у мышей с эндогенным MMTV есть ДНК вируса в каждой клетке ее тела, поскольку вирус присутствует в ДНК спермы или яйцеклетки, от которой задумано животное.

Гормональный живой отклик интегрированной ДНК MMTV

Эндогенный MMTV реагирует на целый диапазон гормонов, которые регулируют нормальное грудное развитие и кормление грудью, ответ был продемонстрирован гормонам стероида (андрогены, глюкокортикоиды и прогестины), а также пролактин.

Когда мышь достигает половой зрелости, вирус начинает выражать свою РНК посыльного в эстрогене чувствительные ткани. В результате после половой зрелости все грудные клетки будут содержать активный ретровирус и начинать копировать в геноме и выражать вирусную РНК посыльного, все новые грудные клетки ткани.

MMTV и человеческий рак молочной железы

Поскольку зараженные мыши заболевают опухолями груди во взрослую жизнь, MMTV вдохновил поиск человеческого вируса рака молочной железы. Опухоли, вызванные MMTV у мышей, доброкачественные и в целом не метастазируют. Особенно они не метастазируют в кости, поскольку это типично для человеческого рака молочной железы и также для острой лейкемии, вызванной HTLV-I. Это делает вирус не полезным как модель для человеческого рака молочной железы, опасной для жизни болезни.

MMTV был найден при человеческом раке молочной железы. Полная провирусная последовательность, которая была больше, чем 95%, соответственных к MMTV, была упорядочена из человеческой ткани рака молочной железы включая правильную интеграцию в геном человека. Это назвали Human Mammary Tumor Virus (HMTV). Даже была корреляция к увеличенной распространенности HMTV с гестационным раком молочной железы (62% для гестационного до н.э (=gestational рак молочной железы) по сравнению с 38% для всех до н.э) указание, что вирус может сохранить свое гормональное регулирование. Ранние признаки MMTV (или MMTV как) вирусное участие было перепутано присутствием Человеческого Эндогенного RetroVirus (HERV) последовательности, у которых есть намного более низкий уровень соответствия к MMTV, чем HMTV. Они были следами одного или более вирусов, подобных MMTV. Выясняется, что много человеческого рака молочной железы содержат часть огибающего гена вируса, который является очень близко к MMTV. Присутствие HMTV (не HERV) последовательности было найдено многократными исследователями при максимум 42% рака молочной железы в Европе, Северной Америке, а также Австралии. Это по сравнению с только 1 - 2% здорового населения. В то время как некоторые считают присутствие MMTV в людях спорным, есть большое количество доказательств, что MMTV (или очень близкий родственник) играет роль в некотором человеческом раке молочной железы. Огибающие последовательности генов не найдены в других клетках тела, предполагающего, что они имеют иностранное происхождение. Однако Гарри, Поуго и Голландия все запатентовали использование последовательностей MTV для диагностического использования в диагностике человеческого рака молочной железы (Стандартный #’s 6,670,466; 6,040,146; 5,686,247 соответственно). Доктор Гарри также утверждает, что есть эндогенная версия HMTV максимум в 14% населения в его патенте, хотя он должен все же опубликовать рассмотренную статью пэра, демонстрирующую его доказательства.

MMTV был также вовлечен в другие человеческие болезни. У мыши MMTV может также вызвать лейкемию. Человеческий рак молочной железы коррелировался с лейкемией в людях, и вирусная последовательность была найдена при этих раковых образованиях. Полная провирусная последовательность была также упорядочена для лимфатических узлов пациентов с Первичным Желчным Циррозом печени. Желчные эпителиальные клетки, зараженные MMTV, преобразовывают в ту же самую патологию как найденные в пациентах PBC.

MMTV - интересный вирус для человеческих болезней. У этого есть супераллергенные свойства, которые разрушают часть иммунной системы зараженной мыши. Хорошо зарегистрированный патогенез MMTV помогает понять действие суперантигенов при человеческой болезни.

В последние несколько лет много лабораторий нашли MMTV как ДНК в человеческой ткани рака молочной железы и последний раз, вирус, как показывали, был в состоянии продуктивно заразить клетки человека, возможно предполагая, что MMTV как вирус может играть роль в человеческом раке молочной железы. Это показали также, тот человеческий рак молочной железы часто появляется в областях, где Mus domesticus - видные виды мышей. В лаборатории MMTV, как показывали, с готовностью заразил собачьи и кошачьи клетки культуры клеток тканей. Одна теория того, как MMTV был бы передан людям, через контакт с нашими домашними животными. Хотя трудно вообразить, как современные женщины заразить вирусом мыши, инфекция обеих разновидностей той же самой едой могла бы быть возможностью, или проход от одной разновидности до другого мая также происходит. Этот способ инфекции мог бы объяснить часто замечаемое развитие доброкачественных или злокачественных опухолей груди у домашних животных. Собаки и кошки часто затрагиваются, и они также имеют доступ к человеческой еде и делят жилую площадь с людьми. Различные гипотезы были обсуждены для такой возможной передачи людям и главным аргументам в пользу, и против участия MMTV при человеческом раке молочной железы был недавно рассмотрен.

Покровитель MMTV в моделях человеческого рака молочной железы

LTR (длинное предельное повторение) MMTV содержит глюкокортикоидный гормональный элемент ответа. Этот глюкокортикоидный элемент - покровитель, который часто используется, чтобы построить мышей, которые заболевают подобной раку молочной железы болезнью, потому что система модели животных для рака молочной железы близко к человеческой болезни очень разыскивается.

Покровитель MMTV используется в системе модели PyMT рака молочной железы. Здесь Py - сокращение polyoma, и МП - сокращение в течение середины T. Есть больше образцовых систем рака молочной железы, которые используют покровителя MMTV. polyoma средний T-антиген взят от polyoma вируса. Модель MMTV-PyMT, как показывали, была надежной моделью метастаза рака молочной железы. При человеческом раке молочной железы не был найден polyoma средний антиген T-.

