Основные структуры вируса фага т-4

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Костюченко Виктор Анатольевич. Структура аппарата инфицирования бактериофага T4 : Дис. . канд. биол. наук : 03.00.03 : Москва, 2004 105 c. РГБ ОД, 61:04-3/1488

Введение к работе

Знание структуры вирусов и особенностей их формирования необходимо для разработки новых эффективных подходов в борьбе с вирусными инфекциями. Вирусы также являются удобной экспериментальной модельной системой для изучения механизмов ассоциации белковых субъединиц, которая может помочь в понимании процессов формирования сложных биологических структур клетки, таких как ядерные поры, центриоли, жгутики, компоненты мышечных филаментов и др

Бактериофаг Т4, инфицирующий Escherichia col:, является одним из основных модельных объектов молекулярной и структурной биологии [7] Частица фага Т4 (Рис I) состоит из двух основных частей — капсида ("головки"), содержащего геномную ДНК размером около 172 тысяч пар оснований, и "хвоста", который присоединен к капсиду через специальный портал на одной из вершин с симметрией 5-го порядка. Капсид является икосаэдром, удлинённым вдоль оси 5 порядка [5], имеет размеры 860 А в поперечнике и 1200 А длиной, и построен из 930 копий белка продукта гена (пг) 23, 55 копий пг24, 155 копий белка hoc ("highly antigenic outer capsid protein") и 810 копий белка soc ("small outer capsid protein") Портал содержит 12 копий белка пг20 Сократимый хвост состоит из трех частей "шейки", хвостового стержня, на котором собран сократимый хвостовой чехол, и базальной пластинки К шейке, построенной из гексамеров пг15, пг13 и/или пг14, присоединены "воротничок" и "бакенбарды", состоящие из тримеров белка фибритина (nrwac), воротничок, возможно, содержит также один из белков пг13 или пг14 Основную часть хвоста занимает сократимый хвостовой чехол и расположенный внутри него хвостовой стержень Чехол построен из 138 копий пг18, стержень состоит из пг!9, которого, видимо, 138 копий Завершает хвост базальная пластинка — многокомпо-

rife ^4^ Baseplate

Рис. 1: Бактериофаг Т4 .

а) криоэлектронная микрофотография; б) схематическая модель Рисунок взят из [19].

нентная молекулярная структура диаметром около 520 А и высотой в 270 А, состоящая из 16 различных белков, почти каждый из которых является олигомером. В состав базальной пластинки входятпг5, пгб, пг7, пг8, пг9, nrlO, nrl 1, пг12, пг25, пг26, пг27, пг28, пг29, пг48, пг53, и пг54. К базальной пластинке присоединены длинные фибриллы, построенные из пг34, пг35, пгЗб и пг37. Таким образом, в сборке частицы фага участвуют более тридцати различных белков, и это не не считая белков, связанных с ДНК внутри капсида, вспомогательных скаффолд-белков и белков-шаперонов.

С помощью электронной микроскопии с применением негативного контрастирования ранее удалось представить общее строение вируса. Хвостовой чехол бактериофага Т4 в растянутом (нативном) состоянии явился первой биологической структурой, для которой была проведена трёхмерная реконструкция [20]. Также была выполнена трёхмерная реконструкция сокращённого [1] хвоста и предложена двумерная модель базальной пластинки [4]. Разрешение этих моделей было довольно низким, около 40 А. Получить с высоким разрешением пространственную реконструкцию вирусной частицы целиком удавалось, в основном, лишь для сравнительно простых в устройстве икосаэдрических вирусов, поскольку отсутствовали необходимые вычислительные мощности и не были до конца разработаны методы реконструкции. В настоящее время, с совершенствованием методов электронной криомикроскопии и развитием компьютерных технологий, цель реконструировать частицу бактериофага Т4 с околоатомным разрешением представляется осуществимой.

Пространственная реконструкция такого сложного и большого вируса, каким является бактериофаг Т4 (размеры вируса примерно 2500 х 1000 х 1000 А, молекулярная масса частицы около 300 МДа) требует особого подхода, поскольку даже при использовании современной вычислительной техники необходимый объём данных и вычислений выходит за рамки осуществимого с помощью стандартных методов и программ. Поэтому, в данной работе были поставлены следующие задачи:

Разработать компьютерную программу для пространственной реконструкции больших объектов с различной симметрией по изображениям электронной криомикроскопии;

Провести пространственную реконструкцию комплекса базальной пластинки и хвостового стержня бактериофага Т4 (масса комплекса 8,8 МДа) и определить расположение и взаимодействие в нём белковых субъединиц, атомная структура которых ранее определена в нашей лаборатории: пг5, пг9, nrl 1, пг12 (фрагмент), пг27, атак же определить вероятную форму и расположение остальных белковых составляющих базальной пластинки;

На основании полученных результатов предложить механизм действия аппарата инфицирования бактериофага Т4, включающего хвостовой чехол и базалъную пластинку.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, четырёх глав, выводов, заключения и списка литературы. Объем диссертации составляет 105 страниц, включая 27 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы содержит ПО наименований.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые получена детальная пространственная картина важного функционального компонента сложного вируса — базальной пластинки бактериофага Т4, и предложено механистическое объяснение процесса заражения вирусом хозяйской клетки. Разработана компьютерная программа для получения реконструкций асимметричных, или имеющих низкую степень симметрии объектов, что позволит в будущем получить модели строения других вирусов и надмолекулярных биологических структур, представляющих научный и практический интерес. Полученные результаты и сведения структурного характера можно использовать, например, при конструировании молекулярных механизмов в нанотехнологии.

