Способы инактивации вирусов в

Иммуноглобулины человека – группа иммунобиологических препаратов крови, потребность в которой неуклонно растет во всем мире. Препараты иммуноглобулинов человека представляют собой выделенную промышленным способом иммунологически активную белковую фракцию плазмы крови здоровых доноров, несущую антительную активность различной специфичности. Несмотря на то, что препараты иммуноглобулинов содержат преимущественно иммуноглобулины класса G – антитела против различных возбудителей бактериальных и вирусных инфекций и/или их токсинов, спектр их применения не ограничивается традиционной заместительной и иммуномодулирующей терапией при первичных гуморальных иммунодефицитах, а также проведением специфической профилактики и лечения бактериальных и вирусных инфекций. Уже сейчас в применении препаратов иммуноглобулинов человека неврологические показания составляют 42 %, первичные иммунодефициты – 33 %, гематоонкология – 18 % мирового потребления [31]. Приблизительно в 33 % случаев препараты иммуноглобулинов человека применяются не по показаниям (off-label) при более чем 50 заболеваниях, например, при лечении дерматомиозитов/полимиозитов, хронического идиопатического и комплексного регионального болевого синдрома, тяжелой диабетической полинейропатии, глиобластомы, нейробластомы, аутоиммунной вегетативной ганглиопатии, педиатрических аутоиммунных нейропсихиатрических нарушений, ассоциированных со стрептококковой инфекцией, и других [13].

На Российском фармацевтическом рынке зарегистрировано 115 наименований препаратов крови человека отечественного и зарубежного производства [1].

Из них 46 % наименований, представлены препаратами иммуноглобулинов человека нормальными, специфическими и специального назначения для внутривенного и внутримышечного введения. Современный прогресс препаратов иммуноглобулинов человека обусловлен не только улучшением их эффективности и расширением показаний к их применению в клинической практике, но и достижениями, связанными с обеспечением их качества и безопасности. Вопрос безопасности препаратов иммуноглобулинов человека, прежде всего, рассматривается в аспекте обеспечения вирусной безопасности, так как для их производства используется биологический материал, потенциально содержащий возбудители гемотрансмиссивных инфекций. Не все возбудители гемотрансмиссивных инфекций, которые могут присутствовать в донорской крови, могут передаваться при применении препаратов иммуноглобулинов человека. Основными вирусными контаминантами, ассоциированными с препаратами иммуноглобулинов человека, являются вирус иммунодефицита человека 1 и 2 типов, вирусы гепатита В, С, А, парвовирус В19 [12].

Отбор доноров осуществляется в соответствии с Международной программой качества плазмы (IQPP) [21]. В соответствии с этой программой потенциальный донор должен получить статус квалифицированного, обязывающий его пройти два отдельных медицинских обследования и лабораторный контроль на отсутствие антител к основным гемотрансмиссивным инфекциям (вирусу иммунодефицита человека, вирусу гепатитов В и С). Если донор не появляется в учреждении по заготовке плазмы в течение 6 месяцев, то он теряет статус квалифицированного донора. Плазма от первичного донора не может быть использована для получения препаратов крови даже при отрицательном результате лабораторных исследований. Информация о донорах вносится в национальный регистр с целью недопущения к сдаче плазмы крови донора, не прошедшего квалификацию. Для снижения возможного риска передачи болезни Крейцфельда-Якоба (CJD) и вариантной болезни Крейцфельда-Якоба (vCJD) введены критерии исключения для доноров, гарантирующие безопасность: отсранение лиц, у которых были диагностированы CJD и vCJD, доноров, которые перенесли трансплантацию твердой мозговой оболочки или роговицы, или получали гипофизарный гормон роста, доноров, у которых есть один или несколько родственников с болезнью Крейцфельда-Якоба. Доноры, постоянно пребывающие в Соединенном Королевстве и подвергающиеся риску развития вариантной болезни Крейцфельда-Якоба, а также доноры, которые суммарно провели в Соединенном Королевстве с 1980 по 1996 гг. три месяца или более (для доноров США) или двенадцать месяцев или более, отстраняются от донорства бессрочно [18].

