Генетика и селекция вирусов

Генетика бактерий и вирусов.

Молекулярная биология, изучающая фундаментальные основы жизни, является в значительной степени детищем микробиологии. В качестве основных объектов изучения в ней используют вирусы и бактерии, а основное направление- молекулярная генетика основана на генетике бактерий и фагов.

Бактерии- удобный материал для генетики. Их отличает:

- относительная простота генома (сопокупности нуклеотидов хромосом);

- гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;

- различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК ;

- половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток;

- легкость культивирования, быстрота накопления биомасс.

Общие представления о генетике.

Ген- уникальная структурная единица наследственности, носитель и хранитель жизни. Он имеет три фундаментальные функции .

1. Непрерывность наследственности - обеспечивается механизмом репликации ДНК.

2. Управление структурами и функциями организма - обеспечивается с помощью единого генетического кода из четырех оснований (А- аденин, Т- тимин, Г- гуанин, Ц- цитозин). Код триплетный, поскольку кодон - функциональная единица, кодирующая аминокислоту, состоит из трех оснований (букв).

3. Эволюция организмов- благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.

В узкоспециальном плане ген чаще всего представляет структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи (белка). Хромосома состоит из особых функциональных единиц- оперонов.

Основные этапы развития (усложнения) генетической системы можно представить в виде следующей схемы:

кодон  ген  оперон  геном вирусов и плазмид  хромосома прокариот (нуклеоид)  хромосомы эукариот (ядро).

Генетический материал бактерий.

1. Ядерные структуры бактерий - хроматиновые тельца или нуклеоиды (хромосомная ДНК). У бактерий одна замкнутая кольцевидная хромосома (до 4 тысяч отдельных генов). Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы (репликация ДНК) сопровождается делением клетки. Вегетативная репликация хромосомной (и плазмидной) ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали- от родительской клетки- к дочерней. Передача генетической информации по горизонтали осуществляется различными механизмами- в результате конъюгации, трансдукции, трансформации, сексдукции.

2.Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидами, мигрирующими генетическими элементами- транспозонами и инсервационными (вставочными) или IS - последовательностями.

Плазмиды- экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Их объединение в одно царство жизни с вирусами связано с наличием ряда общих свойств- отсутствием собственных систем мобилизации энергии и синтеза белка, саморепликацией генома, абсолютным внутриклеточным паразитизмом.

Их выделение в отдельный класс определяется существенными отличиями от вирусов.

1.Среда их обитания- только бактерии (среди вирусов , кроме вирусов бактерий- бактериофагов имеются вирусы растений и животных).

2.Плазмиды сосуществуют с бактериями, наделяя их дополнительными свойствами. У вирусов эти свойства могут быть только у умеренных фагов при лизогении бактерий, чаще же всего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток.

3.Геном представлен двунитевой ДНК.

4.Плазмиды представляют собой “голые” геномы, не имеющие никакой оболочки, их репликация не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.

Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. В зависимости от наличия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra- оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий- интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды ( эписомы ).

Классификация и биологическая роль плазмид.

Функциональная классификация плазмид основана на свойствах, которыми они наделяют бактерии. Среди них- способность продуцировать экзотоксины и ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам, синтез бактериоцинов.

Основные категории плазмид.

1.F- плазмиды - донорские функции, индуцируют деление (от fertility - плодовитость). Интегрированные F - плазмиды- Hfr- плазмиды (высокой частоты рекомбинаций).

2.R- плазмиды (resistance) - устойчивость к лекарственным препаратам.

3.Col- плазмиды- синтез колицинов (бактериоцинов)- факторов конкуренции близкородственных бактерий (антогонизм). На этом свойстве основано колицинотипирование штаммов.

4.Hly- плазмиды- синтез гемолизинов.

5.Ent- плазмиды- синтез энтеротоксинов.

6.Tox- плазмиды- токсинообразование.

Близкородственные плазмиды не способны стабильно сосуществовать, что позволило объединить их по степени родства в Inc- группы (incompatibility- несовместимость).

Биологическая роль плазмид многообразна, в том числе:

- контроль генетического обмена бактерий;

- контроль синтеза факторов патогенности;

- совершенствование защиты бактерий.

Бактерии для плазмид- среда обитания, плазмиды для них- переносимые между ними дополнительные геномы с наборами генов, благоприятствующих сохранению бактерий в природе.