Результаты работы были доложены на Гордоновской конференции по дифракционным методам в биологии в США (Diffraction Methods in Molecular Biology Gordon Conference; Proctor Academy, Andovcr, New Hampshire, USA, 1998); на конференциях Медицинского института Говарда Хыоза в 2000, 2001, 2002 и 2004 гг (Howard Hughes Medial Institute Meeting of International Research Scholars, USA, 2000; Canada, 2001; Australia, 2002; Estonia, 2004); на конференции по сборке вирусов (XVIII Biennial Conference on Phage/Virus Assembly, USA, 2003).

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 6 статей и 6 тезисов докладов.

Депонированные структурные данные

Депонированы в банк данных белковых структур PDB следующие структуры: пг5/пг27 - коды 1К28, 1PDJ, 1PDL; пг8 - коды 1N7Z, 1N80, 1N8B, 1PDM; пт9 - коды 1QEX, 1S2E, 1PDP; пгП - коды 1ЕГ6, IPDF; ПГІ2 - код 1PDI;

Реконструкция комплекса базальной пластинки и хвостового стержня депонирована в банк электронномикроскопических реконструкций (EMDB), код 1048.

Как протекает фаговая инфекция

Начинается все с того, что вирусная частица случайно сталкивается с клеткой бактерии. Фаг способен заразить вовсе не любую бактерию. Например, фаг, заражающий кишечную палочку, не замечает – сколько бы он с ними ни сталкивался – клетки стафилококка, и наоборот. Больше того, у той же кишечной палочки известно много разновидностей (их называют штаммами), и фаги, как правило, способны очень хорошо их различать. Они охотно заражают одни штаммы и совершенно игнорируют другие. Почему так происходит? Дело в том, что на поверхности бактериальной клетки есть структуры, к которым базальная пластинка фага по форме подходит, как ключ к замку. Такие структуры называются рецепторами. Есть рецептор для данного фага – фаг способен заражать эту бактерию, а эта бактерия способна стать его хозяином. Не подходит ключик? – Ну, стало быть, эта бактерия не для него.

Возникает вопрос, почему бактериальная клетка вынуждена жить под постоянной угрозой фаговой интервенции, не проще ли незаметно потерять где–то эти рецепторы и стать неприступной для фага? Но фаг тоже не прост, он использует в качестве причала структуры, предназначенные не для него, а совсем для других целей и жизненно важные для клетки, у которой, стало быть, есть веские причины не лишаться их.

Если фаг и бактерия узнали друг друга, фаг прочно связывается с ее поверхностью. Дальнейшая задача вируса состоит в том, чтобы ввести свой генетический материал внутрь бактериальной клетки, не нанеся ей – до поры до времени – вреда. Вот как это делает, например, фаг Т4, заражающий кишечную палочку – обычного обитателя нашего кишечника.

Бактериофаг Т4 является одним из наиболее сложно устроенных вирусов. Несколько вытянутая головка служит контейнером для хранения нуклеиновой кислоты. Сокращение чехла обеспечивает прободение бактериальной стенки. По внутреннему каналу стержневого отростка фаговая ДНК перемещается внутрь бактериальной клетки. К шестиугольной базальной пластинке крепятся длинные нити – фибриллы, которые обеспечивают начальный контакт фага с поверхностью бактерии. Чехол с одной стороны жестко закреплен на фаговой головке, а с другой прикреплен к базальной пластинке, находящейся на конце отростка. Чехол заметно короче отростка, поэтому, подобно пружине, пребывает в растянутом состоянии. После стыковки фага с бактерией форма базальной пластинки меняется, она больше не может удерживать чехол в растянутом состоянии, тот сжимается, и жесткий стержень как бы выстреливает из чехла, проминая клеточную стенку бактерии.

Бактериофаг Т4: 1 – головка; 2 – отросток, покрытый чехлом;3 – базальная пластинка; 4 – длинные фибриллы

Одного механического усилия недостаточно. Прогибаясь, клеточная стенка успешно сопротивляется попытке фагового отростка проткнуть ее, но оказывается бессильной противостоять секретному оружию фага – ферменту лизоциму, который находится вблизи острия отростка и, войдя в плотный контакт с клеточной стенкой, моментально прогрызает в ней дыру. Наконец–то стержень отростка пронзает клеточную стенку насквозь. Тут же по внутреннему каналу отростка, как сквозь игольное ушко, в бактерию впрыскивается нуклеиновая кислота, до того момента покоившаяся в фаговой головке.