Для производства препаратов иммуноглобулинов человека используют плазму человека для фракционирования [41], полученную из крови не менее чем от 1000 здоровых доноров. Качество и безопасность плазмы для фракционирования является фундаментом производства современных препаратов иммуноглобулинов человека. Передача плазмы для фракционирования в производство включает тестирование индивидуальных донаций, мини-пулов и производственного пула на маркеры вирусных инфекций [3, 22]. Тестирование индивидуальных донаций осуществляют иммуноферментным методом на содержание поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов, и антител к вирусу гепатита С. Национальные органы контроля могут принять решение о необходимости выполнения дополнительного теста на содержание аланинаминотрансферазы. Тестирование индивидуальных донаций в Российской Федерации на предприятиях по фракционированию проводится по такой же схеме, с обязательным определением отсутствия содержания антител к возбудителю сифилиса. Тестирование мини-пулов проводят и иммуноферментным методом и методом ПЦР. Обязательным является определение отсутствия содержания антител к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов, поверхностного антигена вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С иммуноферментным методом. Далее с использованием ПЦР технологии исследуют мини-пулы на отсутствие содержания маркеров РНК-содержащих вирусов: иммунодефицита человека 1 и 2 типов, вируса гепатита С и ДНК-содержащего парвовируса В19. Выявление РНК вируса гепатита А и ДНК вируса гепатита В методом ПЦР проводится на усмотрение производителя. В Российской Федерации определение ДНК парвовируса В19 и РНК вируса гепатита А не предусмотрено. Для формирования производственного пула допускаются только мини-пулы плазмы, содержащие не более 104 МЕ/мл ДНК парвовируса В19 и отрицательные в отношении маркеров вирусных инфекций [22]. Тестирование производственного пула осуществляют иммуноферментным методом на содержание поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и к вирусу гепатита С и методом ПЦР на содержание маркеров РНК-содержащих вирусов: иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), гепатита С и ДНК-содержащих парвовируса В19 и вируса гепатита В. Тестирование методом ПЦР на содержание РНК вируса гепатита А и ДНК парвовируса В19 в Российской Федерации является необязательным [3].

Современные технологии фракционирования белков плазмы крови человека сочетают очистку протеинов с инактивацией и удалением вирусов. Преципитация с помощью этанола – наиболее широко используемый метод фракционирования плазмы. Помимо того, что этанол выступает в качестве преципитанта, он также обладает дезинфицирующими свойствами, которые, однако, наиболее выражены при положительных температурах. Вирусы как большие структуры имеют тенденцию преципитировать в начале процесса фракционирования, когда концентрация этанола относительно низкая. В результате этой стадии преципитации происходит распределение вирусов между фазами, что, однако, не исключает возможность вирусной контаминации на стадиях получения готового продукта. Метод этанольного фракционирования доказал свою эффективность в обеспечении вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов [17]. Однако его необходимо дополнять более эффективными методами и инактивации и удаления вирусов. Поиск и совершенствование методов инактивации и удаления вирусов основывался на использовании как физических факторов, так и химических реагентов. Внедрение в производство таких методов, как пастеризация, энзимный протеолиз при низких значениях рН, обработка ß-пропиолактоном в сочетании с ультрафиолетовым облучением, значительно повысило вирусную безопасность препаратов иммуноглобулинов. В то же время, эти методы имели ряд технологических недостатков, оказывали влияние на качество и эффективность конечного продукта и требовали доработки. Поэтому дальнейшее совершенствование технологии производства препаратов иммуноглобулина было направлено на повышение вирусной безопасности препаратов при сохранении иммунобиологических свойств и соответственно высокой терапевтической эффективности. На сегодняшний день при производстве современных препаратов иммуноглобулинов человека используют такие методы инактивации и элиминации вирусов, как сольвент-детергентный метод, метод обработки октановой (каприловой) кислотой и ацетатом кальция, метод инкубирования при низких значениях рН, пастеризация и метод нанофильтрации [5].

Использование: вирусология, биотехнология. Сущность изобретения: проводят инактивацию вирусов в крови и ее компонентах путем смешения обрабатываемого раствора или суспензии с фенотиазиновым красителем и последующего облучения светом, при этом фенотиазиновый краситель используют в концентрации 0,1 - 10 мкмоль, причем облучение осуществляют непосредственно в прозрачных емкостях, служащих для взятия и хранения крови. 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 15 табл.