Мигрирующие генетические элементы - отдельные участки ДНК, способные определять свой перенос между хромосомами или хромосомой и плазмидой с помощью фермента рекомбинации транспозазы . Простейшим их типом являются инсерционные последовательности ( IS - элементы) или вставочные элементы , несущие только один ген транспозазы, с помощью которой IS- элементы могут встраиваться в различные участки хромосомы. Их функции- координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов и генофора для обеспечения репродукции, регуляция активности генов, индукция мутаций. Величина IS- элементов не превышает 1500 пар оснований.

Транспозоны ( Tn - элементы) включают до 25 тысяч пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два Is- элемента. Каждый транспозон содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики, как и плазмиды (множественная устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и т.д.). Транспозоны- самоинтегрирующиеся фрагменты ДНК, могут встраиваться и перемещаться среди хромосом, плазмид, умеренных фагов, т.е. обладают потенциальной способностью распространяться среди различных видов бактерий.

Понятие о генотипе и фенотипе.

Генотип- вся совокупность имеющихся у организма генов.

Фенотип - совокупность реализованных (т.е. внешних) генетически детерминированных признаков, т.е. индивидуальное (в определенных условиях внешней среды) проявление генотипа. При изменении условий существования фенотип бактерий изменяется при сохранении генотипа.

Изменчивость у бактерий может быть ненаследуемой ( модификационной) и генотипической ( мутации, рекомбинации).

Временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие как адаптивные реакции бактерий на изменения окружающей среды, называются модификациями (чаще - морфологические и биохимические модификации). После устранения причины бактерии реверсируют к исходному фенотипу.

Стандартное проявление модификации- распределение однородной популяции на две или более двух типов- диссоциация. Пример- характер роста на питательных средах: S- (гладкие) колонии, R- (шероховатые) колонии, M- (мукоидные, слизистые) колонии, D- (карликовые) колонии. Диссоциация протекает обычно в направлении S R. Диссоциация сопровождается изменениями биохимических, морфологических, антигенных и вирулентных свойств возбудителей.

Мутации - скачкообразные изменения наследственного признака. Могут быть спонтанные и индуцированные, генные (изменения одного гена) и хромосомные (изменения двух или более двух участков хромосомы).

Одновременно у бактерий имеются различные механизмы репарации мутаций , в том числе с использованием ферментов- эндонуклеаз, лигаз, ДНК- полимеразы.

Генетические рекомбинации- изменчивость, связанная с обменом генетической информации. Генетические рекомбинации могут осуществляться путем трансформации, трансдукции, конъюгации, слияния протопластов.

1.Трансформация- захват и поглощение фрагментов чужой ДНК и образование на этой основе рекомбинанта.

2.Трансдукция- перенос генетического материала фагами (умеренными фагами- специфическая трансдукция).

3.Конъюгация- при непосредственном контакте клеток. Контролируется tra (transfer) опероном. Главную роль играют конъюгативные F- плазмиды.

Геном вирусов содержит или РНК, или ДНК (РНК- и ДНК- вирусы соответственно). Выделяют позитивную (+) РНК, обладающую матричной активностью и соответственно- инфекционными свойствами, и негативную ( - ) РНК, не проявляющую инфекционные свойства, которая для воспроизводства толжна транскрибироваться (превращаться) в +РНК. Механизмы репродукции различных вирусов очень сложные и существенно отличаются. Основные их схематические варианты представлены ниже.

1. вирионная (матричная) +РНК  комплементарная -РНК (в рибосомах)  вирионная +РНК.

2. - РНК  вирусная (информационная) +РНК  - РНК (формируется на геноме зараженной клетки).

3. однонитевая ДНК: +ДНК  +ДНК -ДНК  +ДНК -ДНК +ДНК  +ДНК.

4. ретровирусная однонитевая РНК: РНК  ДНК (провирус)  РНК.

5. двунитевая ДНК: разделение нитей ДНК и формирование на каждой комплементарной нити ДНК.

Генофонд вирусов создается и пополняется из четырех основных источников:

двух внутренних (мутации, рекомбинации) и двух внешних (включение в геном генетического материала клетки хозяина, поток генов из других вирусных популяций).

Комплементация - функциональное взаимодействие двух дефектных вирусов, способствующее их репликации и горизонтальной передаче.

