Основные свойства вирусов и современные методы диагностики

Тема: Основные свойства вирусов и современные методы диагностики вирусных заболеваний.

Цель: Изучение свойств вирусов и методов диагностики заболеваний, вызванных вирусами.

Модуль 3. Общая и специальная вирусология.

Содержательный модуль 10. Общая вирусология.

Тема 1: Основные свойства вирусов и современные методы диагностики вирусных заболеваний.

Актуальность темы: ВИРУСЫ– особое царство ультрамикроскопических размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и являются, поэтому абсолютными внутриклеточными паразитами.

В 1892 г. русский ученый-ботаник Д.И. Ивановский, изучая мозаичную болезнь листьев табака, установил, что заболевание это вызывается мельчайшими микроорганизмами, которые проходят через мелкопористые бактериальные фильтры. Эти микроорганизмы получили название вирусов (от лат. Virus– яд). Большой вклад в изучение вирусов внесли русские вирусологи: М.А. Морозов, Н.Ф. Гамалея, Л.А. Зильбер, М.П. Чумаков, А.А. Смородинцев, В.М. Жданов и др.

Основными свойствами вирусов являются:

Содержание нуклеиновой кислоты только одного типа (ДНК или РНК);

Отсутствие способности к росту и бинарному делению;

Репликация путем воспроизводства себя из собственной геномной нуклеиновой кислоты;

Отсутствие собственных систем мобилизации энергии;

Отсутствие белок-синтезирующих систем;

Вирусы - абсолютные внутриклеточные паразиты.

Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.

Различают просто устроенные вирусы (например, вирусы полиомиелита, гепатита А) и сложно устроенные вирусы (например, вирусы кори, гриппа, герпеса, коронавирусы).

У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота связана с белковой оболочкой, называемой капсидом (от лат. capsa — футляр). Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом и вместе называются нуклеокапсидом.

Таким образом, просто устроенные вирусысостоят из нуклеиновой кислоты и капсида. Сложно устроенные вирусы состоят из нуклеиновой кислоты, капсида и липопротеиновой оболочки.

Вирионы имеют спиральный, икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии капсида (нуклеокапсида). Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вирусов гриппа, коронавирусов). Икосаэдрический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вируса герпеса).

Капсид и оболочка (суперкапсид) защищают вирионы от воздействия окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с определенными клетками, а также антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называют сердцевиной. У аденовирусов сердцевина состоит из гистоноподобных белков, связанных с ДНК, у реовирусов — из белков внутреннего капсида.

Форма вирионовможет быть различной: палочковидной (ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы), пулевидной (рабдовирусы), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ, аденовирусы), нитевидной (филовирусы), в виде сперматозоида (бактериофаги).

Размеры вирусовопределяют с помощью электронной микроскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Наиболее мелкими вирусами являются парвовирусы (18 нм) и вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным - вирус натуральной оспы (около 350 нм).

Различают ДНК- и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т. е. имеют один набор генов. Исключением являются ретровирусы, имеющие диплоидный геном. Геном вирусов содержит от шести до нескольких сотен генов и представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитевыми, однонитевыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными.

Среди РНК-содержаших вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную (геномную) функцию и функцию информационной РНК (иРНК).

Имеются также РНК-содержашие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию.

Геном вирусов способен включаться в геном клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов, например, вирусов герпеса, могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток, напоминая плазмиды.

Рак – бич человечества. По смертности он занимает второе место после сердечно-сосудистых заболеваний, по страху, который внушает людям – первое. Тысячи исследователей стремятся понять его причины, найти пути к его профилактике и лечению.

Роль вирусов в канцерогенезе

В.А. Матусевич, И.В. Стукалова

Десятки институтов и сотни лабораторий во всем мире работают над этой проблемой, пытаясь достичь успеха в ее понимании и прогресса в профилактике и лечении этого заболевания.

Современной науке известны некоторые факторы, вызывающие развитие злокачественных опухолей и, вместе с тем, ученые вынуждены констатировать, что основная часть злокачественных опухолей возникает спонтанно, то есть без видимой связи с индуцирующими агентами.

К факторам, способным вызывать развитие опухоли, относятся:

различные канцерогенные вещества,
наследственная предрасположенность,
ионизирующее излучение
опухолеродные вирусы.

Вирусно-генетическая теория возникновения опухолей, предложенная еще в 40-х годах ХХ века Л.И. Зильбером, получила за прошедшие годы многочисленные подтверждения.