Изобретение касается борьбы с вирусами, в частности инактивации вирусов в крови и ее компонентах.

Известен способ инактивации вирусов, при котором вирусы в виде жидкости смешивают в колбе с фенотиазиновым красителем с последующим облучением светом (см. В. Снайпес и др. 1979 г. Photochem. и Photobiol. 29, стр. 785-790). При переносе известного способа на инактивацию вирусов в крови и компонентах крови было установлено, что при этом имела место инактивация не только вирусов, но и белков плазмы крови, как, например, факторов свертывания.

Цель изобретения разработать простой способ инактивации вирусов в крови и ее компонентах, при котором различного рода вирусы умерщвляются без существенного функционального влияния на белки плазмы крови.

Поставленная задача решается в способе инактивации вирусов в крови и ее компонентах путем смешения обрабатываемого раствора или суспензии фенотиазиновым красителем и последующего облучения светом за счет того, что фенотиазиновый краситель используют в концентрации 0,1-10 мкмоль, причем облучение осуществляют непосредственно в прозрачных емкостях, служащих для взятия и хранения крови. Облучение осуществляют дневным светом достаточной интенсивности или монохроматным светом, предпочтительно источника холодного света, имеющего длину волн в области максимума абсорбции соответствующего красителя. Кроме того, при инактивации вирусов в плазме крови или в растворах белков плазмы крови необходимо соблюдать следующие условия. Рабочая температура должна составлять 0--37 о С, но по возможности 4-20 о С. Процесс инактивации длится, в частности, от 5 мин до 5 ч, предпочтительно от 10 мин до 3 ч. Величина рН обрабатываемой среды должна составлять 5-9, предпочтительно 6-8.

Было установлено, что не имеющий оболочку вирус, как, например, аденовирус, который нельзя инактивировать в плазме в физиологических условиях, можно фотосенсибилизировать путем приемов замораживания и последующего оттаивания, после чего можно успешно проводить инактивацию. При этом инактивацию можно установить независимо от последовательности приемов замораживания и последующего оттаивания и добавления красителя. Под замораживанием понимается процесс глубокого замораживания разжиженными газами в качестве хладагента при температуре примерно от -20 о С до 80 о К. Как правило, замораживание осуществляют при температуре -30 о С.

Инактивацию вирусов можно проводить непосредственно в мешках, предназначенных для хранения крови или плазмы крови, хотя эти мешки обладают лишь ограниченной светопропускаемостью. В таком случае предлагаемый способ сводится лишь к добавлению красителя с последующим облучением мешка вместе с его содержимым. Затем соответствующий продукт может далее обрабатываться.

Таким образом, предлагаемый способ можно осуществлять простыми техническими средствами и поэтому он может интегрироваться в технологический процесс обработки донорской крови в соответствующих хранилищах. Незначительное количество добавляемого красителя может оставаться в далее обрабатываемой жидкости. В случае необходимости его можно удалить при помощи адсорбера. Под понятием крови и ее компонентов понимаются: цельная кровь, концентраты эритроцитов, концентраты тромбоцитов, плазма крови, сыворотка, криоосадок, концентраты факторов свертывания, ингибиторы, фибронектин, альбумин.

Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что, начиная с концентрации метиленового синего, равной 0,5 мкмоль, инфекционный титр вируса уменьшается более чем на 6 десятичных степеней.

П р и м е р 2. Данный опыт подтверждает инактивацию вируса при низких концентрациях красителя.

Аликвоты плазмы крови объемом 500 мкл, содержащие везикулярно-стоматитный вирус и различное количество метиленового синего, подвергают облучению при помощи размещенного на расстоянии 30 см диапроектора в холодильной камере. Пробы А-Е облучают, а проба Ж остается необлученной.

Результаты опыта сведены в табл. 3. Они показывают, что в данных условиях указанный вирус инактивируется более чем на 4 десятичные степени. Для этого необходима концентрация метиленового синего, равная 0,5 мкмоль. Одна инкубация в течение ночи при 4 о С вероятно приводит к уменьшению титра вируса на 1-2 десятичные степени, что может являться объяснением для относительно низкого исходного титра. Но это обстоятельство подробно не исследовалось.