Фенотипическое смешивание - при заражении клетки близкородственными вирусами с образованием вирионов с гибридными капсидами, кодируемыми геномами двух вирусов.

Популяционная изменчивость вирусов связана с двумя разнонаправленными процессами - мутациями и селекцией, связанными с внешней средой как индуктором мутаций и фактором стабилизирующего отбора. Гетерогенность вирусных популяций- адаптационный генетический механизм, способствующий пластичности (устойчивости, приспособляемости) популяций, фактор эволюции и сохранения видов во внешней среде.

Генофонд вирусных популяций сохраняется за счет нескольких механизмов:

- восстановления изменчивости за счет мутаций;

- резервирующих механизмов (возможность перехода любых, даже негативных мутаций в следующую генерацию)- комплементация, рекомбинация;

- буферных механизмов (образование дефектных вирусных частиц, иммунных комплексов и др.), способствующие сохранению вируса в изменяющихся внешних условиях.

S: Cинтез одного белка контролирует фрагмент генома вируса … .

S: Основные свойства гена вируса:

S: Свойственная данному вирусу совокупность генетических признаков:

S: Геном вирусов животных является … .

+: гаплоидным, кроме ретровирусов

–: гаплоидным и диплоидным

S: Проявление генотипа вируса в конкретных условиях внешней среды:

S: Культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами:

S: Групповыми и видовыми признаками штаммов вирусов являются:

+: тип нуклеиновой кислоты, размеры и морфология

+: тип капсида, количество капсомеров

+: антигенная специфичность, наличие антигенов хозяина

–: терморезистентность, характер бляшек

–: отношение к УФ-лучам, ингибиторам

S: Относят к внутриштаммовым признакам вирусов:

–: тип нуклеиновой кислоты

S: Дифференциацию штаммов вируса производят на основании наиболее существенных генетических признаков:

+: патогенность штаммов для восприимчивого хозяина

+: морфология бляшек на культуре клеток под агаром

+: способность вируса к репродукции при t = 37 и 40 о С

–: устойчивость к органическим растворителям

–: отношение к ингибиторам

S: Потенциальная способность вируса вызывать инфекционный процесс - … вируса.

S: Степень выраженности патогенности - это … вируса.

S: Вирулентность вируса зависит от:

+: пути введения вируса в организм

–: наличия фермента нейраминидазы

S: Способность к изменениям свойств вируса при жизни называется ### вируса.

S: Наследственной и ненаследственной бывает … .

S: Обмен генетическим материалом между двумя близкими и отличающимися по наследственным свойствам вирусами называется … .

S: Наследуемые изменения гена или генов вируса:

S: Обусловленные заменой одного нуклеотида для РНК-вирусов мутации называются ###.

S: Обусловленные заменой одной пары комплементарных нуклеотидов для ДНК-вирусов мутации называются ###.

S: Значительный участок генома вируса затрагивают … мутации.

S: Фенотип вируса восстанавливают:

S: Возникают в популяции вируса под влиянием невыясненных факторов в естественных условиях:

S: Индуцированные мутации вирусов … .

+: возникают в лабораторных условиях

–: индуцированы окружающей средой

–: возникают под действием индуктивного тока

–: возникают при адаптации вирусов к новым системам

–: возникают под действием света

S: Преимущества искусственных мутагенов:

+: известная направленность действия

–: безвредны для человека и животных

–: лёгкость получения в лаборатории

S: Реагируют с нуклеиновой кислотой вируса только во время её репликации мутагены:

+: аналоги пуриновых оснований

+: аналоги пиримидиновых оснований

S: Взаимозамена внутри пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований при мутации у вирусов называется … .

S: Более глубокие изменения генома вирусов происходят при … .

+: делеции или вставке

+: выпадение азотистого основания в РНК

–: вставка азотистого основания в РНК

–: вид генетического взаимодействия вирусов

–: вид негенетического взаимодействия вирусов

–: метод селекции вирусов

S: Негенетические взаимодействия вирусов:

S: Вирионы с генотипом одного из исходных штаммов и с антигенными свойствами обоих вирусов образуются при … .

S: Два дефектных вируса при смешанной инфекции проходят полный цикл репродукции без изменения генотипа при … .