В настоящее время, очевидно, что хотя вирусы и не являются единственной причиной рака, но они играют большую роль в возникновении злокачественных заболеваний как у человека, так и у животных. Характерной особенностью опухолевых заболеваний, ассоциированных с вирусами, является длительный латентный период, от момента инфекции до проявления заболевания могут пройти годы и даже десятилетия.

Согласно современным данным, этиологическими агентами около 15% опухолевых новообразований человека являются вирусы.

К таким вирусам относятся:

вирус Т-клеточного лейкоза/лимфомы (human T-leukemia/lymphoma virus),
вирус иммунодефицита человека (ВИЧ),
вирус папилломы человека (ВПЧ),
вирусы гепатита В и С,
вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ)
и другие.

Важно отметить, что некоторые вирусы ассоциированы с опухолями только одной локализации, тогда как другие — с разными злокачественными новообразованиями, что, вероятно, обусловлено тропизмом вирусов к клеточным системам определенного типа.

Вирус Т-клеточного лейкоза/лимфомы (HTLV-1). HTLV-1 – это онкогенный вирус, способный вызывать Т-клеточный лейкоз/лимфому у взрослых, а также тропический спастический парапарез и ряд других неонкологических заболеваний.

Существуют 3 основных пути передачи инфекции от инфицированных лиц:

с молоком матери;
при половом контакте;
с переливаемой кровью при гемотрансфузиях.

В настоящее время доказано, что из общего числа зарегистрированных случаев рака печени, возникновение более половины связано с инфицированием гепатитом В, четверть – с инфицированием гепатитом С и в 22% случаев причина другая.

Смертность от рака печени на планете среди всех смертностей от онкологических заболеваний занимает 3-е место после смертности от рака легкого и желудка. При этом каждая пятая диагностируемая в мире опухоль – это рак печени.

Основными методами диагностики вирусов гепатита В и С являются методы иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции.

В середине 70-х гг. прошлого века было высказано предположение, что вирус папилломы человека является этиологическим агентом рака шейки матки, и эта область онкологии и вирусологии получила стремительное развитие.

Действительно, к настоящему моменту роль ВПЧ в развитии рака шейки матки не вызывает сомнений.

Многочисленные исследования доказали, что не менее 95% злокачественных опухолей шейки матки содержат разновидности ВПЧ, принадлежащие к так называемым типам "высокого онкогенного риска" (ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов).

Среди них максимальной онкогенной активностью обладают ВПЧ 16 и 18 типов. Действительно, ВПЧ достаточно часто (примерно в 30% случаев) выявляется у абсолютно здоровых женщин.

Однако не у всех женщин, зараженных вирусом папилломы человека, возникает дисплазия шейки матки и рак шейки матки. Примерно у 80% женщин иммунная система организма в течение 2 лет после инфицирования сама избавляется от вируса.

Таким образом, носительство этих вирусов свидетельствует не о злокачественном процессе как таковом, а о многократно повышенном риске его возникновения.

Диагностика ВПЧ-инфекции обладает очень высокой клинической значимостью. Она позволяет выявить тех пациенток, для которых жизненно необходимы активные, комплексные меры, направленные на профилактику и раннюю диагностику рака шейки матки. Самым надежным диагностическим тестом по выявлению всех 12 онкогенных типов вируса папилломы человека в настоящее время является метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Известен широкий спектр патологических состояний, представленный опухолями лимфоидного и эпителиального происхождения, в возникновении которых ВЭБ принимает непосредственное участие. Доказано, что этот вирус причастен к возникновению не только лимфомы Беркитта, но и ряда других злокачественных и доброкачественных новообразований, таких, как рак носоглотки, лимфома Ходжкина, инфекционный мононуклеоз и многие другие.

Согласно некоторым исследованиям, ВЭБ широко циркулирует среди населения, о чем свидетельствует высокий процент людей, имеющих в крови антитела к ВЭБ 50% детей и 85% взрослых. Но поскольку инфекция, как правило, протекает бессимптомно, сложилось ошибочное мнение о невысокой заболеваемости ВЭБ-инфекцией.

В настоящее время считается доказанной его роль в возникновении саркомы Капоши, выпотной лимфомы полостей тела и болезни Кастельмана. В геноме HHV-8 содержится ряд генов, продукты которых играют важную роль в регуляции размножения и жизнеспособности клеток; повышение их активности приводит к возникновению опухоли.

Следует понимать, что HHV-8 является всего лишь фактором риска развития вышеуказанных заболеваний. Если человек инфицирован HHV-8, то это не означает, что у него обязательно разовьётся саркома Капоши или лимфома.