На первый взгляд, задача может показаться не слишком сложной, но надо учесть, что молекула ДНК – очень длинная и чрезвычайно плотно упакована. Если уж сравнивать внутренний диаметр канала с игольным ушком, то в этом масштабе длина нити ДНК будет около метра, а скорость ее разматывания напоминает разматывание лески с катушки спиннинга при забрасывании блесны. И протащить нить надо так, чтобы не порвать ее. Порванная даже в одном месте, она уже неинфекционна и, стало быть, совершенно безвредна для бактерии и абсолютно бесполезна для фага.

Большинство фагов не имеют сократимого чехла, не говоря уже о том, что у многих и отростка–то никакого нет, ни большого, ни маленького. А преграда на пути серьезная – клеточная стенка бактерии. Она состоит из нескольких слоев и, подобно неповрежденной коже человека или кутикуле на поверхности листа, совершенно непроницаема для вируса. Как–то ее надо продырявить, и, так или иначе, все фаги умеют это делать.

Например, многие фаги связываются только с половыми пилями – нитевидными выростами на мужских клетках кишечной палочки. Да, как ни удивительно, у бактерий есть пол, мужской и женский, а у мужских клеток есть вырост, с помощью которого они конъюгируют с женской клеткой. Облепив вырост, фаги внедряют свою нуклеиновую кислоту в клетку бактерии. В общем, тем или иным способом, но фаги вводят свой генетический материал внутрь бактериальной клетки, оставляя на поверхности пустую, никому уже не нужную белковую оболочку.

Фаговая ДНК проникла внутрь бактерии. 1 – фаговая ДНК; 2 – стенка бактериальной клетки; 3 – сократившийся чехол; 4 – длинные фибриллы

С этого момента все меняется для бактериальной клетки. Вирус на время как бы исчезает. В клетке, куда проникла фаговая нуклеиновая кислота, не удается обнаружить никаких вирусных частиц. Более того, зараженная клетка выглядит совершенно нормальной. Но на самом деле жить ей осталось всего несколько минут. Под покровом клеточной стенки фаг начинает свое черное дело. Он заставляет все клеточные структуры работать на себя. Все ресурсы клетки отныне тратятся только на размножение фаговой ДНК, самой клетке уже ничего не достается. Белки образуются только фаговые, синтез клеточных компонентов совершенно подавлен или осуществляется лишь в той мере, в которой это нужно фагу. Многочисленные копии вновь образованной фаговой ДНК упаковываются в форме многогранника. Сверху они покрываются фаговым белком, и возникает зрелая фаговая головка с упакованной внутри нее ДНК. В другом месте клетки, в другом ее помещении налажено производство и сборка других фаговых белков, из которых образуется хвостовой отросток. Наконец, отростки и головки соединяются в полноценную фаговую частицу. Проникла в бактерию нуклеиновая кислота одной–единственной фаговой частицы, а теперь, через полчаса, их уже больше сотни. Им тесно, им пора покидать эту бактерию, с которой уже нечего взять. Вот только как это сделать? Бактерия мертва, но ее клеточная стенка все еще надежно удерживает взаперти многочисленное фаговое потомство.

Продольный разрез фага с пустой головкой: 1 – фибриллы, прикрепленные к головке;2 – "воротничок"; 3 – отросток;4 – канал, проходящий внутри отростка

И вновь приходит на помощь фаговый лизоцим. Он подгрызает клеточную стенку обреченной бактерии изнутри до тех пор, пока она достаточно не истончится и в конце концов не разорвется. Фаговое потомство выходит наружу и немедленно набрасывается на соседние бактерии, которые ожидает та же участь.

Такая инфекция называется продуктивной, а фаги, вызывающие продуктивную инфекцию – вирулентными.

Вирус Escherichia T4 является одним из видов бактериофагов , которые заражают кишечной палочки бактерии. Это является членом подсемейства вируса Tevenvirinae (не путать с Т-даже бактериофагов , что альтернативное название вида) и включает в себя среди других штаммов (или изолирует) Энтеробактерии фага Т2 , фаг т4 и Энтеробактерии фага Т6 . T4 способен выдержать только жизненный цикл литического , а не лизогенный жизненный цикл .

содержание

Геном и структура

Двухцепочечный этот вирус Т4 ДНК геном составляет около 169 п.н. длиной и кодирует 289 белков . Т4 геном неизлечимо избыточные и первый реплицируются как единое целое, а затем несколько геномных единиц рекомбинационного конца в конец , чтобы сформировать конкатемер . Когда упаковано, конкатемер разрежет на позиции неспецифической те же длины, что приводит к нескольким геном , которые представляют собой круговые перестановки оригинала. Т4 геном несет эукариот -как интрона последовательность.