Вирус опухоли молочной железы мыши
классификация Вирус
Группа:
Подсемейство:	содержание Инфекция и жизненный цикл Несколько штаммов мыши являются носителями вируса эндогенно, но оно также передается вертикально через молоко от матери к щенку. Он содержится в ДНК провируса , интегрированном в ДНК молока лимфоцитов . Вирусы становятся транспортироваться через желудочно - кишечный тракт к пейеровым бляшек , где они заражают новый хозяин макрофаги , а затем лимфоциты. Вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV) ранее был классифицирован как простой ретровирус ; Однако, недавно было установлено, что MMTV кодирует дополнительный саморегулируемой мРНК экспорта белка, Rem, с подобием к вирусу иммунодефицита человека ВИЧ - Rev белка, и , следовательно, первый комплекс мышиный ретровирус быть документированы. MMTV коды для ретровирусных структурных генов и дополнительно для суперантигена . Это стимулирует Т - лимфоциты с определенным типом V бета - цепи в их Т - клеточного рецептора , который в свою очередь стимулирует В - клеток пролиферацию , увеличивая популяцию клеток , которые могут быть заражены. В периоде полового созревания, вирус проникает в молочных железах с миграцией лимфоцитов и заражает пролиферирующий эпителиальные клетки молочных желез. Когда геном вируса вставлен в геном хозяина он тогда в состоянии расшифровывать свои собственные вирусные гены. В FU Ройсс и JM Coffin (2000) эксперименты упоминаются , что экспрессия генома вируса активируется энхансер элемент , который присутствует в U3 области длинного концевого повтора генома. Кроме того, экспрессия генома активируется специфический в клетках молочной железы. Эстроген может дополнительно активировать экспрессию вирусного генома. Экспрессия потеков гена , который присутствует в провирусе несет ответственность за производство суперантигена. ВОМЖЙ может быть переданы или через экзогенный или эндогенный маршрут. Если вирус передается экзогенно, он передается от матери мыши к ее щенкам через ее молоко. С другой стороны , щенки могут быть заражены вертикально через эндогенную инфекцию, наследуя вирус непосредственно от их матери в зародышевом. Мыши , которые заражаются таким образом , имеют более высокий уровень возникновения опухолей. Ретровирус является эндогенным для хозяина , как только провирусная ДНК вставляется в хромосомной ДНК. В результате, у мышей с эндогенными MMTV имеют Вирус размножается в каждой клетке своего тела, так как вирус присутствует в ДНК спермы или яйцеклетки , из которых мыслится животное. Гормональная отзывчивость интегрированной ДНК MMTV Эндогенный ВОМЖМ реагирует на целый ряд гормонов , которые регулируют нормальное развитие молочных желез и лактацию, реакция была продемонстрирована стероидных гормонов ( андрогенов , глюкокортикоидов и прогестины ), а также пролактина . Когда мышь достигает половой зрелости, вирус начинает выражать свою матричную РНК в эстрогена чувствительных тканей. В результате, после полового созревания всех грудных клетки будут содержать активный ретровирус и начинают размножаться в геноме и выразить вирусный РНК во всех новых клетках ткани молочной железы. Промотор MMTV в моделях рака молочной железы человека ДКП ( длинный концевой повтор ) из MMTV содержит глюкокортикоиды элемента ответа гормона . Этот глюкокортикоид элемент представляет собой промотор , который часто используется для создания мышей , которые развивают рак, как заболевание молочной железы, так как животная модель системы для рака молочной железы , близкой к человеческой болезни очень искал. Промотор MMTV используется в модельной системе PyMT из мышиных моделей метастазов рака молочной железы . Здесь Py это аббревиатура полиомы и MT является сокращением среднего Т. Есть еще модель системы рака молочной железы , которые используют промотор MMTV. Полиомы средний Т-антиген взят из вируса полиомы . Модель MMTV-PyMT было показано, что надежная модель метастаз рака молочной железы. При раке молочной железы человека полиома среднего Т- антиген не был найден. РАКА МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ ВИРУСЫ (син.: вирус Биттнера, фактор молока) — группа вирусов сем. Retroviridae, возбудителей рака молочных желез мышей. Первый из них был открыт в 1936 г. амер. исследователем Дж. Биттнером, к-рый обнаружил, что рак молочных желез мышей может передаваться потомству через молоко матери, содержащее особый фактор. Вирусы рака молочных желез мышей составляют группу антигенно родственных, морфологически идентичных вирусов, относящихся к онковирусам типа В и обладающих различной онкогенной активностью. Диаметр вириона 80—120 нм. Электронно-оптически плотный асимметрично расположенный нуклеоид вириона размером ок. 50 нм, окружен одинарной мембраной. Вирусы рака молочных желез мышей содержат 30% липидов, 2% РНК и 68% белка, инактивируются при нагревании до £° 65—66° в течение 30 мин., нечувствительны к воздействию больших доз рентгеновского излучения и могут длительное время (до нескольких лет) сохраняться при замораживании до —79°, лиофилизации и в 50% нейтральном глицерине. Подобно другим ретровирусам (см.), вирусы рака молочных желез мышей содержат одноцепочечную РНК с мол. весом (массой) ок. 10 млн. дальтон и обратную транскриптазу (ревертазу). Помимо белка этого фермента, в составе вирионов различают 5 основных белков, два из к-рых являются гликопротеидами с мол. весом 52 000 и 34 000 дальтон, а три — негликозилированными белками (28 000, 18 000 и 12 000 дальтон). Вирионы этих вирусов в большом количестве всегда присутствуют во всех раковых опухолях молочных желез (рис., а, б), в нормальной ткани молочной железы и в молоке мышей, в т. ч. и при первой беременности молодых самок тех линий, для к-рых характерна высокая частота развития опухолей молочных желез. Вирусы проявляют инф. свойства при введении новорожденным мышам; их можно титровать по способности вызывать опухоли молочных желез. Удовлетворительные методы титрования вирусов в культуре клеток не разработаны. Вначале было показано, что исходный штамм вируса Биттнера содержит две разновидности — S и L. Причем штамм S вызывает опухоли у самок вскоре после родов и передается только через молоко матери и лишь у тех мышей, к-рые несут специфический аллель — MSe. Другой штамм вируса — L, напротив, не передается через молоко, однако одинаково хорошо распространяется со сперматозоидами и яйцеклетками. Этот вирус обладает менее выраженными бластомогенными свойствами, чем штамм S. Впоследствии от нескольких линий мышей был выделен третий тип вируса — Р, к-рый аналогично штамму S был высокоонкогенен и передавался как с молоком, так и со сперматозоидами и яйцеклетками. Обработка мышей, считавшихся свободными от вирусов рака молочных желез, различными химическими и физическими онкогенами, а также гормонами приводит к продукции высокоонкогенного вируса, отношение к-рого к штаммам S, L и Р окончательно не установлено. Общепризнанно, что практически нет ни одной линии мышей, не содержащей генетической информации ретровируса типа В. Передача эндогенного вируса ' у мышей различных линий осуществляется посредством неотделимого от генетического материала половых клеток ДНК-провируса, т. е. вирусных генов, находящихся в составе хромосомной клеточной ДНК. Выявлены доминантные клеточные гены, контролирующие чувствительность к онкогенному действию вируса. У мышей с высоким уровнем возникновения спонтанных опухолей молочных желез вирусы рака молочных желез передаются через молоко (экзогенная горизонтальная передача). Этот инф. вирус, вызывающий раннее развитие рака молочной железы у мышей первого поколения, отсутствует в молоке безвирусных мышей с низким уровнем возникновения спонтанных опухолей молочной железы. Вместе с тем в ДНК клеток нормальной молочной железы этих линий животных, а также в геноме клеток других паренхиматозных органов (придатки яичка, почки, вилочковая железа) содержатся ДНК-провирусные последовательности (провирус инфекционного вируса рака молочных желез мышей), к-рые передаются вертикально половыми клетками (эндогенная вертикальная передача). Эндогенные ДНК-провирусные последовательности ассоциированы с 3 независимыми парами хромосом мышей. Так, хромосома 4 содержит 2 копии ДНК вируса. Вероятно, 4 копии ДНК-провирусных последовательностей локализованы в хромосомах 15 и 17. В процессе индукции опухолей молочной железы онкогенами или гормонами постоянный уровень экспрессии (функционирования вирусных генов) эндогенного провируса резко увеличивается, и опухолевые клетки уже содержат в 30—50 раз большую концентрацию вирусных РНК. Т. о., возможно, что онкогенное действие гормонов и хим. онкогенов опосредовано изменением экспрессии эндогенных вирусов рака молочных желез мышей, и, вероятно, вирусы, онкогены и гормоны являются коканцерогенными факторами (совместно ускоряющими) малигнизации клеток паренхимы молочной железы. Продукция инф. частиц вирусов происходит только в клетках молочной железы или опухолей этого органа. различия в чувствительности мышей к экзогенным вирусам не связаны с организацией и экспрессией генов эндогенных вирусов. Различные линии мышей являются носителями специфичных для каждой из них типов вирусов рака молочных желез, к-рые отличаются по биол, характеристикам: по кругу хозяев, вирулентности, способу передачи, морфологии вызываемых ими опухолей и др. Вирусы рака молочных желез крыс, кошек и собак изучены мало. С раком молочных желез у крыс и кошек ассоциируют ретровирусы типа С, а у собак вирусные частицы обнаруживаются крайне редко. Большое внимание уделяют раку молочных желез обезьян в связи с выделением из спонтанно возникшей опухоли у макаки резуса ретровируса Мейсона—Пфайзера, отнесенного впоследствии к вирусам типа Б. Предполагают наличие и у человека вируса, аналогичного или родственного вирусам рака молочных желез мышей. Эти предположения основаны на обнаружении в ультратонких срезах клеток раковой опухоли молочных желез человека, а также в клетках эпителия вирусных частиц, в нек-рых случаях морфологически неотличимых от вирусов рака молочных желез мышей. В клетках рака молочных желез человека обнаружены основные компоненты ретровирусов, а в нек-рых случаях и вирионы. С помощью иммунол. методов были получены данные, свидетельствующие о возможном наличии у человека белков, близко-родственных или даже идентичных основным белкам вирусов рака молочных желез мышей. Механизм онкогенного действия вирусов рака молочных желез мышей чрезвычайно сложен и окончательно не выяснен. Генетические факторы влияют на гормональный баланс, репродукцию вируса, его передачу и восприимчивость клеток. Бластомогенная активность вирусов зависит от дополнительных факторов: диеты, численности популяции мышей, температуры среды и др. Для малигнизации клеток вирусами необходима постоянная стимуляция их пролиферации и дифференцировки маммотропными гормонами; в то же время длительная обработка этими гормонами приводит к малигнизации клеток паренхимы молочной железы, содержащих в ДНК гены эндогенных и экзогенных типов вируса рака молочных желез мышей. Библиогр.: Городи лова В. В. Специфический антиген рака молочных желез и его значение в этиологии данной опухоли, М., 1961, библиогр.; Крюкова И. Н. О возможной ассоциации онковирусов, родственных онковирусам типа В мышей, с карциномами молочных желез человека, Эксперим. онкол., т. 2, № 4, с. 13, 1980; Gross L. Oncogenic viruses, Oxford а. о., 1970. На ежегодной конференции Американского общества клинической онкологии, только что прошедшей в Сан-Франциско, прозвучал сенсационный доклад ученых, которые в тканях больных раком простаты обнаружили вирус, прежде встречавшийся лишь у мышей с онкологическими заболеваниями. А раз известен вирус, то гораздо понятней, как создавать противоопухолевые лекарства. Кстати, вирусную теорию рака обосновал наш соотечественник Лев Зильбер еще в 1940-е. Причем этот вирус найден лишь в тканях тех больных, у которых имеется определенный генетический дефект. "Мы не утверждаем, что вирус является непосредственной