Сам по себе вирус герпеса 8 типа опасности для здорового человека практически не представляет. Большинство людей с нормальным иммунитетом, инфицированных этим вирусом, не отмечают каких-либо проявлений, и он не оказывает на них никакого вредного влияния.

Свое негативное действие HHV-8 может проявить только в случае стойкого снижения иммунитета (иммунодепрессии), и то лишь у больных СПИДом (зараженных вирусом ВИЧ) или при длительном лечении, снижающем иммунитет (после пересадки органов и тканей, лучевой терапии).

По данным статистики у 45% людей, имеющих HHV-8 и ВИЧ в течение 10 лет развилась саркома Капоши. У людей с нормальным иммунитетом вирус герпеса человека никак себя не проявляет. Он не влияет на состояние здоровья.

ВИЧ может создавать необходимые условия (иммунодефицит) для возникновения рака. Этот вирус был открыт в 1983 г. и его ассоциация с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) доказана в 1984 г.

Инфицированные им клетки не подвергаются усиленному делению, а разрушаются, вызывая у инфицированного лица нарастающую степень иммунодефицита, и создавая тем самым состояние, при котором организм не в силах противостоять развитию опухоли. Доказано, что у больных СПИДом примерно 50% новообразований, ассоциировано с вирусом Эпштейна-Барр или герпесвирусом человека 8-го типа.

Чаще всего у таких больных диагностируют саркому Капоши либо одну из разновидностей неходжкинских лимфом.

Несмотря на различную организацию онкогенных вирусов человека они обладают рядом общих биологических свойств, а именно:

вирусы лишь инициируют патологический процесс, усиливая процессы деления клеток и генетическую нестабильность инфицированных ими клеток;
у инфицированных онкогенными вирусами лиц возникновение опухоли, как правило, событие нечастое: один случай новообразования возникает среди сотен, иногда тысяч инфицированных;
от момента инфицирования до возникновения опухоли имеет место продолжительный латентный период, длящийся годами, иногда десятилетиями;
у большинства инфицированных лиц возникновение опухоли не является обязательным, но они могут составить группу риска, с более высокой вероятностью ее возникновения;
для злокачественной трансформации инфицированных клеток необходимы дополнительные факторы и условия, приводящие к прогрессированию наиболее агрессивного опухолевого клона.

Такими дополнительными факторами, играющими роль сопутствующих канцерогенов, могут быть: злоупотребление алкоголем, табакокурение, коинфекция генитальным герпесом, малярия, нитрозамины в продуктах питания, пестициды.

На сегодняшний день основными методами лабораторной диагностики являются метод иммуноферментного анализа (ИФА) и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Первый позволяет выявить белок вируса либо антитела к нему, которые выделяет организм в ответ на инфицирование. При помощи метода ПЦР мы можем выявить генетический материал самого вируса.

Метод иммуноферментного анализа является стандартным методом лабораторной диагностики.

Следует также отметить, что не всегда возможно определение вирусных белков в плазме крови. В таких случаях методом ИФА можно диагностировать только наличие антител в плазме крови пациента. Однако, важно помнить, что антитела могут вырабатываться в довольно длительный срок.

Так, например, при инфицировании ВИЧ антитела вырабатываются в течение 6 месяцев, в случае гепатита С этот период может длиться до года, а антитела к вирусу Эпштейна-Барр (иммуноглобулины класса G) присутствуют у большого количества практически здоровых людей и их диагностика обладает низкой прогностической значимостью.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий обнаружить возбудителя заболевания на основе его генетической информации.

ПЦР диагностика дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику различных заболеваний, в частности, вирусов гепатита В, С, D, цитомегаловирусной инфекции, вируса Эпштейна-Барр, вируса простого герпеса, а также хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза и т.п.

При помощи данного метода вирусные инфекции можно обнаружить уже через 5–7 дней после заражения, за недели или месяцы до того, как появятся антитела или первые симптомы. Метод ПЦР позволяет выявить даже единичные клетки возбудителя, благодаря многократному увеличению последовательностей ДНК.

Полимеразная цепная реакция это один из самых точных методов лабораторной диагностики. Его чувствительность составляет 95–99%, а специфичность достигает 100%.

Таким образом, достижения науки в области онкологии внесли определенную ясность в понимание механизмов возникновения некоторых злокачественных новообразований и все же большую часть из них не удается увязать с инфицированностью тем или иным вирусом, что создает большое поле деятельности современным онкологам в направлении дальнейшего изучения механизмов развития онкологических заболеваний.

Все вышеуказанные методы диагностики существуют у нас в РНПЦ онкологии и медицинской онкологии им. Н.Н.Александрова.