Последовательность Шайна-Дальгарно Gagg доминирует в вирус Т4 ранних генов, в то время как последовательность GGAG является мишенью для Т4 эндонуклеазы REGB , который инициирует раннюю деградацию мРНК.

Структура частиц Вирус

Т4 является относительно большим вирусом, приблизительно на 90 нм в ширину и 200 нм длиной (большинство вирусов в диапазоне от 25 до 200 нм в длину). Геномная ДНК удерживаются в икосаэдрической головке, также известную как капсид . Хвост Т4 является полым , так что он может передать его нуклеиновой кислоты в клетку заражаемом после прикрепления. Хвост прикрепляется к клетке - хозяину с помощью отростков. Задние волокна также имеют важное значение в распознавании клетки - хозяина поверхностных рецепторов, поэтому они определяют , если бактерия находится в пределах досягаемости хоста вируса.

Структура 6 megadalton T4 опорной плиты, которая содержит 127 полипептидные цепи 13 различных белков (генные продукты 5, 5,4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 25, 27, 48 и 53) недавно было описано в атомных деталях. Атомная модель проксимальной области хвостовой трубки, образованной gp54 и основного белка gp19 трубки также были созданы. Ленты меры белок gp29 присутствует в трубчатых комплексах базовой платы хвост, но она не может быть смоделирована.

процесс инфицирования

Вирус Т4 инициирует кишечную палочку инфекцию путем связывания ОМРСА Porin белков и липополисахарида (LPS) на поверхности E.coli , клетки с его длинным хвостом волокнами (ЛТС). Сигнал распознавания передается через LTFS к опорной плите. Это распутывает короткий хвост волокна (STF) , которые связываются необратимо с E.coli , клеточной поверхности. Изменения базовых плат конформация и контракты хвоста оболочки, в результате чего GP5 в конце хвостовой трубки , чтобы проколоть наружную мембрану клетки. Лизоцим домен GP5 активируется и ухудшает периплазматический пептидогликан слой. Оставшаяся часть мембраны ухудшаются , а затем ДНК из головы вируса может перемещаться через хвостовую трубку и войти в E.coli , клетку.

Жизненный цикл литического (от входа бактерии к его разрушению) занимает около 30 минут (при 37 ° C) и состоит из:

Адсорбция и проникновение (сразу начинает)
Задержание хост экспрессии генов (сразу начинают)
Фермент синтеза (начиная через 5 минут)
Репликации ДНК (начиная через 10 минут)
Формирование новых вирусных частиц (начиная через 12 минут)

После того , как жизненный цикл завершается, клетка - хозяина прорывается и выталкивает вновь построенные вирусы в окружающую среду, разрушая клетки - хозяина. T4 имеет размер пакета примерно 100-150 вирусных частиц на инфицированный хозяин. Комплементационные, делеция и рекомбинация тесты могут быть использованы для наметить РИИ генов локуса с использованием Т4. Эти вирусы Escherichia инфицировать клетки - хозяина с их информацией , а затем взорвать клетки - хозяина, тем самым распространяющихся себя.

Тиражирование и упаковка

Вирус Т4 геном синтезируется в клетке - хозяине , используя моментальный круг репликацию. Время, необходимое для репликации ДНК в живой клетке измеряли как скорость удлинения ДНК вируса Т4 в вирус-инфицированных E.coli. В период экспоненциального роста ДНК при 37 ° C, скорость была 749 нуклеотидов в секунду. Частота мутаций за пару оснований на репликацию вируса во время синтеза Т4 ДНК составляет 1,7 на 10 -8 , высокоточный ДНК , механизм копирования, только с 1 ошибкой в 300 копий. Вирус также кодирует уникальные репарации ДНК механизмов. Был обнаружено , что упаковка двигатель T4 ДНК для загрузки ДНК в вирусный капсид со скоростью до 2000 пар оснований в секунду. Сила участвует, если масштабируются до размера, было бы равносильно тому , что в среднем автомобильного двигателя.

Кратность реактивация

Кратность реактивация (MR) представляет собой процесс , с помощью которого два или более вирусных геномов, каждый из которых содержит инактивировать повреждение генома, могут взаимодействовать в пределах зараженной клетки , чтобы сформировать жизнеспособный геном вируса. Сальвадор Лурия, при изучении УФ - облученных вирусы Т4 в 1946 году, обнаружила МР и предположила , что наблюдаемая реактивация поврежденного вируса происходит с помощью механизма рекомбинации (см . Рефы.) Это предшествовало подтверждение ДНК в качестве генетического материала в 1952 году в связанном с вирусом T2 от эксперимента Херши-Чейз .

Нижний рисунок показан кривые выживаемость для инактивации вирус Т4 с помощью ДНК повреждающего агента митомицина C (MMC). В этом случае кривая выживания для multicomplexes не имеет начальное плечо, предполагая , что только второй рекомбинационный процесс ремонта описанный выше , является активным. Эффективность ремонта этого процесса указывает на наблюдении , что доза MMC , которая позволяет выживание только 1 в 1000 monocomplexes позволяет выживание около 70% multicomplexes. Были также получены Аналогичные кривые выживаемости мультикомплекс (без плеч) для ДНК - повреждающих агентов Р32 распад, псоралена плюс ближней УФ - облучение (ПУВА), N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (МННГ), сульфонат метил метана (MMS ) и азотистая кислота .

Некоторые из генов , найденных необходимы для MR в вируса Т4 оказались ортологи для генов , необходимых для рекомбинации прокариот , эукариот и архей . Это включает в себя, например, ген , Т4 uvsX , который указывает , что белок имеет трехмерную структурную гомологию с RecA из кишечной палочки и гомологичного белка RAD51 в эукариот и RADA в архебактерий . Было высказано предположение о том , что эффективная и точная рекомбинационной ремонт повреждений ДНК в процессе МРА может быть аналогична рекомбинацнонным процессе ремонта , который происходит во время мейоза в эукариоте .

история

Конкретное место и время выделения вируса Т4 остается неясным, хотя они, вероятно , были найдены в сточных водах или фекального материала. T4 и подобные вирусы были описаны в работе Томаса Ф. Андерсон , Макс Дельбрюк и Милислав Демерек в ноябре 1944 года.

Ряд Nobel Prize победителей работали с вирусом Т4 или Т4-подобных вирусов , включая Макса Дельбрюк , Сальвадор Лурия , Альфред Херши , Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик . Другие важные ученые, работавшие с вирусом Т4 включают Майкл Россман , Seymour Бензер , Брюс Alberts , Джисел Мосиг , Ричард Ленский , и Джеймс Bull .

БАКТЕРИОФАГ Т4 КАК МОДЕЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ В СОВРЕМЕННОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

Бактериофаги – наиболее многочисленная и весьма распространенная, а возможно, и самая древняя группа вирусов. Они были обнаружены для большинства бактерий, патогенных, и также сапротрофных. В природе фаги также встречаются там, где есть чувствительные к ним бактерии: в почве и воде, в кишечнике человека и животных, в растениях и т. д. Чем богаче субстрат будет обогащен микроорганизмами, тем намного больше в нем будет бактериофагов.

Модельный объект - бактериофаг очень широко используют для научных исследований. Многие фундаментальные открытия в молекулярной биологии были открыты именно с помощью бактериофага, таковыми являются: генетический код, рекомбинация и репликация нуклеиновых кислот. Его очень легко культивировать самыми примитивными биологическими методами и получать в очень больших количествах.

Бактериофаг Т4 очень удобный модельный объект для развития методов молекулярной биологии и выяснения структурных основ инфекционности вируса. Enterobacteriaphage T4— один из самых изученных вирусов, бактериофаг, поражающий бактерию E. coli. Имеет геномную ДНК порядка 169—170 тысяч пар нуклеотидов, упакованную в икосаэдрическую головку. Вирион также имеет ствол, основание ствола и стволовые отростки — шесть длинных и шесть коротких. Enterobacteriaphage T4 является крупным фагом, имеющий диаметр около 90 нм и длину около 200 нм. Фаг T4 использует только литический цикл развития, но не лизогенный. Рассмотрев строение бактериофага, мы выяснили, что все известные бактериофаги состоят из двух основных компонентов: белков и нуклеиновых кислот. По типу нуклеиновой кислоты они делятся на ДНК - и РНК-содержащие.

Базальная пластинка бактериофага – это сложная молекулярная структура, содержащая не менее 15 различных белков, которая узнает рецепторы на поверхности клеток хозяина и осуществляет структурную перестройку хвоста вируса, необходимую для инфицирования клеток. С помощью криоэлектронной микроскопии, удалось реконструировать трехмерную структуру базальной пластинки фага.

Бактериофаги, способные репродуцироваться в бактерии, разрушать их и выходить при этом в виде полноценных частиц в среду, называются вирулентными фагами.

Наряду с такими фагами существуют и другие - умеренные фаги. ДНК таких фагов после заражения клетки внедряется в ДНК самих бактерий, не нарушая их жизнедеятельности. Она удваивается и в результате передается потомству. Бактерия, в ДНК которой присутствует ДНК умеренного фага, называется лизогенной, а фаговая ДНК, объединенная с бактериальной ДНК, профагом. Если лизогенную бактерию облучить ультрафиолетовым светом или обработать химическими мутагенами, то можно вызвать превращение профага в фаг, т. е. возбудить в бактериальной клетке воспроизведение полноценных частиц фага, в результате которого клетка погибает. Следовательно, в лизогенной бактерии в составе единой бактериальной хромосомы сосуществуют генетический аппарат бактерии с геном вируса, который передается от родительской клетки потомству и может быть активирован (индуцирован).

Из этого можно сделать вывод, что фаги это не только средства против бактерий, но и главный их помощник. Именно бактериофаги помогают меняться бактериям, встраивая свой генетический материал в ее ДНК. Разработка новых антибиотиков - чрезвычайно дорогой и долгий процесс. Но даже появление нового лекарства не гарантирует того, что микробы не выработают от него защиты. Эти условия заставляют специалистов искать средства, которые на современном этапе могут помочь при лечении бактериальных инфекций и повысить его эффективность. Такими препаратами в настоящий момент называют бактериофаги.

Список использованной литературы:

1. Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Тео-

ретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой про-

2. Раутенштейн Я.И., Бактериофагия, М., 1955

Когда в 1930-х гг. группа ученых занялась проблемами функционирования живых систем, то в поиске простейших моделей они обратили внимание на бактериофаги – вирусы бактерий. Ведь среди биологических объектов нет ничего проще, чем бактериофаги, к тому же их можно легко и быстро выращивать и анализировать, а вирусные генетические программы невелики.

Фаг – это минимального размера природная структура, содержащая плотно упакованную генетическую программу (ДНК или РНК), в которой нет ничего лишнего. Эта программа заключена в белковую оболочку, снабженную минимальным набором устройств для ее доставки внутрь бактериальной клетки. Бактериофаги не могут размножаться сами по себе, и в этом смысле их нельзя считать полноценными живыми объектами. Их гены начинают работать только в бактерии, используя имеющиеся в бактериальной клетке биосинтетические системы и запасы молекул, необходимых для синтеза. Однако генетические программы этих вирусов принципиально не отличаются от программ более сложных организмов, поэтому эксперименты с бактериофагами позволили установить основополагающие принципы устройства и работы генома.

В дальнейшем эти знания и разработанные в ходе исследований методы стали фундаментом для развития биологической и медицинской науки, а также широкого спектра биотехнологических приложений.

Борцы с патогенами

Первые попытки использовать бактериофаги для лечения инфекционных заболеваний были предприняты практически сразу после их открытия, однако недостаток знаний и несовершенные биотехнологии того времени не позволили достичь полного успеха. Тем не менее дальнейшая клиническая практика показала принципиальную возможность успешного применения бактериофагов при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, при острых гнойно-септических состояниях больных, для лечения хирургических инфекций и т. д.

По сравнению с антибиотиками бактериофаги имеют ряд преимуществ: они не вызывают побочных эффектов, к тому же строго специфичны для определенных видов бактерий, поэтому при их использовании не нарушается нормальный микробиом человека. Однако такая высокая избирательность создает и проблемы: чтобы успешно лечить пациента, нужно точно знать инфекционный агент и подбирать бактериофаг индивидуально.

Бактериофагами лечат инфекционные болезни не только людей, но и домашних и сельскохозяйственных животных: мастит у коров, колибактериоз и эшерихиоз у телят и свиней, сальмонеллез у кур. Особенно удобно применять фаговые препараты в случае аквакультуры – для лечения промышленно выращиваемых рыб и креветок, так как в воде они долго сохраняются. Бактериофаги помогают защитить и растения, хотя применение фаговых технологий в этом случае затруднено из-за воздействия природных факторов, таких как солнечный свет и дождь, губительных для вирусов.

Фаги могут сыграть большую роль в поддержании микробиологической безопасности продуктов питания, так как применение антибиотиков и химических агентов в пищевой отрасли, не решает эту проблему, одновременно снижая уровень экологической чистоты продукции. О серьезности самой проблемы говорят статистические данные: например, в США и России ежегодно регистрируется до 40 тыс. заболевших сальмонеллезом, из которых 1 % умирает. Распространение этой инфекции в значительной степени связано с выращиванием, переработкой и потреблением различных видов птицы, и попытки применить для борьбы с ней бактериофаги дали многообещающие результаты.

Так, американская компания Intralytix производит фаговые препараты для борьбы с листериозом, cальмонеллезом и бактериальным загрязнением кишечной палочкой. Они разрешены к применению как добавки, предотвращающие размножение бактерий на продуктах питания – их распыляют на продукты из мяса и домашней птицы, а также на овощи и фрукты. Эксперименты показали, что коктейль из бактериофагов может быть успешно применен и при транспортировке и реализации живой прудовой рыбы для снижения бактериального загрязнения не только воды, но и самой рыбы.

Очевидным применением бактериофагов является дезинфекция, т. е. уничтожение бактерий в тех местах, где их не должно быть: в больницах, на пищевых производствах и т. п. Для этой цели британская компания Fixed-Phage разработала метод фиксации фаговых препаратов на поверхностях, обеспечивающий сохранение биологической активности фагов до трех лет.

Семь дней творения

Современные методы синтетической биологии позволяют не только вносить различные модификации в фаговые геномы, но и создавать полностью искусственные активные фаги. Технологически это несложно, нужно только синтезировать фаговый геном и ввести его в бактериальную клетку, а там он уже сам запустит все процессы, необходимые для синтеза белков и сборки новых фаговых частиц. В современных лабораториях на эту работу уйдет всего несколько дней.

Генетические модификации применяют, чтобы изменить специфичность фагов и повысить эффективность их терапевтического действия. Для этого наиболее агрессивные фаги снабжают узнающими структурами, связывающими их с целевыми бактериями. Также в вирусные геномы дополнительно встраивают гены, кодирующие токсические для бактерий белки, нарушающие метаболизм, – такие фаги более смертоносны для бактерий.

Универсальный способ защиты бактерий от всех внешних воздействий – так называемые биофильмы, пленки из ДНК, полисахаридов и белков, которые бактерии создают совместными усилиями и куда не проникают ни антибиотики, ни терапевтические белки. Такие биопленки – головная боль врачей, так как они способствуют разрушению зубной эмали, образуются на поверхности имплантов, катетеров, искусственных суставов, а также в дыхательных путях, на поверхности кожи и т. п. Для борьбы с биофильмами были сконструированы особые бактериофаги, содержащие ген, кодирующий специальный литический фермент, разрушающий бактериальные полимеры.

Фаговые антибиотики

В терапевтических целях фаги необязательно использовать напрямую. За миллионы лет эволюции бактериофаги разработали арсенал специфических белков – инструментов для распознавания целевых микроорганизмов и манипуляций с биополимерами жертвы, на основе которых можно создавать противобактериальные препараты. Наиболее перспективными белками такого типа являются ферменты эндолизины, которые фаги используют для разрушения клеточной стенки при выходе из бактерии. Сами по себе эти вещества являются мощными антибактериальными средствами, нетоксичными для человека. Эффективность и направленность их действия можно повысить, изменив в них адресующие структуры – белки, специфически связывающиеся с определенными бактериями.

Большинство бактерий делятся по устройству клеточной стенки на грамположительные, мембрана которых покрыта очень толстым слоем пептидогликанов, и грамотрицательные, у которых слой пептидогликана расположен между двумя мембранами. Использование природных эндолизинов особенно эффективно в случае грамположительных бактерий (стафилококков, стрептококков и др.), поскольку пептидогликановый слой у них расположен снаружи. Грамотрицательные бактерии (cинегнойная палочка, сальмонеллы, кишечная палочка и др.) являются менее доступной мишенью, поскольку ферменту, чтобы добраться до внутреннего пептидогликанового слоя, необходимо проникнуть сквозь внешнюю бактериальную мембрану.

Для преодоления этой проблемы были созданы так называемые артилизины – модифицированные варианты природных эндолизинов, содержащие поликатионные или амфипатические пептиды, которые дестабилизируют внешнюю мембрану и обеспечивают доставку эндолизина непосредственно к пептидогликановому слою. Артилизины обладают высокой бактерицидной активностью и уже показали свою эффективность при лечении отитов у собак (Briers et al., 2014).

Примером модифицированного эндолизина, избирательно действующего на определенные бактерии, является препарат P128 канадской компании GangaGen, Inc. Он представляет собой биологически активный фрагмент эндолизина, соединенный с лизостафином – адресующей белковой молекулой, которая связывается с поверхностью клеток стафилококков. Полученный химерный белок обладает высокой активностью против разных штаммов стафилококка, в том числе обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

Анализируя размножение фагов в присутствии целевых бактерий, можно количественно определить численность последних. Так как количество фаговых частиц в растворе возрастет пропорционально числу содержавшихся в нем бактериальных клеток, то для оценки численности бактерий достаточно определить титр бактериофага.

Специфичность и чувствительность такой аналитической реакции достаточно высока, а сами процедуры просты в исполнении и не требуют сложного оборудования. Важно, что диагностические системы, основанные на бактериофагах, сигнализируют о наличии именно живого патогена, тогда как другие методы, такие как ПЦР и иммуно-аналитические, свидетельствуют лишь о наличии биополимеров, принадлежащих этой бактерии. Такого типа диагностические методы особенно удобны для использования в экологических исследованиях, а также в пищевой индустрии и сельском хозяйстве.

Вероятно, с помощью модифицированных фагов удастся решить и давнюю задачу глобальной важности – разработать дешевые и быстрые методы детекции возбудителей туберкулеза на ранней стадии заболевания. Задача эта очень сложна, поскольку микобактерии, вызывающие туберкулез, отличаются крайне медленным ростом при культивировании в лабораторных условиях. Поэтому диагностика заболевания традиционными методами может затягиваться на срок до нескольких недель.