причиной возникновения заболевания, - сказал один из авторов исследования доктор Эрик Клейн из Кливлендской клиники. - Но это волнующее открытие указывает совершенно новые пути изучения рака простаты". Исследователи пока не знают, как вирус мышей попадает в организм человека, но предполагают, что он может наследоваться генетически. Доктор Клейн и его коллега доктор Джо Деризи из Университета Калифорнии применили технологию "генетического чипа" (подобный диагностикум создан и российскими учеными из Института молекулярной биологии РАН. - "Известия"). На особой пластинке Деризи разместил характерные отрезки генетического материала 20 тысяч известных вирусов. Клейн предоставил ему 86 образцов тканей своих пациентов с раком простаты. Из них выделили образцы ДНК и поместили их на чип. ДНК тех 20 пациентов, у которых был обнаружен мутантный ген, совпала с ДНК онковируса мышей. Мутация представляет собой удвоение гена, кодирующего производство ферментов, которые уничтожают вторгшиеся в организм вирусы. Оказалось, что у мужчин с удвоенным геном таких ферментов вырабатывается значительно меньше. Среди 66 пациентов с нормальным геном вирус был обнаружен лишь у одного. Ученые планируют обследовать сотни больных и здоровых, чтобы уточнить связь между наличием вируса и раком простаты. Открытие американских ученых становится еще одним практическим подтверждением вирусогенетической теории рака, которую еще в 40-е годы ХХ века сформулировал наш соотечественник Лев Зильбер. Лев Зильбер опередил мир на полстолетия На вопросы "Известий" отвечает сын Льва Зильбера академик Лев Киселев. известия: Известно, что Лев Александрович создавал свою теорию в 40-х годах в лагере. Но ведь вирусная гипотеза высказывалась и раньше? Лев Киселев: Первые гипотезы о вирусной природе рака были высказаны в начале ХХ века, в том числе и нашим соотечественником Ильей Мечниковым. Но Лев Зильбер сформулировал целостную вирусогенетическую теорию, далеко опередившую время. известия: Но современники не приняли новую теорию? Киселев: Да, 20 лет он в одиночку доказывал свою правоту. Лишь в 60-х годах появились первые экспериментальные подтверждения теории. Большую поддержку оказали работы чеха Яна Свободы из Института генетики Чехословакии, он и сейчас жив. известия: Сегодня сомнений в правоте Льва Александровича нет? Киселев: Сегодня считается, что до 25% всех раковых опухолей возникает с участием онковирусов. Это доказано, в частности, для рака печени, который вызывают вирусы хронического гепатита В и С, для рака шейки матки (вирус папилломы человека). Есть предположения, что не без участия вирусов возникают и такие заболевания, как рак молочной железы, желудка и некоторые другие. Доказано также, что у животных вирусами вызываются все опухоли. Слова отца "рак - это заболевание генома" оказались провидческими, ведь тогда до расшифровки генома было невероятно далеко. Великий ученый, яркий человек Лев Зильбер родился в 1894 году во Пскове. После окончания медицинского факультета работал в Москве и Баку, участвовал в ликвидации в СССР чумы, разработал теорию клещевого энцефалита, предположив, что вирус заболевания переносится клещами. Дважды по абсурдным обвинениям находился в заключении (в 1937-39 и 1940-44 годах). За его освобождение самоотверженно боролись брат - писатель Вениамин Каверин и бывшая жена Зинаида Ермольева, известная как создательница "советского пенициллина". Известно, что брат послужил прототипом Сани Григорьева из любимой миллионами людей повести Каверина "Два капитана". Ермольевой посвящен роман "Открытая книга". Свою теорию происхождения рака Зильбер создал в заключении, проводя опыты в научной "шарашке". Крыс и мышей ловили для него заключенные, с которыми он расплачивался табаком. Изучая механизмы развития опухолей, Зильбер пришел к выводу, что, попадая в здоровую клетку, вирус изменяет ее генетическую основу, поэтому клетка выходит из-под контроля организма и начинает беспрепятственно делиться - так возникает опухоль. Первую статью о своей теории Лев Александрович опубликовал в нашей газете в 1945 году. В том же году появилась его монография на эту тему. МОСКВА, 1 фев – РИА Новости. Стэнфордские медики разработали новый тип иммуннотерапии, который позволяет "натравливать" иммунные клетки на конкретные опухоли и полностью уничтожать их за считанные дни, и проверили ее работу на мышах, говорится в статье, опубликованной в журнале Science Translational Medicine. В последние годы молекулярные биологи и медики начали возлагать особые надежды на так называемую иммунотерапию при борьбе с раком, аллергией, диабетом и другими пока неизлечимыми заболеваниями. Она очень проста по своей сути – ученые пытаются "натравить" иммунитет человека на раковые клетки, используя различные антитела, живых микробов и ряд других необычных "приманок". На сегодня уже существует несколько видов иммунотерапии, успешно прошедших клинические испытания и одобренных регулирующими органами США и ряда других стран. Большая часть из них представляет собой синтетические антитела, которые цепляются за раковые клетки и делают их "видимыми" для иммунной системы. Леви и его коллеги разработали крайне эффективную версию иммунотерапии, проверяя опасную, но потенциально революционную идею "дрессировки" иммунных клеток при помощи самой же опухоли. Для этого необходимо заставить их пробраться внутрь новообразования и начать считывать антигены, присутствующие на поверхности "взбунтовавшихся" клеток. В прошлом, попытки реализовать подобные идеи уже заканчивались неудачно, так как многие раковые клетки или остаются "невидимыми" для иммунитета, или же они активно мешают его работе, не позволяя Т-клеткам, главным "дирижерам" иммунной системы, сблизиться с ними и опознать их. Леви и его коллеги предположили, что эту проблему можно ликвидировать при помощи специальной комбинации из антител и сигнальных молекул, которые будут принудительно "включать" иммунные тельца и заставлять их атаковать рак, игнорируя те сигналы, которые вырабатывают опухолевые клетки. Экспериментируя на культурах клеток, ученые обнаружили, что нужного эффекта можно добиться, используя всего две молекулы – антитело, подавляющее работу сигнального белка OX40, заставляющего Т-клетки отступить, и короткую цепочку ДНК, стимулирующую работу гена TLR9, который отвечает за активацию врожденной и приобретенной иммунной реакции. Работу этой комбинации препаратов биологи проверили на нескольких мышах, генетически предрасположенных к развитию рака груди. Как показали их опыты, ввод этой смеси в уже сформировавшуюся опухоль привело к ее полному уничтожению уже через 10 дней, причем соседние с ней новообразования так же начали уменьшаться, несмотря на то, что ученые не пытались с ними бороться. Более того, дальнейшие наблюдения показали, что подобная "вакцина" защитила мышей от повторного появления новых очагов рака груди, несмотря на их предрасположенность к его развитию, а также уничтожила опухоли других видов рака, имплантированных в их тело хирургическим путем. Все это, как считает Леви, говорит о том, что подобная иммуннотерапия имеет большие клинические перспективы, если ее работоспособность будет доказана в ходе первых клинических опытов на добровольцах, которые могут начаться уже в ближайшие годы. КАРТОЧКА ПРОЕКТА, ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов. Название Активация трансмембранных протеаз опухолевых клеток как причина приобретения избирательной чувствительности к онклитическому действию вируса Сендай Руководитель Чумаков Петр Михайлович, Доктор биологических наук Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва Года выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016 Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология Ключевые слова онколитические вирусы, трансмембранные протеазы, парамиксовирус Сендай, метастатический рак, раковая клетка, ген супрессор р53, репликация вирусов, инфекционность, терапия рака Код ГРНТИ 34.15.00 Статус Успешно завершен ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ Аннотация Метастатический рак по прежнему остается во многих случаях неизлечимым заболеванием. Современные подходы к химиотерапии рака приближаются к пределу своих возможностей. Однако большие надежды для медицины будущего связаны с использованием методов биотерапии рака. Проект направлен на изучение механизмов вирусного онколиза с помощью мышиного парамиксовируса Сендай. Исследование возможности использования вирусов для терапии рака представляет активно-разрабатываемое направление онкологии и вирусологии. Опухолевые клетки как правило приобретают повышенную чувствительность к вирусам, благодаря утрате механизмов противовирусной защиты а также изменению метаболизма и регуляции процессов биосинтеза. Особое значение для активного внедрения онколитических вирусов в медицинскую практику имеют вопросы безопасности таких вирусов для пациентов и экологии. В связи с этим использование непатогенных вирусов животных, обладающих онколитическим потенциалом против опухолей человека представляет несомненный интерес. Мышиный парамиксовирус Сендай непатогенен для человека и вызывает респираторное заболевание у мышей. Он способен размножаться исключительно в дыхательном эпителии, благодаря тому что созревание инфекционного вируса требует экзогенных трипсин-подобных протеаз, секретируемых легочным эпителием. В тоже время, наши исследования указывают на способность опухолевых клеток человека поддерживать продукцию инфекционно-компетентного вируса. Существующие данные указывают участие в созревании вируса трансмембранных сериновых протеаз II типа, которые активируются в ряде опухолевых клеток человека. Провидимому именно за счет активации этих протеаз вирус Сендай приобретает онкоселективность и онколитическую активность, позволяющую рассматривать его в качестве терапевтического средства. Мы планируем проведение исследования ставящего целью установления насколько часто опухоли человека приобретают чувствительность к вирусу Сендай за счет активации трансмембранных протеаз, какие типы протеаз обуславливают онкоселективность вируса, и как можно использовать это свойство для совершенствования методов терапии рака. Мы планируем разработку подхода, позволяющего предсказывать чувствительность того или иного типа рака к онколитической терапии в помощью вируса Сендай, а также отработку метода доставки инфекционного вируса в опухоль и отдаленные метастазы с помощью клеточных носителей экспрессирующих трансмембранные протеазы и способные продуцировать инфекционные вирионы. Ожидаемые результаты Планируемое исследование позволит установить новый ранее неизвестный механизм онкоселективности вируса Сендай и обосновать его пригодность для использования в качестве безопасного и эффективного терапевтического противоракового средства. Установление корреляции между активацией трансмембранных протеаз в опухолевых клетках человека и приобретением чувствительности к онколитическому действию вируса Сендай позволит проводить предсказания эффективности терапии с помощью вируса в отношении опухоли конкретного пациента. Планируемое исследование позволит также создать клеточную систему для эффективной доставки инфекционного вируса в опухоли и отдаленные метастазы, что позволит существенно повысить успех терапевтического воздействия. Результаты работы будут опубликованы в научных статьях и популярных изданиях для информирования общественности об успехах в области медицины. Аннотация результатов, полученных в 2014 году Ранее при размножении вируса Сендай на клетках почки человека или собаки было установлено, что в культуре клетки не обладают достаточной эндогенной протеазной активностью для того чтобы осуществить расщепление вирусного фузигенного белка F до активной формы F1, необходимой для проникновения вируса в клетку. Продуцируемые вирусные частицы лишены инфекционности, и поэтому для получения инфекционного вирусного стока требуется добавление экзогенного трипсина. В тоже время, известно, что вирус Сендай обладает онколитической