В лаборатории клинической молекулярной генетики и иммунологических методов диагностики можно пройти обследование на вирусы герпеса,цитомегаловируса, Эпштена-Барра, вирусы гепатита В и С, а также пройти обследование на инфицирование вирусом папилломы человека, данные исследования может пройти любой человек обратившийся в центр.

Само заболевание не страшно для пациента, так как оно вызывает всего лишь небольшое повышение температуры, сыпь на кожных покровах. Гораздо опаснее воздействие вируса на состояние плода - краснуха может спровоцировать выкидыш или тяжелые пороки развития.

Носитель вируса краснухи - человек, то есть это заболевания является антропонозным. Основной путь передачи, кроме вертикального (от матери к ребенку) - воздушно-капельный. Частицы вируса распространяются во время чихания или кашля, легко попадают в дыхательные пути других людей и проникают во внутреннюю среду организма.

Чем проявляется патология?

Симптомы болезни имеют некоторую этапность появления. Поначалу клинических проявлений нету, так как вирус активно размножается в организме, увеличивается в количестве. Именно с эти периодом совпадает активное выделение возбудителя в окружающую среду и заражение окружающих.

Первые признаки болезни проявляются таким образом:

признаки катарального поражения верхних дыхательных путей - дискомфорт в горле, насморк, кашель;

лимфаденопатия, особенно страдают лимфатические узлы задней шейной и затылочной области;

на фоне бледных кожных покровов появляется сыпь, которая имеет пятнистый характер. Все элементы находятся отдельно и не имеют склонность к сливанию. Элементы сыпи исчезают через 3-4 дня и не оставляют следов;

реже встречается увеличение внутренних органов - печени, селезенки.

Как видим, само заболевание не приносит значительного ухудшения состояния. Осложнения могут наблюдаться у тех пациентов, которые имеют иммунодефицит. В таком случае болезнь может привести к пневмонии, поражению головного мозга, тромбоцитопенической пурпуре, ангине, отиту, артриту. Однако главная задача профилактики - снизить распространение вируса в окружающей среде, устранить риск заражения беременных женщин и ребенка на внутриутробном этапе развития.

Современные методы диагностики заболевания

Клиническая диагностика основана на оценке состояния пациента, врач осматривает сыпь, проводит аускультацию и перкуссию, осматривает кожные покровы и видимые слизистые оболочки. Общий анализ крови не дает специфические данные, с помощью его можно лишь определить наличие воспаления, а также установить тот факт, что оно имеет вирусную природу.

Лабораторная диагностика включает в себя:

Серологический метод (РСК, РТГА, РИФ, ИФА, IgM, IgG);

Рассмотрим подробнее методы диагностики заболевания.

Первый серологический метод диагностики, который применялся для постановки диагноза краснуха - реакция нейтрализации. Специфические антитела нейтрализуют вирус, а значит в чувствительной культуре не происходит патогенное действие возбудителя. Методика применяется для подтверждения подлинности вирусного микроорганизма.

Также есть реакция торможения гемагглютинации. Эта методика несколько проще технически. Суть метода заключается в том, что специфическая сыворотка задерживает гемагглютинирующее действие антигена. Для точной диагностики применяется метод парных сывороток с изучением титра антител и его прироста. Материал для исследования забирается с интервалом в две недели. Важный момент - анализ необходимо проводить, если с момента контакта с носителем вируса прошло не более 10 дней. Методика применяется для постановки диагноза, для обследования иммунитета в популяции, является вспомогательным методом при разработках терапии. Это “золотой стандарт” в диагностике, так как данные анализа являются точными и достоверными.

Иммуноферментный анализ - наиболее специфичный и чувствительный метод, который в то же время является довольно простым в техническом плане. Преимущество методики - возможность диагностики за один день, так как не требуется изучения парных сывороток. Также является “золотым стандартом” в диагностической схеме. Имеются различные модификации данного метода диагностики, например непрямой анализ или анализ с захватом антител.

Реакция иммунофлюоресценции основана на свойстве иммунологических комплексов связываться с флуоресцентными элементами. В результате персонал видит это в виде светящихся участков. Методика чувствительна, дает достоверные данные и часто используется для подтверждения диагноза.

Методика реакции связывания комплемента заключается в обнаружении специфического типа антител, который имеет особенные свойства. Обнаружить такие антитела можно тогда, когда проходит 3 года с момента, как человек перенес болезнь. Таким образом, диагностика применяется для того, чтобы доказать тот факт, что пациент уже перенес краснуху ранее.