S: Интерференция вирусов:

+: подавление репродукции одного вируса другим

–: выработка интерферона в ответ на действия вируса

–: заимствование одним вирусом фермента другого

–: стабильное объединение геномов двух вирусов

–: нестойкое объединение генетического материала

S: Инактивированный вирус с повреждениями в капсиде проходит полный цикл репродукции с помощью родственного вируса при … .

S: Вирус–сателлит проходит полный цикл репродукции с помощью вируса-помощника при … .

S: Генетические взаимодействия вирусов:

S: Обмен неповреждёнными участками вирусной нуклеиновой кислоты между инактивированными вирионами:

S: Стабильное объединение геномов двух вирусов в капсид одного их них:

S: Свойственные только вирусам генетические взаимодействия:

S: Стойкое объединение в одном вирусном геноме генетического материала разных родительских вирусов:

S: Диплоидные или полиплоидные вирионы образуются при … .

S: Свойственные только вирусам негенетические взаимодействия:

S: Создание условий для размножения вирусов с изменёнными геномами:

S: Методы селекции вирусов:

+: выделение клонов из пустул на ХАО эмбриона

+: селекция клонов из бляшек на культуре клеток

+: избирательной адсорбции и элюции

S: Генетически однородная популяция из одного вириона вируса ###.

S: Метод … - это метод селекции, основанный на инфицировании куриных эмбрионов или культур клеток единичным вирионом.

–: избирательной адсорбции и элюции

–: пассажей в изменённых условиях культивирования

–: выделения клонов из пустул на ХАО эмбриона

–: выделения клонов из бляшек на культуре клеток

S: Мутации вирусов по происхождению делят на:

S: Мутации вирусов по направлению делят на ###.

+: прямые и обратные

S: Мутации вирусов по протяженности делят на:

Новосибирским институтом биохимии совместно с Институтом гриппа (Санкт-Петербург) определена первичная структура гена М2 у двадцати одного штамма вируса гриппа А с различной степенью устойчивости к химиопрепаратам адамантанового ряда.
В результате анализа полученных данных показано, что устойчивость вирусов гриппа типа А к данным химиопрепаратам определяется заменами аминокислот в транс-мембранном домене белка М2. При получении устойчивых к химиопрепаратам вариантов в лабораторных условиях показано, что для изменения фенотипа вируса с чувствительного на устойчивый достаточно единичной нуклеотидной замены в участке 7-го сегмента РНК, которая приводит к аминокислотной замене в транс-мембранном домене белка М2.
П редложена модель взаимодействия белка М2 вируса гриппа с химиопрепаратами адамантанового ряда, согласно которой такие химиопрепараты подвижно ориентированы в полости канала, сформированного тетрамером белка М2.
Проведен анализ вторичной структуры 7-го сегмента РНК вируса гриппа типа А. В ней обнаружены консервативные (шпилечные) и вариабельные участки. Замены, связанные с устойчивостью к химиопрепаратам, расположены в вариабельном участке, что может говорить о случайном появлении устойчивых вариантов вирусов, никак не связанном с применением этих препаратов в медицине.
В Новосибирском институте биоорганической химии разработаны принципиально новые подходы к конструированию геннаправленных биологически активных веществ. Предложены и испытаны многокомпонентные системы производных олигонуклеотидов.
П редложен новый подход для увеличения эффективности и специфичности комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот: впервые созданы реагенты на основе неактивных групп-предшественников, которые формируют фотоактивируемые системы при сборке на матрице ДНК-мишени.
О дним из компонентов этой системы является олигонуклеотидное производное инертного красителя-сенсибилизатора (S), другим - олигонуклеотидное производное нечувствительного к видимому свету фотореагента (R). После независимого связывания обоих производных с ДНК-мишенью, S и R оказываются стерически сближенными. Вследствие этого при облучении видимым светом наблюдается многократное увеличение скорости фотомодификации мишени за счет синглет-синглетного переноса энергии электронного возбуждения с S на R. На примере 5'-фланкирующего участка гена цитохрома показано, что при физиологических условиях сенсибилизированная фотомодификация происходит в 10000 раз быстрее, ее селективность и эффективность в 100 раз больше, чем для прямой несенсибилизированной фотомодификации. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени идет только в полностью комплементарном комплексе, в любой заранее заданный момент времени под действием видимого света, что делает ее пригодной для использования in vivo .
В том же Институте разработан метод синтеза и создан ряд новых биологически активных соединений на основе фосфотиоатных аналогов олигодезоксинуклеотидов (ФТАО).
Ф ТАО отличаются от природных олигонуклеотидов наличием атомов серы в межнуклеотидных фосфатных группах, что обеспечивает им большую устойчивость к действию клеточных нуклеаз, большее сродство к рецепторам иммунной системы и повышенную биологическую активность против вирусов. С целью увеличения проницаемости ФТАО через клеточные мембраны получены холестериновые производные ФТАО. Для повышения эффективности взаимодействия аналогов олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами в структуру ФТАО введены полиароматические (феназиниевые, Phn) группировки, увеличивающие прочность формируемых дуплексов. Синтезирована серия химически активных производных ФТАО, несущих на 3'- или 5'- фосфатных группах остатки алкилирующего амина (RCl), N-метилими- дазола (MeIM) или диметиламинопиридина (DMAP). Получен ряд бифункциональных производных ФТАО, имеющих в своей структуре одновременно реакционноспособную группировку RCl, MeIM или DMAP и стабилизирующий дуплексы полиароматический остаток Phn. Разработан способ введения в структуру ФТАО линкеров, имеющих аминогруппу. Эти производные являются ключевыми соединениями для получения различных производных ФТАО с заданным спектром их действия, поскольку они несут нуклеофильную аминогруппировку, способную вступать в реакции со многими химическими группировками.
В Институте цитологии и генетики впервые разработан компьютерный метод распознавания промоторов в нуклеотидных последовательностях генома человека. Промоторы имеют длину несколько сотен пар оснований и обеспечивают регуляцию транскрипции генов. Метод основан на поиске потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов и анализируемой последовательности и последующем вычислении регуляторного потенциала М для каждого участка ДНК со скользящим окном размером 600 пар оснований. Величина регуляторного потенциала М оценивает степень насыщенности анализируемого района сайтами связывания. Указанный метод позволяет распознавать промоторы эукариот с весьма высоким уровнем точности.
На рисунке представлен пример поиска промоторов в длинной нуклеотидной последовательности генома человека размером 12 тыс. пар оснований. Эта последовательность содержит кластер из двух функционирующих генов aльфа 1 и альфа 2. Каждый из этих генов имеет промотор, положение которого обозначено стрелкой. Кроме того, имеется один псевдоген (пси-альфа 1), то есть нефункционирующий ген, лишенный промотора. На рисунке видно, что рассчитанный регуляторный потенциал максимален в районе промоторов и имеет низкую величину для псевдогена.