Сравнение результатов инактивации облученной пробы А с пробой Ж (только хранение в темноте) показывает, что один свет очевидно не оказывает большого влияния на инфекционность вируса.

П р и м е р 3. Исследуется зависимость фотоинактивации вирусов в присутствии фенотиазиновых красителей от продолжительности облучения. При этом 10 6 пятнообразующих единиц на мл суспендируют в плазме крови и пробы облучают описанным в предыдущих примерах образом при 22 о С в течение указанного в табл. 4 времени. По данным табл. 4 видно, что в данных условиях одночасовое облучение достаточно для уменьшения инфекционного титра везикулярно-стоматитного вируса более чем на 6 десятичные степени.

П р и м е р 4. Повторяют пример 3 с той разницей, что инактивацию проводят в присутствии 1 мкмоль толуидинового синего. Результаты опыта, сведенные в табл. 5, свидетельствуют о том, что везикулярно-стоматитный вирус может эффективно инактивироваться и в присутствии толуидинового синего.

В присутствии фенотиазиновых красителей можно также инактивировать вирус пузырькового лишая HSV, а также вирус спида HIV-1, о чем свидетельствуют результаты примеров 5 и 6.

П р и м е р 5. Инактивацию вируса НSV осуществляют в присутствии 1 мкмоль метиленового синего. В табл. 6 сведены данные по кинетике фотоинактивации вируса HSV.

П р и м е р 7. Инактивация не имеющих оболочку вирусов в обычных физиологических условиях в присутствии 80% плазмы не увенчалась успехом. При этом в качестве примера вируса без оболочки применялся аденовирус, который предварительно инкубируют в течение указанного в табл. 8 времени при 4 о С в темноте в присутствии 1 мкмоль метиленового синего. Затем осуществляют 30-минутное облучение при помощи галогеновой лампы освещенностью 150 000 люкс. При этом инфекционность аденовируса остается неизменной. Результаты опыта сведены в табл. 8.

При применении толуидинового синего в тех же экспериментальных условиях также не наблюдается уменьшения титра вируса.

Для достижения инактивации аденовируса в процесс включают приемы замораживания и оттаивания (далее: "за/от"), при этом замораживание осуществляют до -30 о С. Последовательность приемов за/от и момент добавления красителя (1 мкмоль метиленового синего) играют лишь второстепенную роль. Облучение проб осуществляют при помощи галогенной лампы освещенностью 120 000 люкс. Результаты опыта сведены в табл. 9.

П р и м е р 8. Данный опыт направлен на исследование влияния красителя в различных концентрациях на активность факторов свертывания. При этом по 2 мл аликвоты плазмы крови человека смешивают с различными количествами метиленового синего. Непосредственно после добавления красителя измеряют активность факторов свертывания V, VIII и IX. Как видно по данным табл. 10, все факторы свертывания ингибируются в зависимости от концентрации красителя, т. е. ингибация факторов VIII и V начинается с концентрации примерно 10 мкм, а фактор IX уже ингибируется при наличии красителя в концентрации примерно 2,5 мкм. Таким образом, метиленовый синий в более высоких концентрациях влияет непосредственно на белки без воздействия света.

Результаты опыта сведены в табл. 10.

П р и м е р 9. На активность факторов свертывания влияет не только концентрация красителя, но и время облучения. Эта зависимость исследуется в данном примере. Для этого аликвоты (2 мл) плазмы крови человека смешивают с различными количествами метиленового синего и подвергают облучению описанным в примере 1 образом в течение 1-4 ч. Контрольные пробы не подвергают фотообработке. Данные табл. 11 показывают, что активность трех факторов свертывания V, VIII и IX ингибируется в зависимости от времени облучения и концентрации красителя. В частности данные по факторам свертывания VIII и IX свидетельствуют о том, что более высокая концентрация метиленового синего и облучение светом с продолжительностью от 2 ч приводит, очевидно, к усилению тромболитического эффекта.

П р и м е р 10. Согласно изобретению фотоинактивацию вирусов осуществляют непосредственно в прозрачных емкостях, служащих для взятия и хранения крови или ее компонентов, после предварительного добавления красителя в требуемом количестве. Таким простым путем можно в любой момент обрабатывать кровь и ее компоненты отдельных доноров.

Данные табл. 12 свидетельствуют о том, что уже концентрация 1 мкмоль метиленового синего достаточна для снижения инфекционного титра везикулярно-стоматитного вируса больше чем на три десятичные степени. Даже при отсутствии красителя облучение проводит к снижению титра вируса, однако только примерно на 50% При концентрациях до 1 мкмоль применяемые для инактивации вирусов фенотиазиновые красители могут оставаться в крови или ее компонентах без каких-либо побочных действий. Но они могут также удаляться с помощью диализа, гель-фильтрации или адсорбции. Наибольший интерес представляет адсорбция, так как она связана с наименьшими затратами времени и технологии и кроме того соответствующие растворы белков не нуждаются в разбавлении. Было установлено, что метиленовый синий и другие фенотиазиновые красители связываются с различными, имеющимися в продаже разделительными гелями, в том числе и с такими гелями, которые не обладают способностью к связыванию белков или же обладают лишь слаборазвитой способностью к их связыванию. Таким образом, такие адсорбенты особенно пригодны для последующего удаления фотоокислителя. Из числа исследованных адсорбентов для отделения метиленового синего и других фенотиазиновых красителей можно с успехом применять агенты, приведенные в табл. 13.

В большинстве случаев для полной экстракции из раствора белков плазмы метиленового синего в концентрациях 10 мкмоль достаточно 2 г соответствующего адсорбента. Наиболее подходящими оказались два типа адсорбентов.

2. Гели на основе полистирола и дивинилбензола или полимеров сложных эфиров акриловой кислоты. Примерами имеющихся в продаже гелей этих типов являются амберлиты, выпускаемые, например, инофирмой Рем унд Хаас, г. Франкфурт на Майне, ФРГ, и био бидс инофирмы Био Рад, г. Мюнхен, ФРГ. Они в основном служат для удаления неполярных или поверхностно-активных веществ, например моющих агентов, из водных растворов. Они являются неполярными или же лишь слабополярными.

Результаты опыта сведены в табл. 14.

По данным экстинкции видно, что наряду с красителем из плазмы очевидно экстрагируются еще другие вещества, которые, однако, не представляют собой белки плазмы. Данные по экстинкции плазмы, обработанной 100-250 мг адсорбента на 5 мл, т.е. 2-5 мас./ на объем, едва ли отличаются от тех данных экстинкции проб, которые экстрагировались 10 мас. адсорбента/ объем пробы. Следовательно, при концентрации метиленового синего 10 мкм достаточно применение адсорбента в количестве 2-5 мас./объем пробы с тем, чтобы в случае периодического осуществления процесса полностью удалять краситель из плазмы. При меньших концентрациях красителя требуется соответственно меньший расход адсорбента.

П р и м е р 13. В данном примере исследуют возможность адсорбционного удаления метиленового синего из раствора белков плазмы крови путем колоночной хроматографии. В основу такого метода положена идея о том, что после инактивации вирусов с помощью красителя и облучения раствор белков плазмы можно пропускать через колонку с адсорбентом и оттуда подавать в дальнейшую емкость, служащую для хранения обработанного раствора. При этом колонку можно размещать между обеими емкостями. Таким образом, возможно предварительное изготовление узла, состоящего из двух емкостей с размещенной между ними адсорбционной колонкой. Тем самым можно создать замкнутую систему, которая намного снижает риск заражения прошедшего инактивацию вируса препарата белков плазмы, в том числе и препаратов от отдельных доноров.

Данный опыт осуществляют следующим образом.

Результаты данного опыта показывают, что хроматографическое удаление фотоокислителя можно осуществлять безо всяких проблем. С другой стороны, доказана вышеупомянутая возможность получения содержащих инактивированные вирусы препаратов белков плазмы от отдельных доноров.

1. СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ В КРОВИ И ЕЕ КОМПОНЕНТАХ путем смешения обрабатываемого раствора или суспензии с фенотиазиновым красителем и последующего облучения светом, отличающийся тем, что фенотиазиновый краситель используют в концентрации 0,1 10 мкмоль, причем облучение осуществляют непосредственно в прозрачных емкостях, служащих для взятия и хранения крови.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фенотиазинового красителя используют толуидиновый синий или метиленовый синий.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что облучение осуществляют видимым светом в области максимума абсорбции соответствующего красителя.

4. Способ по одному из пп. 1 3, отличающийся тем, что облучение осуществляют при рН среды 5 9.

5. Способ по одному из пп.1 4, отличающийся тем, что облучение осуществляют в течение 5 300 мин.

6. Способ по одному из пп.1 5, отличающийся тем, что облучение осуществляют при 0 37 o С.

7. Способ по одному из пп.1 6, отличающийся тем, что обрабатываемый раствор или суспензию подвергают предварительному замораживанию с последующим оттаиванием перед облучением.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что краситель добавляют перед процессом замораживания.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что краситель добавляют после оттаивания.

10. Способ по одному из пп.1 9, отличающийся тем, что после облучения кровь или ее компоненты пропускают через адсорбент для удаления красителя.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что для его осуществления используют две емкости, пригодные для взятия крови, с размещенной между ними адсорбционной колонкой.

12. Способ по п.10 или 11, отличающийся тем, что в качестве адсорбента используют агент из группы, включающей силикагель, гель на основе полистирола и дивинилбензола, полимеры сложных эфиров акриловой кислоты.

Позволяет уничтожить гемотрансмиссивные вирусы: ВИЧ, вирусы гепатита В и С, ЦМВ и другие в единичной дозе плазмы. Обработка плазмы может проводиться сразу после ее заготовки или после размораживания, непосредственно перед выдачей для переливания.

Система инактивации вирусов в плазме крови Макотроник — это возможность обезопасить пациентов от возможного заражения многочисленными вирусными инфекциями.

Применение метода инактивации вирусов в плазме крови позволяет:

— обезопасить реципиентов и предотвратить передачу широкого спектра вирусных инфекций при переливании плазмы;
— значительно сократить потери плазмы;
— уменьшить затраты на проведение лейкофильтрации;
— уменьшить затраты на проведение карантинизации плазмы;
— сократить расходы на лекарственные препараты в лечебных учреждениях;
— оперативно реагировать и в кратчайшие сроки создавать запасы "безопасной" плазмы в случае возникновения чрезвычайных ситуаций.

Комплект поставки

• Устройство фотообработки плазмы крови Макотроник;
• Системный блок с установленным программным обеспечением на русском языке и проводной мышью;
• Монитор жидкокристаллический;
• Принтер с установленным картриджем для печати протоколов и графиков процедур иллюминации;
• Принтер для печати наклеек на контейнеры с плазмой;
• Устройство для считывания штрих-кода.

Метод инактивации

Применяемый метод инактивации — фотодинамический, с применением метиленовой сини. Метиленовая синь – это фенотиазиновый краситель. Красители этого класса способны внедряться в структуру нуклеиновых кислот и тесно связываться с остатками гуаносина ДНК/РНК. После фотоактивации в системе Макотроник (длина волны – 590 нм) краситель способен химически повреждать генетический материал, прерывая процесс воспроизводства вируса и препятствовать инфицированию.

Расходная система

Применяется расходная система Терафлекс-МБ-Плазма:

Описание процедуры

1. Контейнер с плазмой соединяют с расходной системой Терафлекс-МБ-Плазма с помощью аппарата для стерильного соединения магистралей. Объем дозы плазмы должен быть не менее 200 мл и не более 315 мл.

2. Фильтрация одинарной дозы плазмы через предварительный фильтр Plasmaflex, позволяющий удалить лейкоциты, тромбоциты, микроагрегаты и растворение интегрированной в расходную систему Терафлекс-МБ-Плазма таблетки метиленовой сини (содержание метиленовой сини – 85 мг).

3. Контейнер с плазмой и растворенной в ней метиленовой синью размещают в системе МАКОТРОНИК. Емкость одного цикла – 4 контейнера с плазмой. Продолжительность двустороннего облучения – 20 минут.

4. Фильтрация через фильтр Blueflex для удаления остатков метиленовой сини и продуктов фотораспада.

Компьютерный контроль

Компьютерный контроль осуществляется над всеми этапами процесса:

• Пароль для доступа пользователей и администратора;
• Автоматическая запись и хранение данных всех процедур инактивации (энергия, температура, время и т.д.);
• Мониторинг и оценка эффективности облучения;
• Автоматическая печать штрих-кодовых марок;
• Возможность внедрения радиочастотного идентификатора (RFID).

Качество и безопасность

Опыт применения системы Макотроник

Фотодинамический метод инактивации с применением метиленовой сини используется с 2001 года, успешно перелито более 4 млн. доз плазмы. Внастоящее время систему МАКОТРОНИК применяют Центры крови следующих стран:Австралия, Австрия, Аргентина, Бразилия, Германия, Голландия, Греция, Италия, Испания, Канада, Малайзия, Норвегия, Литва, Польша, Португалия, Сербия, Хорватия, Швеция, Швейцария, Япония. В России система инактивации вирусов в плазме крови Макотроник зарегистрирована в мае 2006 года. Данная технология уже используется на Ставропольской Краевой Станции Переливания Крови, Краснодарской Краевой Станции Переливания Крови, на Станциях Переливания Крови городов Сургут и Санкт-Петербург.

Инактивация вирусов в плазме крови является обязательной процедурой во многих странах Европы перед переливанием плазмы детям, роженицам, больным с иммунными нарушениями, пациентам после трансплантации органов и тканей, а также перед хирургическими операциями, требующими трансфузий больших объемов плазмы.

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 427, № 6, с. 840-843

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

РАСЩЕПЛЕНИЕ ВИРУСНОГО ГЕНОМА С ПОМОЩЬЮ ИСКУССТВЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ - НОВЫЙ СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ РНК-СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ

Поступило 06.03.2009 г.

Вирусы, содержащие геном в виде РНК, вызывают целый ряд серьезных заболеваний домашних и диких животных и являются одними из наиболее опасных для человека. Высокопатогенные РНК-вирусы такие, как вирус гриппа птиц (Avian Influenza Virus) [1], клещевой энцефалит (Tickborne encephalitis) [2], вирус Денге (Dengue virus) [3], коронавирус (SARS) [4] и т.д., создают постоянные угрозы для здоровья населения, что делает разработку новых средств и способов их инактивации одной из наиболее актуальных задач сегодняшнего дня.

В настоящее время в качестве средств инактивации вирусов используют физические методы (облучение ультрафиолетовым светом, ионизирующее излучение, нагревание при повышенном давлении) и целый ряд химических соединений (формалин, Р-пропиолактон, этиленимин, ряд детергентов, смесь поливинилпирролидона и иода PVD-I), которые различаются механизмом действия, эффективностью инактивации вируса, областью применения, токсичностью и стоимостью [5]. Спектр реагентов, позволяющих получить инактивированный вирус для приготовления цельновирионных вакцин, ограничен несколькими соединениями, это формальдегид, Р-пропиолактон [6], этиленимин и его производные [7]. Известно, что обработка вируса такими соединениями приводит к частичному разрушению вирусных антигенных детерминант и вследствие этого к снижению иммуногенных свойств вакцин, а избирательное разрушение формалином антигенных детерминант поверхностных гликопротеидов вирусов может индуцировать развитие несбалансированного иммунного ответа [8].

В настоящей работе мы предлагаем принципиально иной способ инактивации РНК-содержа-

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск

щих вирусов - разрушение их геномной РНК под действием низкомолекулярных соединений - искусственных рибонуклеаз (artificial ribonucleases, далее аРНКазы), способных эффективно расщеплять РНК в физиологических условиях. Мы показали, что искусственная рибонуклеаза ABL3C3 [9] эффективно инактивирует вирус гриппа A/WSN/33 (НШ1) и вирус клещевого энцефалита in vitro. Исследование механизма действия соединения на вирус гриппа подтвердило, что под действием химической рибонуклеазы происходит разрушение вирусной РНК. Кроме того, наши исследования выявили мембранолитическую активность данного соединения, способствующую его проникновению внутрь вириона и инактивации вируса.

В работе использовали штамм вируса гриппа A/WSN/33 (НШ1), любезно предоставленный д.б.н. Н.В. Кавериным (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН). Вируссодержа-щую аллантоисную жидкость получали при инфицировании 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ), разливали по аликвотам и хранили при -80°C до применения. В отдельных экспериментах использовали вирус, очищенный центрифугированием через раствор 20%-ной сахарозы. Получение очищенного вируса, титрование вируса на РКЭ и реакцию гемагглютинации проводили на основе общепринятых методов [10].

В экспериментах по изучению инактивации вируса клещевого энцефалита (КЭ) штамма Со-фьин использовали 10%-ную суспензию головного мозга мышей, инфицированных вирусом КЭ. Титр вируса КЭ определяли методом бляшкооб-разующих единиц (БОЕ) на монослое культуры клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ при инкубировании серийных 10-кратных разведений вируса в течение 5 сут при 37°С. Клетки фиксировали формальдегидом и для визуализации бляшек окрашивали раствором кристаллического фиолетового.

Для определения эффективности инактивации вируса гриппа под действием аРНКазы ABL3C3 ви-руссодержащую жидкость инкубировали в присут-

ствии соединения в концентрации от 107 до 103 М при 25°С или 37°С в буфере 50 мМ трис-HCl, рН 7.0, содержащего 0.2 М KCl и 0.2 мМ EDTA. Титр вируса после обработки аРНКазой определяли с помощью реакции гемагглютинации и методом фокусобразующих единиц (ФОЕ). В качестве контроля использовали нативный вирус и вирус, инкубированный в тех же условиях, но в отсутствие соединения.

Для определения титра вируса методом ФОЕ клетки MDCK выращивали в 96-луночных планшетах фирмы "Costar" в среде DMEM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (пенициллин, стрептомицин по 100 ед/мл) и 2 мМ глютамин, до образования монослоя. Затем среду убирали, клетки промывали средой для титрования вируса (среда DMEM, содержащая 2 мкг/мл трипсина) и инфицировали различными разведениями нативного вируса или вируса, обработанного аРНКазой в различных условиях. После инкубации при 37°С в течение 24 ч среду убирали, клетки промывали фосфатным буфером (PBS) и фиксировали в течение 10-15 мин в охлажденном ацетоне (100 мкл ацетона на лунку). После фиксации клетки дважды промывали PBS и обрабатывали препаратом мо-ноклональных антител к белку NP вируса гриппа А ("Chemicon") в течение 30 мин при 37°С. После инкубации с антителами клетки вновь промывали PBS, вносили антивидовые антитела, конъюгиро-ванные с пероксидазой хрена ("Sigma"). Наличие пероксидазы в комплексах на поверхности инфицированных клеток выявляли в ферментативной реакции с хромогенным субстратом 3-амино-9-этилкарбазолом (AEC) ("Sigma"). Инфицированные вирусом окрашенные клетки (фокусы) подсчитывали, используя инвертированный микроскоп ЛОМО (Санкт-Петербург).

Исследование морфологии вирусных частиц после инкубации с аРНКазой ABL3C3 проводили с помощью электронной микроскопии методом негативного контрастирования. Исследуемые образцы сорбировали в течение 1.5 мин на опорные медные сетки, покрытые формваровой пленкой, остаток жидкости убирали, сетки высушивали и помещали на 45 с в контрастирующий раствор (2%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в дистиллированной воде), остаток раствора убирали, сетки высушивали. Готовили по 4-6 сеток каждого образца и изучали в трансмиссионном электронном микроскопе Hitachi-H800 при увеличениях от 10000 до 200000.

Низкомолекулярные соединения, способные эффективно расщеплять РНК - искусственные рибонуклеазы, разработаны в ИХБФМ СО РАН. Среди аРНКаз особое место занимают соединения общей формулы ABL^Cm, в которой A - липо-фильный остаток, B - РНК-связывающий фраг-

Таблица 1. Инактивация вируса гриппа А^БК/ЗЗ (НШ1) и вируса клещевого энцефалита (штамм Со-фьин) аРНКазой АБЬЗСЗ

Вирус Концентрация ABL3C3, мM Титр вируса, lg ФОЕ/мл

инкубация с ABL3C3 2 ч при 25°C* или 18 ч при 4°C** инкубация с ABL3C3 18 ч при 37°C

Гриппа 0.05 5.7* 4.2

ИЛЬИНСКАЯ О.Н., ШАХ МАХМУД Р. — 2014 г.

AРТЕМЕНКO A. Г., KУЗЬМИН В. E., MУРАТОВ E. Н., КОРОЛЕВА Л. С., СИЛЬНИКОВ В. Н. — 2008 г.