Вирусологическая диагностика краснухи направлена на определение вируса в смывах со слизистых оболочек дыхательных путей, в спинномозговой жидкости, моче, отделяемом из конъюнктивы. Применяется достаточно редко, так как эта процедура требует много времени и специальных лабораторных условий.

Полимеразно-цепная реакция является наиболее точным и современным методом диагностики, так как позволяет определить наличие участков нуклеиновых кислот вируса, что позволяет 100%-но утверждать о том, что причина заболевания - вирус краснухи.

Дифференциальная диагностика проводится с такими патологиями: корь, ветряная оспа, скарлатина, инфекционный мононуклеоз, псевдотуберкулез. Эти патологии объединяет наличие экзантемы - высыпаний на коже. Проводится тщательное обследования характера сыпи, клинических проявлений, обследование лимфатических узлов, обнаружение специфических признаков патологии. Точная постановка диагноза позволяет провести необходимые эпидемиологические меры, подобрать тактику лечения, определить необходимость госпитализации.

Краснуха и период беременности

Если рассматривать клиническое течение, краснуха - довольно легкое заболевание, если развивается у здорового ребенка с нормальным иммунитетом. Если патология поражает организм беременной женщины - последствия могут быть трагическими. Заразиться во время вынашивания ребенка очень легко, ведь вирус распространяется по воздуху. Его источником чаще всего являются дети, которые посещают детский коллектив.

Если женщина вакцинирована или переболела краснухой ранее, при встрече с вирусом организм отреагирует выделением антител, которые нейтрализуют возбудитель. Однако если антител в организме нет - происходит инфицирование. На первой неделе беременности его риск составляет 80%, в период с 2 по 4 неделю вынашивания плода этот риск снижается до 60%, 30% составляет риск заражения на 5-8 неделе. Отмечается тенденция к снижению заражения на более поздних сроках, но тем не менее этот риск остается до конца беременности.

Вирус передается ребенку, проникая через плаценту и повреждает структуры, которые находятся на стадии развития. Характерная триада пороков, которая встречается при врожденной краснухе - катаракта, пороки сердца, глухота. Нарушается кроветворная система, что отражается в виде гемолитической анемии, тромбоцитопении. Часто возникают воспаления легких, ребенок не развивается в положенные сроки, имеет сниженный вес тела и маленький рост.

Наиболее опасный результат попадания вируса в ткани плода - спонтанный аборт, рождение мертвого ребенка или смерть в раннем периоде новорожденности

Диагностика краснухи во время беременности заключается в проведении серологических анализов, которые говорят о наличии или отсутствии антител к вирусу в организме. Их проводят в качестве скрининга и они входят в диагностику TORCH-инфекций, которые наиболее опасны во время вынашивания плода. Основной метод диагностики - иммуноферментный анализ, с помощью которого можно определить количество и вид антител к вирусу. Если есть риск заражения и нужна точная диагностика, применяется полимеразно-цепная реакция. Также, если врач подозревает краснуху у беременной, необходимо определить период болезни, а также диагностировать состояние плода.

Диагностика плода применяется лишь в том случае, если у матери развивается болезнь в период с 17 по 20 неделю, если случай сомнительный или есть подтверждение факта реинфекции вирусом. Пренатальная, то есть дородовая диагностика проводится методом полимеразно-цепной реакции, для чего берется анализ амниотической жидкости. Также можно выявить вирус в культуре клеток, фрагментах хориальных ворсин или плаценты, а также из крови плода, которую берут методом кордоцентеза.

Лабораторная диагностика у новорожденного ребенка происходит методом определения антител к вирусу в пуповинной или капиллярной крови. Если РНК вируса не обнаружено, это не гарантирует того, что в организме нет инфекции. Необходимо также исключить наличие специфических антител. Хотя даже отсутствие антител может быть ложноотрицательным результатом, если есть факт иммунотолерантности. Проводится ПЦР, а также требуется повторное определение антител.

Профилактика и лечение заболевания

Эпидемиологические меры профилактики болезни включают изоляцию пациента с момента появления элементов сыпи на коже на 5 дней. Особенно стоит ограничивать контакты носителя вируса с беременными женщинами. В детском коллективе не применяются специальные карантинные меры.

Лечение краснухи неспецифическое, так как этиотропной терапии не существует. Лечение проводится амбулаторно, госпитализации подлежат такие группы пациентов:

дети с тяжелой фоновой патологией;

пациенты с иммунодефицитом;

дети с врожденной краснухой;

пациенты с осложненной краснухой.