В том же Институте обнаружен феномен необычного для млекопитающих размножения клеток в доимплантационных зародышах норки в связи с существованием у этого вида обязательной задержки имплантации на срок до 3-х недель. Исходные диплоидные клетки, содержащие 2 набора хромосом, путем многократного копирования upnlnqnl в пределах клеточного ядра (политенизации) достигают высоких уровней плоидности (до 512 и более хромосомных наборов).
З атем эти гигантские клетки "перешнуровываются" и разделяются подобно тому, как это происходит у простейших организмов, на несколько дочерних клеток. Эти клетки обладают высокой функциональной активностью, что обеспечивает успешную имплантацию зародыша. Предполагается, что этот механизм лежит в основе адаптивного значения сезонной эмбриональной диапаузы, широко распространенной в животном мире.
В ИЦГ в течение многих лет ведутся работы по изучению эволюции и функциональной значимости таксоноспецифической повторяющейся ДНК, как одного из возможных факторов реорганизации генетического материала в ходе видообразования. Осуществлен сравнительный анализ первичной структуры образцов ДНК, выделенной из четырех видов семейства Собачьих.
П оказано, что эта ДНК состоит из пяти отличающихся по структуре блоков (А, В, С, Д, Е), причем каждый вариант консервативен для всех изученных видов. Эти блоки произошли путем дивергенции и последующих амплификационных событий от единой предковой последовательности ДНК. Образование более сложных структур путем комбинирования разных блоков ДНК потребовало 50-60 млн лет. Для сравнения, время возникновения современных видов семейства Собачьих исчисляется в 5-10 млн лет. Следовательно, формирование сложной структуры повторяющейся ДНК предшествовало видообразованию. Функциональный анализ этой таксоноспецифической повторяющейся ДНК методами компьютерного анализа показал в ней наличие множества потенциальных регуляторных элементов. Их состав и взаимное расположение оказались сходными с аналогичными элементами регуляторных областей генов. Таким образом, потенциальные возможности таксоноспецифической ДНК позволяют ей в ходе эволюции участвовать в реорганизации регуляторных областей генов.
В Лимнологическом институте получен интересный результат по исследованию генетических расстояний между различными популяциями эндемичного рачка Eulimno-gammarus cyaneus путем анализа изоферментов. Это животное обитает на омываемых прибоем каменистых пляжах, ареал его обитания представляет собой прерывистую "ленту" шириной около 2 м, тянущуюся вокруг Байкала. Рачок не способен преодолевать большие глубины, и потому его локальные популяции репродуктивно изолированы друг от друга. Генетическое расстояние между случайно взятыми соседними популяциями оказалось равным 0,001, что в пределах ошибки метода говорит о времени их расхождения порядка сотен лет - первых тысячелетий. Одним из исключений являются две популяции, живущие по разные стороны от истока Ангары.
Н есмотря на небольшое физическое расстояние между местами их обитания (около 100 м), генетическое расстояние очень велико (0,01), что свидетельствует о времени расхождения порядка 50-60 тыс лет от настоящего времени. Незамерзающий исток Ангары является для рачков практически непреодолимым препятствием. По геологическим данным, исток Ангары открылся около 50 тыс. лет назад, что очень хорошо соответствует генетическим данным. Это обстоятельство ставит на повестку дня исследование популяций, разделенных другими географическими барьерами, с целью выявления механизмов видообразования на фоне геологических событий. Эта работа была выполнена биологами Института совместно с японскими коллегами.
В Институте биофизики получены результаты по расшифровке структуры и механизма действия светоизлучающих белков - фотопротеинов: клонирована к ДНК, кодирующая Са-активируемый фотопротеин обелин, определена его нуклеотидная последовательность и по ней восстановлена первичная структура обелина. По этим данным совместно с Шведским Королевским Институтом медицины построена пространственная структура обелина, что создает основу для расшифровки механизма действия люцифераз - белков, обладающих уникальной способностью конверсии химической энергии в излучение оптического диапазона с эффективностью, близкой в некоторых случаях к 100%.
В пространственной структуре обелина крупными кружками обозначены предполагаемые сайты связывания трех ионов Са, после присоединения которых комплекс обелин-субстрат излучает фотон с длиной волны 469 нм. Практически обелин может использоваться как высокочувствительный безынерционный индикатор ионов Са в клетках и тканях.
В СИФиБРе в результате поиска эндогенных соединений, способствующих накоплению в клетках растений важных в хозяйственном отношении метаболитов (в частности, сахарозы) показано, что некоторые фитогормоны, например, гиберреловая кислота, в значительной степени стимулируют активность протонных насосов тонопласта, принимающих участие в транспорте и накоплении сахарозы. На примере красной свеклы установлено, что от фазы онтогенеза растения зависит концентрация гормона, способная вызвать максимальную стимуляцию активности Н + -АТФазы - фермента, создающего протонный градиент на мембране и играющего ключевую роль в транспорте сахарозы.
К ак видно из графика, в период активного сахаронакопления для максимальной активации Н + -АТФазы требуется в 10000 раз меньшая концентрация гибберелина по сравнению с периодом покоя. Результат имеет важное значение для понимания механизмов регуляции сахаронакопления в растительной клетке.

Изменение морфологических признаков у трансгенных растений табака.

Верхний ряд - изменение структуры цветка и лонгостилия;
нижний ряд - нетрансгенные растения (контроль)

1 - дикорастущего ячменя H. geniculatum All.;
2 - пшеницы T. aestivum L.;
3 - беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов H. geniculatum All. x T. aestivum L.

Регенерация растений в культуре пыльников беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов

Флюоресцентная геномная in situ гибридизация митотических х ромосом аллоплазматических линий пшеницы, полученных на основе ячменно-пшеничных гибридов H. geniculatum ALL. (2n=28) x T. aestivum L. (2n=42). FITC (зеленый) соответствует х ромосомам H. geniculatum

Остистие и безостые (с моногенным контролем) формы пшениц

Генетическая карта короткого плеча хромосомы 1В сорта Salmon

Молекулярно-генетическая карта 3-й гомеологической группы хромосом пшеницы. S1, S2 и S3 - сферококкоидные гены пшеницы. Генетические расстояния указаны в сантиМорганидах (сМ). Центромера отмечена черным цветом.

Гибридизация in situ Spelt1 повторов на метафазные хромосомы Ae. speltoides

В отделе общей генетики растений исследования ведутся по следующим направлениям:

· генная инженерия - трансгенные растения;

· хромосомная инженерия - отдаленная гибридизация, хромосомные замещения ;

· системы размножения растений;

· биоразнообразие и генетические коллекции.

Сотрудниками лаборатории гетерозиса растений (зам. зав. лабораторией к.б.н. Е.В.Дейнеко), входящей в состав отдела, проводятся исследования функционирования чужеродных генов в новом генетическом окружении растительного генома с использованием серии созданных модельных трансгенных растений табака ( Nicotiana tabacum, SR1). Установлено, что перенесенные гены, как правило, стабильно экспрессируются и наследуются у потомков трансгенных растений. Однако в некоторых случаях может происх одить их "замолкание" (инактивирование). Выявлены случаи реверсий от нестабильного к стабильному уровню экспрессии трансгена. Созданы линии трансгенных растений табака, моделирующие нестабильный уровень экспрессии маркерного гена nptII . Исследуются молекулярные механизмы феномена замолкания трансгенов у созданных трансгенных растений.

В ходе работ у трансгенных растений табака получена серия мутаций, индуцированных Т-ДНК инсерциями, затрагивающих строение цветка и летальность пыльцевых зерен. Показано сцепленное наследование признака лонгостилии и устойчивости к антибиотику канамицину. С помощью цитологического анализа выявлены аномалии, связанные с нарушениями микроспоро- и гаметогенеза. Проводится анализ районов растительной ДНК, фланкирующих Т-ДНК инсерции у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом. Установлена гомология с известными генетическими структурами банка данных "Genebank".

Научные интересы коллектива сектора генной инженерии растений (зав. сектором к.б.н. А.В.Кочетов) сфокусированы на изучении сигналов, контролирующих экспрессию генов высших растений на пост-транскрипционном уровне. Проведен экспериментальный анализ экспрессии оперонных композиций генов в трансгенных растениях , показано, что дистальные гены в оперонах экспрессируются с низкой эффективностью. Изучение свойств трансляционных энхансеров вирусов мозаики люцерны и гравировки табака показало, что трансляционная активность этих последовательностей зависит от места их локализации в структуре матрицы. Сравнительный анализ характеристик последовательностей мРНК генов высокого и низкого уровней экспрессии позволил выявить энхансероподобные сигналы, потенциально определяющие эффективность инициации трансляции. На основе этих данных была создана компьютерная система, позволяющая предсказывать уровень трансляционной активности мРНК генов высших растений, которая может использоваться для оптимизации экспрессии трансгенов в генной инженерии растений.

В течение ряда лет в группе физико-химической биологии (зав. сектором к.х .н. С.И.Ошевский) разрабатываются варианты антисенс-подхода для эффективной адресованной модификации одно- и двух цепочечной ДНК включаемыми реакционноспособными олигонуклеотидными производными. Работы проводятся на базе включаемых алкилирующих олигонуклеотидных производных , несущих алкилирующую функцию на 5'-тиофосфатном конце, химико- ферментативный метод получения которых разработан руководителем группы.

Предложена новая стратегия антисенс-подхода - "бинарный олигонуклеотидный реагент". Показано, что направляемая нуклеиновой кислотой-мишенью реакция аутолигирования между двумя олигонуклеотидными производными (несущими различные реакционноспособные группы на противоположных концах двух различных олигонуклеотидных производных , комплементарных соседним участкам НК-мишени) приводит к ее в несколько раз более эффективной модификации, чем модификация одним из этих производных , даже в присутствии олигонуклеотидов-эффекторов. Совместно с INSERM Unite 268 (Франция) с помощью спецально разработанного набора эффективных PCR-праймеров, специфичных к кДНК каждой из 11 изоформ, проведены исследования уровня экспрессии 11 изоформ протеинкиназ С человека в СD34+ стволовых клетках в процессе их дифференциации. Планируется проведение этих исследований на раковых клетках больных лейкемией.