активностью и способен разрушать опухоли как на животных моделях, так и при испытаниях на людях. В то же время, часть опухолей оказывается устойчивой к онколитическому действию вируса. Проведенные нами ранее предварительные исследования позволили предположить, что в основе чувствительности некоторых опухолей человека лежит активация эндогенных протеаз, которые способны процессировать фузигенный белок вируса Сендай и обуславливать размножение вируса в опухоли в течение нескольких инфекционных циклов. Активация эндогенных протеаз в опухолях может быть причиной для онкоселективности вируса Сендай, а предварительное выявление активации протеаз в образце опухоли пациента может позволить проведение прогнозирования по поводу индивидуальной чувствительности данной опухоли к вирусной терапии. Для проверки этой гипотезы мы провели скрининг 61 линий злокачественных клеток человека различного гистогенеза на способность продуцировать инфекционные вирионы вируса Сендай, способные к повторному заражению клеток. Было установлено, что 42 линии (68.8%) были способны продуцировать инфекционные вирионы, содержащие процессированный белок F. Среди этих линий отобраны наиболее подходящие для дальнейших исследований представители линий клеток двух типов (способные и неспособные продуцировать инфекционные вирионы). Для выявления экспрессии трансмембранных трипсин-подобных протеаз, способных осуществлять процессирование белка F, были отработаны условия для детекции транскриптов соответствующих генов с помощью ПЦР в реальном времени. Среди инфекционно-компетентных линий клеток обнаружены линии с повышением эндогенного уровня транскриптов протеазы TMPRSS2, в то время как среди инфекционно-некомпетентных линий таких изменений не выявлено. Для установления причинно-следственной связи между экспрессией протеаз и способностью продуцировать инфекционные вирионы нами были сконструированы плазмиды для выключения гена TMPRSS2 с помощью РНК интерференции (экспрессия shRNA) и геномных нокаутов (система CRISPR/Cas9). Получены данные о роли подавления гена-супрессора р53 в приобретении чувствительности клеток к вирусу Сендай. Подобраны и отработаны модели для опытом in vivo с использованием иммунодефицитных мышей, в том числе модель множественных опухолей у одного животного и их выявление с помощью компьютерной томографии. Полученные экспериментальные данные и методические разработки будут использованы на последующих этапах исследования. 1. Chumakov PM Oncolytic virus therapy: problems to be solved Acta Naturae, 2015, January (год публикации - 2015). 2. Kochneva G, Zonov E, Grazhdantseva A, Yunusova A, Sibolobova G, Popov E, Taranov O, Netesov S, Chumakov P, Ryabchikova E. Apoptin enhances the oncolytic properties of vaccinia virus and modifies mechanisms of tumor regression Oncotarget, 2014 Oct 15. pii: 2579 (год публикации - 2014). Аннотация результатов, полученных в 2015 году Определена способность 15 линий клеток опухолей человека различного гистогенеза поддерживать размножение вируса Сендай и секретировать инфекционно-компетентные вирионы. Установлена корреляция чувствительности линий с экспрессией ряда генов, относящихся к протеазным сигнальным путям. Помимо двух трансмембранных протеаз TMPRSS2 и TMPRSS11B с чувствительностью к вирусу положительно коррелировала экспрессия генов дипептидил пептидазы DPP9, карбоксипептидазы CPN1, напсина А NAPSA, катепсина К CTSK, катепсина А CTSA, протеазы PSA PROS1, аланил-аминопептизады ANPEP и карбоксипептидазы М CPM. Характер изменений активности генов протеаз зависел от тканевой принадлежности опухоли. Получено девять первичных культур (прошедших не более 6 пассирований) от пациентов рака молочной железы и шесть культур от пациентов рака простаты. Определена относительная чувствительность к вирусу Сендай внутри этой группы культур. С помощь. ПЦР в реальном времени определены уровни экспрессии 23 генов представителей протеазных сетей клетки, функционирующих во внеклеточном пространстве. Чувствительность культур достоверно положительно коррелировала с экспрессией четырех генов, кодирующих протеазу TMPRSS2 (наибольший вклад), карбоксипептидазу М СРМ, катепсин L2 CTSL2 и дипептидил пептидазу 4 DPP4. Для установления роли протеазы TMPRSS2 в чувствительности опухолевых клеток к вирусу Сендай проведено выключение этого гена с помощью РНК интерференции. Экспрессия этого гена существенно влияло на способности вируса размножаться в клетках CaCo2, но не в H1299, что указывает на ткане- и опухольспецифические различия в причинах приобретения чувствительности к вирусу. Изучена способность ряда клеток (куриные фибробласты из 5-дневных эмбрионов, периферические лимфоциты, активированные лимфоциты, индуцированные дендритные клетки, линий клеток MDCK экспрессирующая протеазу TMPRSS2) функционировать в качестве носителя для переноса вируса в чувствительные раковые клетки. Максимальной способностью заражать чувствительные клетки обладали дендритные клетки, меньшей - активированные лимфоциты, клетки куриных эмбрионов и трансгенные клетки MDCK экспрессирующие протеазу TMPRSS2, еще меньше – периферические лимфоциты крови. Проведено испытание различных способов доставки вируса в подкожные ксенографты опухолей человека на бестимусных мышах. При введении в хвостовую вену доставка была возможна с использованием 1000 зараженных вирусом клеток. Введение препаратов вируса внутрибрюшинно и подкожно оказалось малоэффективным. Установлено, что повышение чувствительности клеток рака легкого А549 к вирусу Сендай при выключении гена р53 коррелирует с увеличением экспрессии генов протеаз CPM, ANPEP, PLAU, MMP2, CPE, CPA4, ADAMTS5, TRHPE, FBXL2 и CPQ. По-видимому эти гены супрессируются р53 дикого типа, и при его утрате происходит активация транскрипции ряда протеаз, вызывая повышение чувствительности к вирусу Сендай. 1. Matveeva OV, Guo GS, Senin VM, Senina AV, Shabalina SN, Chumakov PM Oncolysis by paramyxoviruses: preclinical and clinical studies Molecular Therapy - Oncolytics, 2, 150017; doi:10.1038/mto.2015.17 (год публикации - 2015). 2. Matveeva OV, Kochneva GV, Netesov SV, Onikienko SB, Chumakov PM Mechanisms of Oncolysis by Paramyxovirus Sendai Acta NAturae, 7 № 2 (25) 2015 (год публикации - 2015). 3. Matveeva, O. V. Guo, Z.-S. Shabalina, S.V. Chumakov, P. M. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficacy Molecular Therapy - oncolytics, 2, 15011; doi:10.1038/mto.2015.11; (год публикации - 2015). Аннотация результатов, полученных в 2016 году В течение заключительного этапа проекта по изучению роли трансмембранных протеаз в созревании онколитического вируса Сендай получены важные данные о механизме приобретения фенотипа опухолевых клеток, сопровождающегося повышенной активностью клеточных сериновых протеаз, способных процессировать F белок вируса Сендай. Вирус Сендай требует активности протеза хозяина для полного созревания и дальнейшей возможности для новообразованного вируса заражать опухолевые клетки и осуществлять онколиз. Ранее в своих исследованиях мы концентрировались на изучении изменений экспрессии самих трансмембранных протеаз в опухолевых клетках, выясняли как это коррелирует с приобретением чувствительности к вирусу и с экспрессией других генов. Однако полученные результаты были недостаточными для того чтобы делать вывод о четкой корреляции чувствительности к вирусу Сендай и изменениями экспрессии трансмембранных протеаз, по крайней мере на транскрипционном уровне. Кроме этого, применение стандартных линий опухолевых клеток имеющих разное тканевое происхождение не позволяло сделать определенные выводы, так как многие из генов могут иметь тканеспецифическую регуляцию. На данном этапе мы использовали полученную нами панель опухолевых культур ранних пассажей, полученные от пациентов рака простаты и рака молочной железы. Было исследовано 14 культур рака простаты и 8 культур рака молочной железы. Для более количественной оценки способности вируса Сендай заражать клетки нами был разработан новый количественный метод, основанный на проточной цитометрии. С помощью этого метода определена способность культур рака простаты продуцировать зрелый вирус и проведена классификация культур по их способности в той или иной степени процессировать инфекционно-активные вирионы. Во всех линиях клеток определен функциональный статус гена р53 с помощью введения р53-зависимого транскрипционного репортера и индукции активности р53 с помощью обработки 5-фторурацилом. В линиях клеток с нарушенной функциональностью р53 с помощью секвенирования фрагментов кДНК идентифицированы миссенс мутации в кодирующих участках гена р53. Наиболее характерные линии клеток, различающиеся по способности продуцировать зрелые вирионы и по состоянию гена р53 подвергнуты транскриптомному анализу. Было подтверждено, что линии клеток в большей мере способные продуцировать зрелый вирус, имеют несколько повышенный уровень экспрессии генов TMPRSS2 и TMPRSS11B. Однако наиболее сильные изменения транскрипции были обнаружены нами для генов, кодирующих ингибиторы сериновых протеаз, серпины - маспин и PAI-1. Также в клетках карциномы простаты выявлено повышение уровня экспрессии гена, кодирующего простат-специфический антиген. Интересно что два обнаруженных гена серпинов позитивно регулируются активностью гена р53. По нашим прежним опубликованным данным простат-специфический антиген находится под негативным контролем со стороны р53. Это навело на мысль что как различия в экспрессии указанных генов так и чувствительность к вирусу Сендай могут быть опосредованы статусом гена р53. Анализ экспрессии указанных генов с помощью ПЦР в реальном времени в остальных культурах опухолей простаты и молочной железы подтвердил существование строгой корреляции между экспрессией этих генов и статусом р53. Все эти три р53-регулируемых гена изменяли свою экспрессию в клетках раков простаты при выключении р53 с помощью РНК интерференции. В раках молочной железы уровни PAI-1 были существенно ниже и не регулировались р53, а уровень экспрессии PSA практически не определялся, что указывает на тканеспецифичность экспрессии этих генов. Выключение гена р53 приводило также к приобретению повышенной способности продуцировать зрелые вирионы Сендай. Таким образом мы установили, что в качестве одного из основных механизмов приобретения опухолями способности продуцировать зрелый вирус Сендай является утрата активности опухолевого супрессора р53. В результате потери функции р53 происходит утрата экспрессии ингибиторов сериновых протеаз семейства серпинов, а в случае рака простаты - к повышению экспрессии протеазы PSA. Эти изменения, очевидно, могут приводить к каскадным изменениям активности ряда протеаз, в том числе трансмембранных протеаз, принимающих участие в созревании вируса Сендай. Однако эти изменения могут плохо детектироваться на транскрипционном уровне, поскольку осуществляются за счет протеолиза. Таким образом статус гена р53 может служить одним из предикторов чувствительности опухолей человека к вирусу Сендай. Мы также провели испытание ранее разработанных нами двух клеточных моделей для системной доставки вируса Сендай в опухоли, которые основаны на клетках ранних куриных эмбрионов и индуцированных in vitro дендритных клетках человека, нагруженных предварительно вирусом Сендай. Мы установили возможность системной доставки вируса Сендай в опухоли с помощью нагруженных вирусом дендритных клеток при их внутривенном введении. Все основные цели проекта были выполнены. 1. Жирнов О.П., Манякин А.А., Россман Ю.С., Кленк Х.Д. Intravirion cohesion of matrix protein M1 with ribonucleocapsid is a prerequisite of influenza virus infectivity Virology, 492, 187–196 (год публикации - 2016). Читайте также: Дека дураболин при гепатите с Аборт при положительном анализе на гепатит Как гепатит с проявляется на коже лица Морфология при гепатите в Как долго лечится вирусный герпес Пожалуйста, не занимайтесь самолечением! При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу. Copyright © Иммунитет и инфекции