Лечение включает применение жаропонижающих средств, местных препаратов, антигистаминных, витаминов. Также, важным является соблюдение режима, пациент должен быть в покое, меню необходимо разнообразить продуктами, которые содержат витамины и микроэлементы. Рекомендуется достаточный питьевой режим. В некоторых случаях применяются антибактериальные препараты, если присоединилась соответствующая инфекция.

Подробнее о вакцинации

Наиболее эффективный метод профилактики болезни - вакцинация. Она входит в календарь прививок, которые делают всем детям. Чаще всего применяется вакцина от кори, краснухи и паротита. Препарат вводится под кожу или в мышечную ткань. Первый этап вакцинации проводится в возрасте 12-15 месяцев, а ревакцинация - в 6 лет. Специфический иммунитет сохраняется в больше 20 лет.

Максимальное покрытие населения вакцинами привело к тому, что в некоторых странах заболевание исчезло полностью. Это говорит о том, насколько важно прививать детей вовремя, использовать качественную вакцину.

После введения вакцины могут быть незначительные реакции со стороны организма - лимфаденопатия легкой степени, субфебрильная температура, покраснение места прививки.

Причины пройти диагностику в СЗЦДМ

Лаборатория центра оснащена новейшим диагностическим оборудованием. Анализы выполняются быстро и качественно. В штате медицинских центров работают высококвалифицированные специалисты, что позволяет сделать диагностику разносторонней и эффективной. Пациент может не только установить факт заболевания, но и пройти расширенную проверку организма, а также лечение. Для наших врачей нет заболевания отдельной системы - они оценивают полноценное состояние пациента и лечат его, а не патологию. Есть возможность получить результаты исследования на личную электронную почту или получить их в распечатанном виде в медицинском центре.

Н . В . Ковалюк , кандидат биологических наук зав. лабораторией биотехнологии СКНИИЖ, проректор Краснодарского регионального института агробизнеса
В . Ф . Сацук , кандидат сельскохозяйственных наук, директор ООО ИПСХП "Астер"
Е.В. Мачульская, младший научный сотрудник лаборатории биотехнологии СКНИИЖ

ДНК - обязательный компонент любого живого организма (исключение составляют лишь РНК- содержащие вирусы на определенных стадиях своего существования). У мыши и человека, кишечной палочки и слона ДНК устроена по одному принципу- это полимерная макромолекула, состоящая из звеньев - нук-леотидов. Нуклеотиды бывают 4 видов: А, Т, G и С. У всех живых существ A,T,G,C - нуклеотиды встречаются в составе ДНК, но в различных комбинациях. Чем ближе друг к другу виды расположены на эволюционной лестни-це, тем сильнее похожи их последовательности ДНК, в то же время даже у представителей одной семьи можно найти такие участки ДНК, которые будут строго индивидуальны.

Использование этого биологического свойства легло в основу метода полиме-разной цепной реакции (ПЦР), который по оценке американского журнала "Science" является самым выдающимся открытием последних лет.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)_это метод копирования участка ДНК, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную индивидуальную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 миллионов раз. Некоторые области применения ПЦР _ выявление вирусных и бактериальных патогенов и высокоэффективный анализ вариаций нуклеотидных последовательностей (В. И. Глазко и др., 2000; Р. А. Волкова и др., 2000; А. А. Приймак, 1995).

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь с длительным латентным периодом, поражающая органы кроветворной системы (А.П. Кузнецова, В.П. Смирнов 1998).

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является этиологическим фактором (первопричиной) лейкоза у коров, телят, реже у других животных: овец, коз и кроликов (Л. Б. Прохватилова и др., 2001; Н. В. Замараева, М. И. Гулюкин, Н. Н. Снежков, 1996; C.Olson et al., 1981). Имеются данные об экспериментальном заражении обезьян (Н. М. McClure, М.Е. Killing, P.Ph. Custer, 1974). Передача ВЛКРС восприимчивому крупному рогатому, скоту может осуществляться со всеми секретами и экскретами при попадании в них лимфоцитов, зараженных ВЛКРС. Установлено, что для экспериментального заражения телят достаточно ввести им внутрикожно 2500 лимфоцитов крови от зараженного животного (такое количество лимфоцитов содержится примерно в 0,0005 мл цельной крови). Среди основных факторов, обуславливающих передачу вируса лейкоза, наибольшее значение имеет перенос возбудителя через кровь и препаратов из нее, при ветеринарных и зоотехнических обработках, т.е. ятрогенный способ передачи инфекции (В. М. Авилов, В. М. Нахмансон, 1995).