Основное направление исследований сектора отдаленной гибридизации и культуры тканей (зав. сектором д.б.н. Л.А.Першина) - реконструкция геномов растений на основе отдаленной гибридизации и методов in vitro. Сотрудниками сектора вскрыты механизмы несовместимости между видами Hordeum L. и Secale L., Hordeum L. и Triticum L. Разработан комплекс генетических и биотехнологических методов, способствующих преодолению несовместимости при создании новых форм растений при гибридизации ячмень-рожь, ячмень-пшеница. На основе изучения созданных экспериментальных моделей установлены цитогенетические и генетические механизмы восстановления фертильности у межподтрибных гибридов. Выявлены закономерности преобразования ядерных геномов в процессе формирования новых генотипов ржи и пшеницы при наличии цитоплазматических геномов ячменя. Созданные группой уникальные серии аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий мягкой пшеницы широко используются в генетических исследованиях .

Сотрудниками сектора цитогенетики пшеницы (зав. сектором к.б.н. Л.И.Лайкова) созданы и поддерживаются коллекции анеуплоидных (моносомных и цитологически маркированных ) линий мягкой пшеницы по сортам Саратовская 29, Диамант 1 и по сорту Чайниз Спринг, линии с межсортовым и чужеродным замещением хромосом, а также изогенные линии. Коллекции насчитывают более 100 образцов и позволяют с применением молекулярно-генетических и цитогенетических методов более глубоко изучать геном злаков. С их применением проведена хромосомная локализация и картирование более 20 генов пшеницы и обнаружен неизвестный ранее аллелизм по некоторым генам. Идентифицированные гены внесены в Международный Каталог генных символов пшеницы.

Замещенные и анеуплоидные линии позволяют изучать сложноконтролируемые хозяйственно ценные признаки. В частности, изучена роль отдельных хромосом пшеницы в реакции растений на элементы минерального питания, качество и содержание клейковины, засухо- и морозоустойчивость. Использование хромосомной инженерии позволяет получать исходный материал для селекции.

Цитогенетическая коллекция дает возможность выполнять сравнительные эволюционно -генетические исследования малоизученных сородичей мягкой пшеницы. Впервые проведен генетический анализ образцов видов Triticum petropavlovskyi Udacz. et Migusch. и Triticum sphaerococcum Perciv. по ряду морфологических и физиологических признаков. Обнаружено, что 13 доминантных генов первого из двух видов аллельны мягкой пшенице и выполняют общие функции.

Основные научные направления работы сектора генетики пшениц (зав. сектором к.б.н. Н.П. Гончаров) связаны с изучением частной и сравнительной генетики пшениц и их сородичей. Coзданы фен- и генетические коллекции пшениц на ди- и тетраплоидном уровне, позволяющие успешно проводить исследования в этом направлении. Создание первых в мире изогенных линии по генам Vrn , контролирующим тип (яровость-озимость) и скорость развития, на базе тетраплоидной пшеницы позволило провести работы по геногеографии генов Vrn у тетраплоидных видов пшениц.

Ведутся работы по сравнительно- генетическому изучению систем генов, являющихся маркерными в работах по систематике родов Triticum L. и Aegilops L. проведено молекулярно-генетическое исследование происхождения пшениц Сибири и показано их европейское происхождение. За последние 5 лет выполнен ряд хромосомных локализаций генов у мягкой и твердой пшениц, картировано короткое плечо хромосомы 1В.

В секторе молекулярной генетики злаков (зав. сектором к.б.н. Е.А.Салина) ведутся работы по исследованию структурно-функциональной организации генома пшеницы и еe сородичей. Основное внимание сосредоточено на изучении повторяющихся последовательностей ДНК и реорганизации их структуры в процессе эволюции и стрессовых условиях . Основные достижения в этой области связаны с получением новых и оригинальных результатов по организации субтеломерных районов хромосом пшеницы и ее диких предков, по организации мобильных элементов ячменя. В секторе создаются и постоянно расширяются коллекции геном- и хромосомспецифичных молекулярных маркеров. Данные коллекции используются для картирования генов и геномов злаковых , для анализа гибридных форм пшеницы искусственного и естественного происх ождения, а также для идентификации молекулярных маркеров, тесно сцепленных с морфологическими и хозяйственно ценными генами пшеницы. На основе полученных результатов разрабатываются подходы: 1) к молекулярному изучению организации и функционирования агрономически важных генов пшеницы; 2) к использованию молекулярно-генетических методов в селекции растений.