Вирус опухоли молочной железы мыши

классификация Вирус

Группа:

Подсемейство:

содержание

Инфекция и жизненный цикл

Несколько штаммов мыши являются носителями вируса эндогенно, но оно также передается вертикально через молоко от матери к щенку. Он содержится в ДНК провируса , интегрированном в ДНК молока лимфоцитов . Вирусы становятся транспортироваться через желудочно - кишечный тракт к пейеровым бляшек , где они заражают новый хозяин макрофаги , а затем лимфоциты.

Вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV) ранее был классифицирован как простой ретровирус ; Однако, недавно было установлено, что MMTV кодирует дополнительный саморегулируемой мРНК экспорта белка, Rem, с подобием к вирусу иммунодефицита человека ВИЧ - Rev белка, и , следовательно, первый комплекс мышиный ретровирус быть документированы.

MMTV коды для ретровирусных структурных генов и дополнительно для суперантигена . Это стимулирует Т - лимфоциты с определенным типом V бета - цепи в их Т - клеточного рецептора , который в свою очередь стимулирует В - клеток пролиферацию , увеличивая популяцию клеток , которые могут быть заражены. В периоде полового созревания, вирус проникает в молочных железах с миграцией лимфоцитов и заражает пролиферирующий эпителиальные клетки молочных желез.

Когда геном вируса вставлен в геном хозяина он тогда в состоянии расшифровывать свои собственные вирусные гены. В FU Ройсс и JM Coffin (2000) эксперименты упоминаются , что экспрессия генома вируса активируется энхансер элемент , который присутствует в U3 области длинного концевого повтора генома. Кроме того, экспрессия генома активируется специфический в клетках молочной железы. Эстроген может дополнительно активировать экспрессию вирусного генома. Экспрессия потеков гена , который присутствует в провирусе несет ответственность за производство суперантигена.

ВОМЖЙ может быть переданы или через экзогенный или эндогенный маршрут. Если вирус передается экзогенно, он передается от матери мыши к ее щенкам через ее молоко.

С другой стороны , щенки могут быть заражены вертикально через эндогенную инфекцию, наследуя вирус непосредственно от их матери в зародышевом. Мыши , которые заражаются таким образом , имеют более высокий уровень возникновения опухолей. Ретровирус является эндогенным для хозяина , как только провирусная ДНК вставляется в хромосомной ДНК. В результате, у мышей с эндогенными MMTV имеют Вирус размножается в каждой клетке своего тела, так как вирус присутствует в ДНК спермы или яйцеклетки , из которых мыслится животное.

Гормональная отзывчивость интегрированной ДНК MMTV

Эндогенный ВОМЖМ реагирует на целый ряд гормонов , которые регулируют нормальное развитие молочных желез и лактацию, реакция была продемонстрирована стероидных гормонов ( андрогенов , глюкокортикоидов и прогестины ), а также пролактина .

Когда мышь достигает половой зрелости, вирус начинает выражать свою матричную РНК в эстрогена чувствительных тканей. В результате, после полового созревания всех грудных клетки будут содержать активный ретровирус и начинают размножаться в геноме и выразить вирусный РНК во всех новых клетках ткани молочной железы.

Промотор MMTV в моделях рака молочной железы человека

ДКП ( длинный концевой повтор ) из MMTV содержит глюкокортикоиды элемента ответа гормона . Этот глюкокортикоид элемент представляет собой промотор , который часто используется для создания мышей , которые развивают рак, как заболевание молочной железы, так как животная модель системы для рака молочной железы , близкой к человеческой болезни очень искал.

Промотор MMTV используется в модельной системе PyMT из мышиных моделей метастазов рака молочной железы . Здесь Py это аббревиатура полиомы и MT является сокращением среднего Т. Есть еще модель системы рака молочной железы , которые используют промотор MMTV. Полиомы средний Т-антиген взят из вируса полиомы . Модель MMTV-PyMT было показано, что надежная модель метастаз рака молочной железы. При раке молочной железы человека полиома среднего Т- антиген не был найден.

РАКА МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ ВИРУСЫ (син.: вирус Биттнера, фактор молока) — группа вирусов сем. Retroviridae, возбудителей рака молочных желез мышей. Первый из них был открыт в 1936 г. амер. исследователем Дж. Биттнером, к-рый обнаружил, что рак молочных желез мышей может передаваться потомству через молоко матери, содержащее особый фактор.

Вирусы рака молочных желез мышей составляют группу антигенно родственных, морфологически идентичных вирусов, относящихся к онковирусам типа В и обладающих различной онкогенной активностью. Диаметр вириона 80—120 нм. Электронно-оптически плотный асимметрично расположенный нуклеоид вириона размером ок. 50 нм, окружен одинарной мембраной. Вирусы рака молочных желез мышей содержат 30% липидов, 2% РНК и 68% белка, инактивируются при нагревании до £° 65—66° в течение 30 мин., нечувствительны к воздействию больших доз рентгеновского излучения и могут длительное время (до нескольких лет) сохраняться при замораживании до —79°, лиофилизации и в 50% нейтральном глицерине.

Подобно другим ретровирусам (см.), вирусы рака молочных желез мышей содержат одноцепочечную РНК с мол. весом (массой) ок. 10 млн. дальтон и обратную транскриптазу (ревертазу). Помимо белка этого фермента, в составе вирионов различают 5 основных белков, два из к-рых являются гликопротеидами с мол. весом 52 000 и 34 000 дальтон, а три — негликозилированными белками (28 000, 18 000 и 12 000 дальтон).

Вирионы этих вирусов в большом количестве всегда присутствуют во всех раковых опухолях молочных желез (рис., а, б), в нормальной ткани молочной железы и в молоке мышей, в т. ч. и при первой беременности молодых самок тех линий, для к-рых характерна высокая частота развития опухолей молочных желез. Вирусы проявляют инф. свойства при введении новорожденным мышам; их можно титровать по способности вызывать опухоли молочных желез. Удовлетворительные методы титрования вирусов в культуре клеток не разработаны.

Вначале было показано, что исходный штамм вируса Биттнера содержит две разновидности — S и L. Причем штамм S вызывает опухоли у самок вскоре после родов и передается только через молоко матери и лишь у тех мышей, к-рые несут специфический аллель — MSe. Другой штамм вируса — L, напротив, не передается через молоко, однако одинаково хорошо распространяется со сперматозоидами и яйцеклетками. Этот вирус обладает менее выраженными бластомогенными свойствами, чем штамм S.

Впоследствии от нескольких линий мышей был выделен третий тип вируса — Р, к-рый аналогично штамму S был высокоонкогенен и передавался как с молоком, так и со сперматозоидами и яйцеклетками. Обработка мышей, считавшихся свободными от вирусов рака молочных желез, различными химическими и физическими онкогенами, а также гормонами приводит к продукции высокоонкогенного вируса, отношение к-рого к штаммам S, L и Р окончательно не установлено.

Общепризнанно, что практически нет ни одной линии мышей, не содержащей генетической информации ретровируса типа В. Передача эндогенного вируса ' у мышей различных линий осуществляется посредством неотделимого от генетического материала половых клеток ДНК-провируса, т. е. вирусных генов, находящихся в составе хромосомной клеточной ДНК. Выявлены доминантные клеточные гены, контролирующие чувствительность к онкогенному действию вируса. У мышей с высоким уровнем возникновения спонтанных опухолей молочных желез вирусы рака молочных желез передаются через молоко (экзогенная горизонтальная передача). Этот инф. вирус, вызывающий раннее развитие рака молочной железы у мышей первого поколения, отсутствует в молоке безвирусных мышей с низким уровнем возникновения спонтанных опухолей молочной железы. Вместе с тем в ДНК клеток нормальной молочной железы этих линий животных, а также в геноме клеток других паренхиматозных органов (придатки яичка, почки, вилочковая железа) содержатся ДНК-провирусные последовательности (провирус инфекционного вируса рака молочных желез мышей), к-рые передаются вертикально половыми клетками (эндогенная вертикальная передача). Эндогенные ДНК-провирусные последовательности ассоциированы с 3 независимыми парами хромосом мышей. Так, хромосома 4 содержит 2 копии ДНК вируса. Вероятно, 4 копии ДНК-провирусных последовательностей локализованы в хромосомах 15 и 17. В процессе индукции опухолей молочной железы онкогенами или гормонами постоянный уровень экспрессии (функционирования вирусных генов) эндогенного провируса резко увеличивается, и опухолевые клетки уже содержат в 30—50 раз большую концентрацию вирусных РНК.

Т. о., возможно, что онкогенное действие гормонов и хим. онкогенов опосредовано изменением экспрессии эндогенных вирусов рака молочных желез мышей, и, вероятно, вирусы, онкогены и гормоны являются коканцерогенными факторами (совместно ускоряющими) малигнизации клеток паренхимы молочной железы. Продукция инф. частиц вирусов происходит только в клетках молочной железы или опухолей этого органа. различия в чувствительности мышей к экзогенным вирусам не связаны с организацией и экспрессией генов эндогенных вирусов.

Различные линии мышей являются носителями специфичных для каждой из них типов вирусов рака молочных желез, к-рые отличаются по биол, характеристикам: по кругу хозяев, вирулентности, способу передачи, морфологии вызываемых ими опухолей и др. Вирусы рака молочных желез крыс, кошек и собак изучены мало. С раком молочных желез у крыс и кошек ассоциируют ретровирусы типа С, а у собак вирусные частицы обнаруживаются крайне редко. Большое внимание уделяют раку молочных желез обезьян в связи с выделением из спонтанно возникшей опухоли у макаки резуса ретровируса Мейсона—Пфайзера, отнесенного впоследствии к вирусам типа Б.

Предполагают наличие и у человека вируса, аналогичного или родственного вирусам рака молочных желез мышей. Эти предположения основаны на обнаружении в ультратонких срезах клеток раковой опухоли молочных желез человека, а также в клетках эпителия вирусных частиц, в нек-рых случаях морфологически неотличимых от вирусов рака молочных желез мышей. В клетках рака молочных желез человека обнаружены основные компоненты ретровирусов, а в нек-рых случаях и вирионы. С помощью иммунол. методов были получены данные, свидетельствующие о возможном наличии у человека белков, близко-родственных или даже идентичных основным белкам вирусов рака молочных желез мышей.

Механизм онкогенного действия вирусов рака молочных желез мышей чрезвычайно сложен и окончательно не выяснен. Генетические факторы влияют на гормональный баланс, репродукцию вируса, его передачу и восприимчивость клеток. Бластомогенная активность вирусов зависит от дополнительных факторов: диеты, численности популяции мышей, температуры среды и др. Для малигнизации клеток вирусами необходима постоянная стимуляция их пролиферации и дифференцировки маммотропными гормонами; в то же время длительная обработка этими гормонами приводит к малигнизации клеток паренхимы молочной железы, содержащих в ДНК гены эндогенных и экзогенных типов вируса рака молочных желез мышей.

Библиогр.: Городи лова В. В. Специфический антиген рака молочных желез и его значение в этиологии данной опухоли, М., 1961, библиогр.; Крюкова И. Н. О возможной ассоциации онковирусов, родственных онковирусам типа В мышей, с карциномами молочных желез человека, Эксперим. онкол., т. 2, № 4, с. 13, 1980; Gross L. Oncogenic viruses, Oxford а. о., 1970.

На ежегодной конференции Американского общества клинической онкологии, только что прошедшей в Сан-Франциско, прозвучал сенсационный доклад ученых, которые в тканях больных раком простаты обнаружили вирус, прежде встречавшийся лишь у мышей с онкологическими заболеваниями. А раз известен вирус, то гораздо понятней, как создавать противоопухолевые лекарства. Кстати, вирусную теорию рака обосновал наш соотечественник Лев Зильбер еще в 1940-е.

Причем этот вирус найден лишь в тканях тех больных, у которых имеется определенный генетический дефект.

"Мы не утверждаем, что вирус является непосредственной причиной возникновения заболевания, - сказал один из авторов исследования доктор Эрик Клейн из Кливлендской клиники. - Но это волнующее открытие указывает совершенно новые пути изучения рака простаты".

Исследователи пока не знают, как вирус мышей попадает в организм человека, но предполагают, что он может наследоваться генетически. Доктор Клейн и его коллега доктор Джо Деризи из Университета Калифорнии применили технологию "генетического чипа" (подобный диагностикум создан и российскими учеными из Института молекулярной биологии РАН. - "Известия"). На особой пластинке Деризи разместил характерные отрезки генетического материала 20 тысяч известных вирусов. Клейн предоставил ему 86 образцов тканей своих пациентов с раком простаты. Из них выделили образцы ДНК и поместили их на чип. ДНК тех 20 пациентов, у которых был обнаружен мутантный ген, совпала с ДНК онковируса мышей. Мутация представляет собой удвоение гена, кодирующего производство ферментов, которые уничтожают вторгшиеся в организм вирусы.

Оказалось, что у мужчин с удвоенным геном таких ферментов вырабатывается значительно меньше. Среди 66 пациентов с нормальным геном вирус был обнаружен лишь у одного. Ученые планируют обследовать сотни больных и здоровых, чтобы уточнить связь между наличием вируса и раком простаты.

Открытие американских ученых становится еще одним практическим подтверждением вирусогенетической теории рака, которую еще в 40-е годы ХХ века сформулировал наш соотечественник Лев Зильбер.

Лев Зильбер опередил мир на полстолетия

На вопросы "Известий" отвечает сын Льва Зильбера академик Лев Киселев.

известия: Известно, что Лев Александрович создавал свою теорию в 40-х годах в лагере. Но ведь вирусная гипотеза высказывалась и раньше?

Лев Киселев: Первые гипотезы о вирусной природе рака были высказаны в начале ХХ века, в том числе и нашим соотечественником Ильей Мечниковым. Но Лев Зильбер сформулировал целостную вирусогенетическую теорию, далеко опередившую время.

известия: Но современники не приняли новую теорию?

Киселев: Да, 20 лет он в одиночку доказывал свою правоту. Лишь в 60-х годах появились первые экспериментальные подтверждения теории. Большую поддержку оказали работы чеха Яна Свободы из Института генетики Чехословакии, он и сейчас жив.

известия: Сегодня сомнений в правоте Льва Александровича нет?

Киселев: Сегодня считается, что до 25% всех раковых опухолей возникает с участием онковирусов. Это доказано, в частности, для рака печени, который вызывают вирусы хронического гепатита В и С, для рака шейки матки (вирус папилломы человека). Есть предположения, что не без участия вирусов возникают и такие заболевания, как рак молочной железы, желудка и некоторые другие. Доказано также, что у животных вирусами вызываются все опухоли. Слова отца "рак - это заболевание генома" оказались провидческими, ведь тогда до расшифровки генома было невероятно далеко.

Великий ученый, яркий человек

Лев Зильбер родился в 1894 году во Пскове. После окончания медицинского факультета работал в Москве и Баку, участвовал в ликвидации в СССР чумы, разработал теорию клещевого энцефалита, предположив, что вирус заболевания переносится клещами. Дважды по абсурдным обвинениям находился в заключении (в 1937-39 и 1940-44 годах). За его освобождение самоотверженно боролись брат - писатель Вениамин Каверин и бывшая жена Зинаида Ермольева, известная как создательница "советского пенициллина". Известно, что брат послужил прототипом Сани Григорьева из любимой миллионами людей повести Каверина "Два капитана". Ермольевой посвящен роман "Открытая книга".

Свою теорию происхождения рака Зильбер создал в заключении, проводя опыты в научной "шарашке". Крыс и мышей ловили для него заключенные, с которыми он расплачивался табаком. Изучая механизмы развития опухолей, Зильбер пришел к выводу, что, попадая в здоровую клетку, вирус изменяет ее генетическую основу, поэтому клетка выходит из-под контроля организма и начинает беспрепятственно делиться - так возникает опухоль. Первую статью о своей теории Лев Александрович опубликовал в нашей газете в 1945 году. В том же году появилась его монография на эту тему.

МОСКВА, 1 фев – РИА Новости. Стэнфордские медики разработали новый тип иммуннотерапии, который позволяет "натравливать" иммунные клетки на конкретные опухоли и полностью уничтожать их за считанные дни, и проверили ее работу на мышах, говорится в статье, опубликованной в журнале Science Translational Medicine.

В последние годы молекулярные биологи и медики начали возлагать особые надежды на так называемую иммунотерапию при борьбе с раком, аллергией, диабетом и другими пока неизлечимыми заболеваниями. Она очень проста по своей сути – ученые пытаются "натравить" иммунитет человека на раковые клетки, используя различные антитела, живых микробов и ряд других необычных "приманок".

На сегодня уже существует несколько видов иммунотерапии, успешно прошедших клинические испытания и одобренных регулирующими органами США и ряда других стран. Большая часть из них представляет собой синтетические антитела, которые цепляются за раковые клетки и делают их "видимыми" для иммунной системы.

Леви и его коллеги разработали крайне эффективную версию иммунотерапии, проверяя опасную, но потенциально революционную идею "дрессировки" иммунных клеток при помощи самой же опухоли. Для этого необходимо заставить их пробраться внутрь новообразования и начать считывать антигены, присутствующие на поверхности "взбунтовавшихся" клеток.

В прошлом, попытки реализовать подобные идеи уже заканчивались неудачно, так как многие раковые клетки или остаются "невидимыми" для иммунитета, или же они активно мешают его работе, не позволяя Т-клеткам, главным "дирижерам" иммунной системы, сблизиться с ними и опознать их.

Леви и его коллеги предположили, что эту проблему можно ликвидировать при помощи специальной комбинации из антител и сигнальных молекул, которые будут принудительно "включать" иммунные тельца и заставлять их атаковать рак, игнорируя те сигналы, которые вырабатывают опухолевые клетки.

Экспериментируя на культурах клеток, ученые обнаружили, что нужного эффекта можно добиться, используя всего две молекулы – антитело, подавляющее работу сигнального белка OX40, заставляющего Т-клетки отступить, и короткую цепочку ДНК, стимулирующую работу гена TLR9, который отвечает за активацию врожденной и приобретенной иммунной реакции.

Работу этой комбинации препаратов биологи проверили на нескольких мышах, генетически предрасположенных к развитию рака груди. Как показали их опыты, ввод этой смеси в уже сформировавшуюся опухоль привело к ее полному уничтожению уже через 10 дней, причем соседние с ней новообразования так же начали уменьшаться, несмотря на то, что ученые не пытались с ними бороться.

Более того, дальнейшие наблюдения показали, что подобная "вакцина" защитила мышей от повторного появления новых очагов рака груди, несмотря на их предрасположенность к его развитию, а также уничтожила опухоли других видов рака, имплантированных в их тело хирургическим путем.

Все это, как считает Леви, говорит о том, что подобная иммуннотерапия имеет большие клинические перспективы, если ее работоспособность будет доказана в ходе первых клинических опытов на добровольцах, которые могут начаться уже в ближайшие годы.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

Название Активация трансмембранных протеаз опухолевых клеток как причина приобретения избирательной чувствительности к онклитическому действию вируса Сендай

Руководитель Чумаков Петр Михайлович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые слова онколитические вирусы, трансмембранные протеазы, парамиксовирус Сендай, метастатический рак, раковая клетка, ген супрессор р53, репликация вирусов, инфекционность, терапия рака

Код ГРНТИ 34.15.00

Статус Успешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Метастатический рак по прежнему остается во многих случаях неизлечимым заболеванием. Современные подходы к химиотерапии рака приближаются к пределу своих возможностей. Однако большие надежды для медицины будущего связаны с использованием методов биотерапии рака. Проект направлен на изучение механизмов вирусного онколиза с помощью мышиного парамиксовируса Сендай. Исследование возможности использования вирусов для терапии рака представляет активно-разрабатываемое направление онкологии и вирусологии. Опухолевые клетки как правило приобретают повышенную чувствительность к вирусам, благодаря утрате механизмов противовирусной защиты а также изменению метаболизма и регуляции процессов биосинтеза. Особое значение для активного внедрения онколитических вирусов в медицинскую практику имеют вопросы безопасности таких вирусов для пациентов и экологии. В связи с этим использование непатогенных вирусов животных, обладающих онколитическим потенциалом против опухолей человека представляет несомненный интерес. Мышиный парамиксовирус Сендай непатогенен для человека и вызывает респираторное заболевание у мышей. Он способен размножаться исключительно в дыхательном эпителии, благодаря тому что созревание инфекционного вируса требует экзогенных трипсин-подобных протеаз, секретируемых легочным эпителием. В тоже время, наши исследования указывают на способность опухолевых клеток человека поддерживать продукцию инфекционно-компетентного вируса. Существующие данные указывают участие в созревании вируса трансмембранных сериновых протеаз II типа, которые активируются в ряде опухолевых клеток человека. Провидимому именно за счет активации этих протеаз вирус Сендай приобретает онкоселективность и онколитическую активность, позволяющую рассматривать его в качестве терапевтического средства. Мы планируем проведение исследования ставящего целью установления насколько часто опухоли человека приобретают чувствительность к вирусу Сендай за счет активации трансмембранных протеаз, какие типы протеаз обуславливают онкоселективность вируса, и как можно использовать это свойство для совершенствования методов терапии рака. Мы планируем разработку подхода, позволяющего предсказывать чувствительность того или иного типа рака к онколитической терапии в помощью вируса Сендай, а также отработку метода доставки инфекционного вируса в опухоль и отдаленные метастазы с помощью клеточных носителей экспрессирующих трансмембранные протеазы и способные продуцировать инфекционные вирионы.

Ожидаемые результаты
Планируемое исследование позволит установить новый ранее неизвестный механизм онкоселективности вируса Сендай и обосновать его пригодность для использования в качестве безопасного и эффективного терапевтического противоракового средства. Установление корреляции между активацией трансмембранных протеаз в опухолевых клетках человека и приобретением чувствительности к онколитическому действию вируса Сендай позволит проводить предсказания эффективности терапии с помощью вируса в отношении опухоли конкретного пациента. Планируемое исследование позволит также создать клеточную систему для эффективной доставки инфекционного вируса в опухоли и отдаленные метастазы, что позволит существенно повысить успех терапевтического воздействия. Результаты работы будут опубликованы в научных статьях и популярных изданиях для информирования общественности об успехах в области медицины.

Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Ранее при размножении вируса Сендай на клетках почки человека или собаки было установлено, что в культуре клетки не обладают достаточной эндогенной протеазной активностью для того чтобы осуществить расщепление вирусного фузигенного белка F до активной формы F1, необходимой для проникновения вируса в клетку. Продуцируемые вирусные частицы лишены инфекционности, и поэтому для получения инфекционного вирусного стока требуется добавление экзогенного трипсина. В тоже время, известно, что вирус Сендай обладает онколитической активностью и способен разрушать опухоли как на животных моделях, так и при испытаниях на людях. В то же время, часть опухолей оказывается устойчивой к онколитическому действию вируса. Проведенные нами ранее предварительные исследования позволили предположить, что в основе чувствительности некоторых опухолей человека лежит активация эндогенных протеаз, которые способны процессировать фузигенный белок вируса Сендай и обуславливать размножение вируса в опухоли в течение нескольких инфекционных циклов. Активация эндогенных протеаз в опухолях может быть причиной для онкоселективности вируса Сендай, а предварительное выявление активации протеаз в образце опухоли пациента может позволить проведение прогнозирования по поводу индивидуальной чувствительности данной опухоли к вирусной терапии. Для проверки этой гипотезы мы провели скрининг 61 линий злокачественных клеток человека различного гистогенеза на способность продуцировать инфекционные вирионы вируса Сендай, способные к повторному заражению клеток. Было установлено, что 42 линии (68.8%) были способны продуцировать инфекционные вирионы, содержащие процессированный белок F. Среди этих линий отобраны наиболее подходящие для дальнейших исследований представители линий клеток двух типов (способные и неспособные продуцировать инфекционные вирионы). Для выявления экспрессии трансмембранных трипсин-подобных протеаз, способных осуществлять процессирование белка F, были отработаны условия для детекции транскриптов соответствующих генов с помощью ПЦР в реальном времени. Среди инфекционно-компетентных линий клеток обнаружены линии с повышением эндогенного уровня транскриптов протеазы TMPRSS2, в то время как среди инфекционно-некомпетентных линий таких изменений не выявлено. Для установления причинно-следственной связи между экспрессией протеаз и способностью продуцировать инфекционные вирионы нами были сконструированы плазмиды для выключения гена TMPRSS2 с помощью РНК интерференции (экспрессия shRNA) и геномных нокаутов (система CRISPR/Cas9). Получены данные о роли подавления гена-супрессора р53 в приобретении чувствительности клеток к вирусу Сендай. Подобраны и отработаны модели для опытом in vivo с использованием иммунодефицитных мышей, в том числе модель множественных опухолей у одного животного и их выявление с помощью компьютерной томографии. Полученные экспериментальные данные и методические разработки будут использованы на последующих этапах исследования.

1. Chumakov PM Oncolytic virus therapy: problems to be solved Acta Naturae, 2015, January (год публикации - 2015).

2. Kochneva G, Zonov E, Grazhdantseva A, Yunusova A, Sibolobova G, Popov E, Taranov O, Netesov S, Chumakov P, Ryabchikova E. Apoptin enhances the oncolytic properties of vaccinia virus and modifies mechanisms of tumor regression Oncotarget, 2014 Oct 15. pii: 2579 (год публикации - 2014).

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Определена способность 15 линий клеток опухолей человека различного гистогенеза поддерживать размножение вируса Сендай и секретировать инфекционно-компетентные вирионы. Установлена корреляция чувствительности линий с экспрессией ряда генов, относящихся к протеазным сигнальным путям. Помимо двух трансмембранных протеаз TMPRSS2 и TMPRSS11B с чувствительностью к вирусу положительно коррелировала экспрессия генов дипептидил пептидазы DPP9, карбоксипептидазы CPN1, напсина А NAPSA, катепсина К CTSK, катепсина А CTSA, протеазы PSA PROS1, аланил-аминопептизады ANPEP и карбоксипептидазы М CPM. Характер изменений активности генов протеаз зависел от тканевой принадлежности опухоли. Получено девять первичных культур (прошедших не более 6 пассирований) от пациентов рака молочной железы и шесть культур от пациентов рака простаты. Определена относительная чувствительность к вирусу Сендай внутри этой группы культур. С помощь. ПЦР в реальном времени определены уровни экспрессии 23 генов представителей протеазных сетей клетки, функционирующих во внеклеточном пространстве. Чувствительность культур достоверно положительно коррелировала с экспрессией четырех генов, кодирующих протеазу TMPRSS2 (наибольший вклад), карбоксипептидазу М СРМ, катепсин L2 CTSL2 и дипептидил пептидазу 4 DPP4. Для установления роли протеазы TMPRSS2 в чувствительности опухолевых клеток к вирусу Сендай проведено выключение этого гена с помощью РНК интерференции. Экспрессия этого гена существенно влияло на способности вируса размножаться в клетках CaCo2, но не в H1299, что указывает на ткане- и опухольспецифические различия в причинах приобретения чувствительности к вирусу. Изучена способность ряда клеток (куриные фибробласты из 5-дневных эмбрионов, периферические лимфоциты, активированные лимфоциты, индуцированные дендритные клетки, линий клеток MDCK экспрессирующая протеазу TMPRSS2) функционировать в качестве носителя для переноса вируса в чувствительные раковые клетки. Максимальной способностью заражать чувствительные клетки обладали дендритные клетки, меньшей - активированные лимфоциты, клетки куриных эмбрионов и трансгенные клетки MDCK экспрессирующие протеазу TMPRSS2, еще меньше – периферические лимфоциты крови. Проведено испытание различных способов доставки вируса в подкожные ксенографты опухолей человека на бестимусных мышах. При введении в хвостовую вену доставка была возможна с использованием 1000 зараженных вирусом клеток. Введение препаратов вируса внутрибрюшинно и подкожно оказалось малоэффективным. Установлено, что повышение чувствительности клеток рака легкого А549 к вирусу Сендай при выключении гена р53 коррелирует с увеличением экспрессии генов протеаз CPM, ANPEP, PLAU, MMP2, CPE, CPA4, ADAMTS5, TRHPE, FBXL2 и CPQ. По-видимому эти гены супрессируются р53 дикого типа, и при его утрате происходит активация транскрипции ряда протеаз, вызывая повышение чувствительности к вирусу Сендай.

1. Matveeva OV, Guo GS, Senin VM, Senina AV, Shabalina SN, Chumakov PM Oncolysis by paramyxoviruses: preclinical and clinical studies Molecular Therapy - Oncolytics, 2, 150017; doi:10.1038/mto.2015.17 (год публикации - 2015).

2. Matveeva OV, Kochneva GV, Netesov SV, Onikienko SB, Chumakov PM Mechanisms of Oncolysis by Paramyxovirus Sendai Acta NAturae, 7 № 2 (25) 2015 (год публикации - 2015).

3. Matveeva, O. V. Guo, Z.-S. Shabalina, S.V. Chumakov, P. M. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficacy Molecular Therapy - oncolytics, 2, 15011; doi:10.1038/mto.2015.11; (год публикации - 2015).

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение заключительного этапа проекта по изучению роли трансмембранных протеаз в созревании онколитического вируса Сендай получены важные данные о механизме приобретения фенотипа опухолевых клеток, сопровождающегося повышенной активностью клеточных сериновых протеаз, способных процессировать F белок вируса Сендай. Вирус Сендай требует активности протеза хозяина для полного созревания и дальнейшей возможности для новообразованного вируса заражать опухолевые клетки и осуществлять онколиз. Ранее в своих исследованиях мы концентрировались на изучении изменений экспрессии самих трансмембранных протеаз в опухолевых клетках, выясняли как это коррелирует с приобретением чувствительности к вирусу и с экспрессией других генов. Однако полученные результаты были недостаточными для того чтобы делать вывод о четкой корреляции чувствительности к вирусу Сендай и изменениями экспрессии трансмембранных протеаз, по крайней мере на транскрипционном уровне. Кроме этого, применение стандартных линий опухолевых клеток имеющих разное тканевое происхождение не позволяло сделать определенные выводы, так как многие из генов могут иметь тканеспецифическую регуляцию. На данном этапе мы использовали полученную нами панель опухолевых культур ранних пассажей, полученные от пациентов рака простаты и рака молочной железы. Было исследовано 14 культур рака простаты и 8 культур рака молочной железы. Для более количественной оценки способности вируса Сендай заражать клетки нами был разработан новый количественный метод, основанный на проточной цитометрии. С помощью этого метода определена способность культур рака простаты продуцировать зрелый вирус и проведена классификация культур по их способности в той или иной степени процессировать инфекционно-активные вирионы. Во всех линиях клеток определен функциональный статус гена р53 с помощью введения р53-зависимого транскрипционного репортера и индукции активности р53 с помощью обработки 5-фторурацилом. В линиях клеток с нарушенной функциональностью р53 с помощью секвенирования фрагментов кДНК идентифицированы миссенс мутации в кодирующих участках гена р53. Наиболее характерные линии клеток, различающиеся по способности продуцировать зрелые вирионы и по состоянию гена р53 подвергнуты транскриптомному анализу. Было подтверждено, что линии клеток в большей мере способные продуцировать зрелый вирус, имеют несколько повышенный уровень экспрессии генов TMPRSS2 и TMPRSS11B. Однако наиболее сильные изменения транскрипции были обнаружены нами для генов, кодирующих ингибиторы сериновых протеаз, серпины - маспин и PAI-1. Также в клетках карциномы простаты выявлено повышение уровня экспрессии гена, кодирующего простат-специфический антиген. Интересно что два обнаруженных гена серпинов позитивно регулируются активностью гена р53. По нашим прежним опубликованным данным простат-специфический антиген находится под негативным контролем со стороны р53. Это навело на мысль что как различия в экспрессии указанных генов так и чувствительность к вирусу Сендай могут быть опосредованы статусом гена р53. Анализ экспрессии указанных генов с помощью ПЦР в реальном времени в остальных культурах опухолей простаты и молочной железы подтвердил существование строгой корреляции между экспрессией этих генов и статусом р53. Все эти три р53-регулируемых гена изменяли свою экспрессию в клетках раков простаты при выключении р53 с помощью РНК интерференции. В раках молочной железы уровни PAI-1 были существенно ниже и не регулировались р53, а уровень экспрессии PSA практически не определялся, что указывает на тканеспецифичность экспрессии этих генов. Выключение гена р53 приводило также к приобретению повышенной способности продуцировать зрелые вирионы Сендай. Таким образом мы установили, что в качестве одного из основных механизмов приобретения опухолями способности продуцировать зрелый вирус Сендай является утрата активности опухолевого супрессора р53. В результате потери функции р53 происходит утрата экспрессии ингибиторов сериновых протеаз семейства серпинов, а в случае рака простаты - к повышению экспрессии протеазы PSA. Эти изменения, очевидно, могут приводить к каскадным изменениям активности ряда протеаз, в том числе трансмембранных протеаз, принимающих участие в созревании вируса Сендай. Однако эти изменения могут плохо детектироваться на транскрипционном уровне, поскольку осуществляются за счет протеолиза. Таким образом статус гена р53 может служить одним из предикторов чувствительности опухолей человека к вирусу Сендай. Мы также провели испытание ранее разработанных нами двух клеточных моделей для системной доставки вируса Сендай в опухоли, которые основаны на клетках ранних куриных эмбрионов и индуцированных in vitro дендритных клетках человека, нагруженных предварительно вирусом Сендай. Мы установили возможность системной доставки вируса Сендай в опухоли с помощью нагруженных вирусом дендритных клеток при их внутривенном введении. Все основные цели проекта были выполнены.

1. Жирнов О.П., Манякин А.А., Россман Ю.С., Кленк Х.Д. Intravirion cohesion of matrix protein M1 with ribonucleocapsid is a prerequisite of influenza virus infectivity Virology, 492, 187–196 (год публикации - 2016).

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.