В сперме инфицированных быков-производителей ВЛКРС не выявлен. Не наблюдается определенного влияния передачи ВЛКРС потомству от серопозитивных бы ков-производителей при естественном оплодотворении серонегативных коров. Однако у быков с воспалением генитальных органов в сперме могут быть л и м фо циты ,инфици ро ванные ВЛКРС.Э к-спериментальноустановлено, что коров можно инфицировать путем нанесения таких лимфоцитов на слизистую оболочку матки. Изучение возможности передачи вируса лейкоза при эмбриопересадках подтвердили отсутствие передачи ВЛКРС от коров доноров коровам-реципиентам через эмбрионы (Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И., 2005).

Вирус лейкоза крупного рогатого скота относится к семейству ретро вирусов (в это же семейство входят родственные ВЛКРС вирусы Т -клеточного лимфолейкоза и ВИЧ). Ретрови-русным инфекциям свойственен ряд общих признаков: длительность инкубационного периода, хроническое или латентное течение, пожизненное вирусоносительство и строго ограниченный круг восприимчивых животных (Б. Г. Орлянкин, 1996; П. Н. Смирнов, В. В. Храмцов, В. В. Смирнова, 2000).

Ретровирусы проникают в клетку, РНК освобождается и превращается в двухцепочеч-ную ДНК - копию, которая встраивается как провирус в ДНК клетки хозяина (Б. Г. Орлянкин, 1996). Встроенный в геном хозяина провирус остается не доступным для воздействия специфических антител и в организме на протяжении всей жизни животного.

В благоприятных условиях встроенный провирус формирует новые вирионы; которые отпочковываются от клеточной мембраны для инфицирования новых клеток.

Для диагностики лейкоза применяют клинический, патологоанатомический, гистологический, гематологический, серологический и молекулярно - биологический методы.

Всё разнообразие клинических признаков лейкоза можно подразделить на специфические и неспецифические. Большинство исследователей указывают на первичное появление неспецифических признаков, а затем появляются специфические, по которым можно поставить диагноз (Н. В. Румянцева, Т.М. Шатерникова, 1963; Г.А. Симонян, 1963; Э.М. Ным и др., 1970). По мере развития заболевания у отдельных животных развивается понижение реактивности, вялость. Сравнительно рано у больных лейкозом животных регистрируют нарушение сердечно - сосудистой деятельности (глухие тоны сердца, иногда их раздвоенность), пульс слабого наполнения, возможна аритмия. К числу неспецифических признаков лейкоза относятся нерегулярная жвачка, поносы,'запоры.

Специфические клинические признаки характеризуются прогрессирующим увеличением поверхностных (околоушных, подчелюстных, предл о паточных, коленной складки, надвыменных), а также внутренних лимфатических узлов, экзофтальмии.(В. М. Лемеш и соавт., 1987). .

Гематологический метод позволят диагностировать лейкоз на более ранних стадиях развития заболевания. Сущность его заключается в обнаружении в периферической крови повышенного числа лейкоцитов (в основном лимфоидного ряда), слабо дифференцированных клеток, а также полиморфных, атипичных клеток кроветворных органов (Б.Г. Панков,1980; М. И. Гулюкин и др., 1996). Для оценки результатов исследований в различных странах предложено несколько вариантов "лейкозных ключей". В нашей стране в 1965 году был разработан отечественный "лейкозный ключ". Все димфоидные диагностические "ключи" основаны на количественных показателях.

Заражение животных ВЛКРС сопровождается выработкой антител к структурным белкам вируса. Антитела и вирус циркулируют в организме у зараженных животных на протяжении всей жизни. Это позволяет применять серологические методы для диагностики инфекции, вызываемой этим вирусом (Т.С. К'ос-тенко и др., 1989; А.Г. Берзяк, B.C. Ковалючко, В;С. Гротевич, Л.И. Киричук, 1990).

Разработанная и широко применяемая в ветеринарных лабораториях страны реакция иммунодиффузии в геле агара ( РИД ) с использованием антигена ВЛ в настоящее время остается основным диагностическим методом , по результатом которого проводят оздоровительные и профилактические мероприятия в неблагополучных по лейкозу хозяйствах . В действующих в настоящее время "Правилах по профилактике и борьбе с лейкозом КРС" приоритет отдается именно серологическим исследованиям сыворотки крови . По их результатам судят об инфици - рованности животных вирусом лейкоза . В зависимости от этого определяют мероприятия по оздоровлению .

Однако, как и любой диагностический метод, РИД не лишен недостатков.