Фаговая технология позволяет упростить эту задачу. Суть ее в том, что к образцам анализируемой крови добавляют бактериофаг D29, способный поражать широкий спектр микобактерий. Затем бактериофаги отделяют, и образец перемешивают с быстрорастущей непатогенной культурой микобактерий, также чувствительной к этому бактериофагу. Если в крови первоначально имелись микобактерии, которые были инфицированы фагами, то в новой культуре будет также наблюдаться наработка бактериофага. Таким образом можно выявить единичные клетки микобактерий, а сам процесс диагностики с 2—3 недель сокращается до 2—5 дней (Swift & Rees, 2016).

Фаговый дисплей

Из экспериментов Смита последовало два важных вывода: во-первых, используя технологию рекомбинантных ДНК, можно создавать огромные по разнообразию популяции численностью 10 6 –10 14 фаговых частиц, каждая из которых несет на своей поверхности разные варианты белков. Такие популяции назвали комбинаторные фаговые библиотеки. Во-вторых, выделив из популяции конкретный фаг (например, обладающий способностью связываться с определенным белком или органической молекулой), можно этот фаг размножить в бактериальных клетках и получить неограниченное число потомков с заданными свойствами.

На сегодня можно выделить два основных направления применения фагового дисплея. Технология на основе пептидов используется для исследования рецепторов и картирования сайтов связывания антител, создания иммуногенов и нановакцин, а также картирования сайтов связывания субстратов у белков-ферментов. Технология на основе белков и белковых доменов – для отбора антител с заданными свойствами, изучения белок-лигандных взаимодействий, скрининга экспрессируемых фрагментов комплементарной ДНК и направленных модификаций белков.

С помощью фагового дисплея можно вносить узнающие группировки во все виды поверхностных вирусных белков, а также в основной белок, формирующий тело бактериофага. Вводя в поверхностные белки пептиды с заданными свойствами, можно получить целый спектр ценных биотехнологических продуктов. Например, если этот пептид будет имитировать белок опасного вируса или бактерии, узнаваемый иммунной системой, то такой модифицированный бактериофаг представляет собой вакцину, которую можно просто, быстро и безопасно наработать.

Одним из важных применений метода фагового дисплея белков является создание фаговых библиотек рекомбинантных антител, где антигенсвязывающие фрагменты иммуноглобулинов расположены на поверхности фаговых частиц fd или М13. Особый интерес представляют библиотеки антител человека, поскольку такие антитела могут быть использованы в терапии без ограничения. В последние годы только на фармацевтическом рынке США продается около полутора десятка терапевтических антител, сконструированных с использованием этого метода.

Так как вирус представляет собой достаточно жесткую конструкцию с определенным соотношением размерностей, это обстоятельство позволяет использовать его для получения пористых наноструктур с известной площадью поверхности и нужным распределением пор в структуре. Как известно, именно площадь поверхности катализатора является критическим параметром, определяющим его эффективность. А существующие на сегодня технологии формирования на поверхности бактериофагов тончайшего слоя металлов и их оксидов позволяют получать катализаторы с чрезвычайно развитой регулярной поверхностью заданной размерности. (Lee et al., 2012).

Путем покрытия нитчатых фагов золотом и двуокисью индия были получены электрохромные материалы – пористые нанопленки, меняющие цвет при изменении электрического поля, способные реагировать на изменение электрического поля в полтора раза быстрее известных аналогов. Подобного рода материалы перспективны для создания энергосберегающих ультратонких экранных устройств (Nam et al., 2012).

На основе комплексов бактериофага М13, двуокиси титана и одностенных углеродных нанотрубок были также созданы материалы для солнечных батарей (Dang et al., 2011).

Последние годы ознаменовались широкими исследованиями бактериофагов, которые находят себе все новые применения не только в терапии, но и в био- и нанотехнологиях. Их очевидным практическим результатом должно стать возникновение нового мощного направления персонализированной медицины, а также создание целого спектра технологий в пищевой промышленности, ветеринарии, сельском хозяйстве и в производстве современных материалов. Мы ждем, что второе столетие исследований бактериофагов принесет не меньше открытий, чем первое.

Бактериофаги: биология и применение / Ред.: Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир. 2012.

Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир. 1974. 614 с.

Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител // Аcta Naturae. 2009. № 3. C. 6—15.

Mc Grath S., van Sinderen D. Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology. Horizon Scientific Press, 2007.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.

Вирус кишечной T4
классификация Вирус
(Неоцениваемый):	Вирус
Тип:	incertae SEDIS
Учебный класс:	incertae SEDIS
Порядок:	Caudovirales
Семья:	Myoviridae
Род:	T4virus
Виды:	Вирус кишечной T4
деформации
Энтеробактерии фага С16 Энтеробактерии фаг F10 Энтеробактерии фага Fs-альфа Энтеробактерии фага PST Энтеробактерии фага SKII Энтеробактерии фага SKV Энтеробактерии фага SKX Энтеробактерии фага SV3 Энтеробактерии фага Т2 Фаг т4 Энтеробактерии фага T6
Синонимы