Так, наличие у лейкоза латентной стадии, когда в крови отсутствуют антитела к вирусу) усложняет диагностику заболевания. Экспериментально установлено, что после заражения скрытый период инфекции (период от момента заражения до появления антител к вирусным антигенам) продолжается от 2 недель до нескольких месяцев, по этому, постепенно выводя из стада РИД

позитивных животных, теоретически возможно добиваться полного оздоровления хозяйства от лейкоза (A. Burny, Bruck С, Cleuter Y., 1985). Тем не менее, в оздоровленных стадах, не имевших контактов с другими, через несколько месяцев или даже лет выделяют животных с антителами к ВЛКРС (В. М. Нахмансон, 1986) . Это можно объяснить характерным для лейкоза явлением иммунологической толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без ан-тителообразовани'я. Иммунологическая толерантность

это частичная или полная утрата способности организма вступать в иммунную реакцию со специфическими антигеном. При лейкозе КРС состояние толерантности может развиваться в случае внутриутробного заражения плода инфицированными лимфоцитами матери в период до проявления иммунной компетенции, то есть, в первые 3 месяца развития эмбриона; у отдельных животных, например, у глубоко стельных коров, когда иммуноглобулины накапливаются в секрете молочной железы и т. д. Кроме того, бывают случаи серонегативности при наличии сопутствующих инфекций, например, вирусной диареи (В. А. Белявская и др., 2003).

Метод не прямого иммуноферментного анализа (ИфА), основанный на применении антивидового конъюгата с использованием ферментов-маркеров, обладает значительно большей чувствительностью, по сравнению с РИД, позволяет автоматизировать процесс, то есть уйти от субъективной оценки результатов реакции. Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в молоке и моче (Н.Т. Джапаралиев, Л.Б. Прохва-тилова, А.И. Ломакин, П.К.Аянот,2000; К.Т. Carli, et al.1993; K.T.Carli , Sen А., Н. Batmaz, E.Kennerman,1999). Несмотря на очевидные достоинства, достоверность ИФА все же связана с иммунологическими реакциями, и поэтому не всегда адекватна.

В связи с изложенным выше , с целью ускорения полного оздоровления стад КРС от лейкоза , целесообразно совместно с РИД и не прямым ИФА использовать методы , выявляющие непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных .

Перспективной в этом плане является по-лимеразная цепная реакция (ПЦР) (Мальцева Н.А. и др., 2004). Этот метод позволяет выявлять провирусную ДНК или вирусную РНК в образце крови животного. Анализ литературных данных,позволяет расположить методы-диагностики лейкоза в порядке возрастания чувствительности, точности и специфичности в следующий ряд: РИД Таким образом, возможны, по крайней мере, три области успешного применения метода ПЦР в диагностике лейкоза: выявление носителей провируснои ДНК среди РИД и ИфА-отрицательных животных, исследование вновь завозимых в хозяйство животных и выявление зараженных телят в раннем возрасте.

В лаборатории биотехнологии СКНИИЖ с использованием метода ПЦР исследовано 1013 образцов крови на наличие провируснои ДНК ВЛКРС. В таблице 1 приведены данные по инфицированности животных различных хозяйств ВЛКРС.

Анализируя полученные результаты, хотелось бы отметить следующее. Животные лишь одного из хозяйств (СЗАО СКВО) оказались полностью свободны от носи-тельства провируснои ДНК ЛКРС. Телки голштинской черно-пестрой породы в это хозяйство были завезены из Голландии и не имели контактов с местными животными. Среди других импортных животных (ОАО "Племзавод "Кубань" п=354, завезены из Венгрии) методом РИД не были выявлены положительно реагирующие, а с помощью ПЦР удалось обнаружить 1 носителя провируснои ДНК ЛКРС. Более того, провирусную ДНК выявили и в пробе крови теленка, полученного от ПЦР - позитивного животного. Носители провируса были удалены из стада. В хозяйстве ООО "Животноводческий комплекс "Ольгинский" из 97 проанализированных образцов 67 были получены от РИД - отрицательных животных. 15 из них оказались ПЦР _ положительными.

Анализируя данные по носительству про-вируса, установили, что процент инфицированных телят к 3-4 месяцам (на основании ПЦР - исследований) практически соответствует проценту РИД - позитивных животных того же хозяйства, но в более позднем воз-

расте (к 3 годам). Это, вероятнее всего, свидетельствует о том, что заражение животных происходит в ранние сроки жизни (транспла-центарно и до 3 мес), а первые иммунологические признаки болезни появляются у большинства животных после первой лактации. •

Следовательно, если проводить разделение телочек методом ПЦР на носителей провируса и здоровых в первые 2-3 недели жизни животного, можно оздоравли-вать хозяйства значительно быстрее.

Читайте также: