Метод окраски туберкулезных палочек

Консультант по гематологии,

цитохимии и микробиологии

Важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для профилактики, диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у больных в лечебно-профилактических учреждениях занимают микробиологические исследования. Современная клиническая медицина предъявляет к микробиологическим (бактериологическим) исследованиям возрастающие требования по увеличению объема, повышению качества исследований, разработке и внедрению новых более совершенных методов. Это связано как с новыми научными достижениями в области эпидемиологии и бактериологии, так и с увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, ростом госпитальных инфекций.

Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат: отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в предварительно простерилизованные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитирующей микрофлоры, развитию процессов гниения и брожения, что искажает результаты анализа. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1-2 часа. Самым простым методом выявления микобактерий туберкулеза в выделениях больных является микроскопия мазка, приготовленного из мокроты. При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии.

Чувствительность метода люминесцентной микроскопии значительно выше - от 10 000 до 100 000 микобактерий в 1 мл материала, кроме того, этот метод дает возможность за значительно более короткое время просмотреть необходимое количество препаратов. Эффективность бактериоскопии повышается также при передаче изображения на компьютер при помощи присоединенной к микроскопу видеокамеры.

Чтобы диагностировать туберкулез, необходимо сделать все возможное для выявления возбудителя заболевания. Микробиологически диагноз может быть подтвержден на основе результатов культурального исследования на комплекс M. tuberculosis (или, при возможности, путем идентификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот) в пробах, взятых в месте локализации патологического процесса. Однако на практике в настоящее время многие лаборатории не располагают материально-технической базой для проведения культуральных исследований. К счастью, микроскопия окрашенных препаратов мокроты доступна практически везде, поэтому диагностика туберкулеза может проводиться на основе выявления кислотоустойчивых микобактерий. На территориях с высокой распространенностью туберкулеза выявление кислотоустойчивых микобактерий в окрашенных препаратах мокроты демонстрирует высокую специфичность, поэтому положительный результат микроскопии мокроты можно рассматривать как подтверждение диагноза. Кроме высокой специфичности к комплексу M. tuberculosis, выявление кислотоустойчивых микобактерий при микроскопии играет важную роль по трем причинам: это – наиболее быстрый метод диагностики туберкулеза; позволяет выявить больных с тяжелым развитием патологии, чреватым высоким риском летального исхода; дает возможность выявить больных, являющихся распространителями инфекции.

Оценка качества работы лабораторий микроскопии должна проводиться соответствующим государственными органом (как правило, представителями национальной программы борьбы с туберкулезом).

Неправильный диагноз, поставленный перед началом лечения, приводит к риску ненужного, неправильного или неудачного лечения. Более того, подобный подход чреват несвоевременной постановкой правильного диагноза и назначением соответствующего лечения. При надлежащем подходе и контроле в большинстве случаев у детей в возрасте пяти лет и старше могут быть получены образцы мокроты. У подростков (хотя они часто относятся к детской возрастной группе, по крайней мере, до 15 лет) получить пробы мокроты не составляет большого труда. Поэтому фактор возраста не может рассматриваться как препятствие для сбора проб мокроты у детей и подростков.

Исходя из имеющихся данных, можно прийти к заключению, что для диагностики туберкулеза необходимо взять не менее двух проб мокроты. В случаях, когда имеются соответствующие возможности, можно направлять для лабораторного исследования еще и третью пробу, но исследование более трех проб мокроты вряд ли целесообразно, поскольку не может в значительной мере повысить эффективность диагностики. Кроме того, исследование третьей пробы может оказаться полезным только для подтверждения диагноза, если одна или две предыдущие пробы дали положительный результат. Крайне желательно, чтобы результаты микроскопии мокроты направлялись лечащему врачу в течение одного рабочего дня с момента отправки проб. Не меньшее значение имеет также и время сбора проб. Результаты исследований показывают, что эффективность лабораторных анализов максимальна, если пробы мокроты получены утром, после пробуждения от ночного сна. Возможно, совершенно необязательно собирать только утренние пробы, но, про крайней мере, одна из них должна быть получена утром.

Как правило, внелегочные очаги туберкулезного процесса содержат гораздо меньшее количество M. tuberculosis, поэтому микроскопическое выявление кислотоустойчивых микобактерий в пробах из внелегочных очагов весьма затруднено, и в таких случаях результаты культуральных исследований приобретают большое значение. Учитывая низкую результативность микроскопии, при внелегочном туберкулезе культуральные и морфологические исследования приобретают особое значение, например, в диагностическом исследовании проб ткани лимфатических узлов, полученных при помощи игловой биопсии.

Лечение пациентов, у которых наблюдаются тяжелое или быстро развивающееся заболевания, ассоциированные с туберкулезом, необходимо начинать немедленно, даже до лабораторного подтверждения диагноза. Лечение следует начинать до получения результатов лабораторного исследования и лишь позднее внести необходимые поправки и изменения в схему лечения с учетом результатов микроскопии.

Хотя микроскопия мокроты является наиболее доступным бактериологическим тестом, там, где ресурсы позволяют и имеются условия для качественной лабораторной диагностики, в диагностический алгоритм необходимо включать культуральные исследования мокроты, в случаях отрицательных результатов микроскопии. Правильное проведение культуральных исследований связано с определенными трудностями и дополнительными затратами, но этот метод отличается более высокой чувствительностью и повышает вероятность раннего выявления больных туберкулезом.

Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену является важнейшим элементом диагностики туберкулеза. Исследование 3 мазков мокроты позволяет выявить более 60% случаев туберкулеза легких и 95% наиболее заразных случаев (исследование одного мазка мокроты выявляет 75% наиболее заразных случаев, исследование второго мазка мокроты добавляет еще 20%, а исследование третьего - еще 5%).

Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену позволяет быстро получить результаты, выявить основные источники инфекции, является менее дорогостоящей, чем посев мокроты и широко доступна для применения. Но она должна быть надежной и хорошо контролироваться. Вероятность обнаружения МБТ при бактериоскопии мазков мокроты прямо пропорциональна концентрации возбудителя в исследуемом материале. Например, когда в 1 мл мокроты содержится от 1000 до 10000 МБТ, то вероятность получения положительного результата составляет около 40-50%. При концентрации МБТ менее 1000 в 1 мл мокроты вероятность их обнаружения резко снижается – отрицательные результаты получаются примерно в 96% случаев.

Основным и наиболее часто изучаемым биоматериалом в пульмонологической практике является мокрота. Требования к забору и качеству мокроты следующие:
1) первую пробу мокроты желательно получить до начала курса антибиотикотерапии;
2) мокроту оптимально собирать утром, до приема пищи, после тщательного туалета полости рта (полоскание кипяченой водой);
3) больным нужно доступно объяснить, что требуется получить именно содержимое нижних отделов дыхательных путей, а не ротоглотки, и, по возможности, проконтролировать их действия;
4) забор материала проводить в стерильные интактные контейнеры;
5) продолжительность хранения мокроты в контейнерах не должна превышать 2 ч (в летнее время желательно не более 1 ч);
6) в условиях лаборатории качество мокроты оценивается после окрашивания мазка по Граму (при наличии в мазке менее 25 лейкоцитов и более 10 эпителиальных клеток, при просмотре не менее 8-10 полей зрения при малом увеличении, мокрота признается некачественной, дальнейшее ее исследование нецелесообразно, так как, скорее всего, материал получен из ротовой полости);
7) высокая диагностическая ценность исследования признается при выделении возбудителя в концентрации і106 КОЕ/мл.

Вообще, в диагностике заболеваний туберкулезом можно выделить несколько этапов:

· Преаналитический этап (предварительный диагноз, выбор материала и метода исследования, забор биомтериала и его транспортировка)

· Аналитический этап (непосредственно проведение анализа)

· Постаналитический этап (оценка результатов)

Часть этих этапов проводится вне лаборатории, поэтому очень важна согласованная и качественная работа всех специалистов, привлеченных в этот процесс. Важен правильный выбор исследуемого материала. Важным этапом диагностики являются процедуры взятия и доставки материала в лабораторию.При взятии всех видов исследуемого материала следует ориентироваться на стандартные системы для этой цели: тампоны, цитощетки, тубсеры, контейнеры и т.п. Эффективность аналитического этапа во многом определяется уровнем технического оснащения лабораторий. Постаналитический этап исследования включает две составляющие: проверку достоверности полученного результата и оценку этиологической значимости выделенных штаммов. В лаборатории должен осуществляться строгий внутренний контроль качества исследований, важной составляющей которого является проверка полученных результатов на достоверность. Оценка этиологической значимости выделенных микроорганизмов принципиальна для выбора адекватной терапии. Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и обезжиренные в спирте или смеси для обезжиривания предметных стекол (производство АБРИС+) стекла без царапин и сколов. При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов. Не рекомендуется использовать саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям исследуемого изображения. Стекла должны соответствовать ГОСТу. Стекла, на которых при микроскопическом исследовании были обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, сохраняются в лаборатории в течение 1 года, а затем подлежат обязательному уничтожению и не должны использоваться повторно. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем промывают в проточной воде и протирают насухо.

В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов. Они относятся к роду Mycobacterium(возбудители туберкулеза, паратуберкулеза крупного рогатого скота, проказы человека). Химическая структура цитоплазмы и клеточной оболочки микроорганизмов данной группы отличается содержанием значительного количества жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40%), поэтому проникновение красителя в клетку затруднено. Для их окраски используют протравливание (нагревание мазка с красителем над пламенем). Окрасившись, они прочно удерживают краску и не обесцвечиваются кратковременным действием кислоты.

Окраска по Циль-Нильсену.

1. Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2—3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и обмывают мазок водой.

2. Обесцвечивают препарат 5—10% водным раствором серной кислоты в тече­ние 3—5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты.

Мазок тщательно промывают водой.

5. Снова промывают водой.

6. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором 1: 1000 малахитовой зе­лени или метиловой зелени.

7. Краску смывают водой и препарат высу­шивают.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки - рубиново красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото - и спиртоустойчивых сапрофитов, - синие. Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты 3 мл+96° спирта 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой и т. д. по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото - и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото - и спиртоустойчивы.

Занятие 4. Окраска спорообразующих и капсулообразующих бактерий. Определение подвижности микроорганизмов.

Цель занятия.Усвоить методы окраски спорообразующих, капсулообразующих бактерий, а также определение подвижности бактерий.

Материалы и оборудование. Взвеси бактерий с вакцинным штаммом сибирской язвы, клостридиями, готовые препараты с капсулообразующими бактериями, подвижные бульонные культуры эшерихий 18 часового роста, предметные и покровные стекла, плакаты, 2% раствор сафранина, водный раствор малахитовой зелени, карболовый фуксин Циля.

Окраска спор. При неблагоприятных условиях для микробов (отсутствие питательной среды, высушивание, неблагоприятная температура и др.) в цитоплазме некоторых микроорганизмов образуются споры. Формируются они внутри вегетативной клетки, являясь эндоспорами. Палочковидные грамположительные микроорганизмы, образующие округлые споры, диаметр которых не превышает ширину микробной клетки, относятся к родуBacillusи называются бациллами. Микроорганизмы родаClostridiumимеют споры диаметр которых превышает ширину микробной клетки и называются клостридиями. По форме они бывают овальные и круглые (рис. 5).

Споры устойчивы к воздействию высоких температур, химических веществ, к высыханию, длительно сохраняются в почве, что объясняется их особым строением и химическим составом, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки к действию красителей.

Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву. После охлаждения оболочка вновь становится плотной и не пропускает дополнительный краситель.

Техника окраски спор методом Трухильо. На фиксированный мазок накладывают небольшой кусочек фильтровальной бумаги и на нее наносят водный раствор малахитовой зелени.

Рис. 5. Споры микроорганизмов различных типов

Подогревают препарат на пламени горелки до появления паров и выдерживают в течение 3 минут, промывают водой и докрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина 1 минуту. Промывают водой и высушивают. Микрокартина: споры зеленые, а вегетативные клетки красные.

Окраска капсул. Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой. Капсула - муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, является производным наружного слоя оболочки. Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) (рис. 6). Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:

а) мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется;

б) фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метохромотические краски, то есть при использовании, которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула - в другой;

в) промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.

Техника окраска капсул по методу Ольта. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут. Быстро промывают водой и высушивают. Тело клетки окрашивается в краснокирпичный цвет, капсула в - желто-оранжевый. Определение подвижности бактерий.

Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков- специальных тонких нитевидных образований.

Рис.6.Капсула у бактерий а ‑ бацилла сибирской язвы; б - диплококк

Жгутики бывают различной длины.

Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют (рис. 7):

а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас);

Рис. 7. Типы расположения жгутиков у бактерий

б) лофотрихи- микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии);

в) амфитрихи- микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки;

г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E.coli).

Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.

Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться.

Метод посева уколом в полужидкий агар. Для этого бактериологической петлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная - только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.

ЗАНЯТИЕ 5. Лабораторная посуда и её подготовка. Питательные среды. Методы приготовления и стерилизации питательных сред. Методы стерилизации лабораторной посуды.

Цель занятия. Подготовить посуду. Приготовить питательные среды. Определить рН сред. Ознакомиться с методами стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.

Оборудование и материалы.Штативы, пробирки, микробиологические петли, пипетки, чашки Петри, бумага. Автоклав, сушильный шкаф. Набор сред и химических реактивов. рН -метр.

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения - возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Рисунок 1

Микобактерии туберкулеза
а - метод окраски по Цилю-Нельсену
б - метод люминисцентной микроскопии
в - клетки Лангхаса
г - эпителиоидные клетки

Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это "золотой стандарт" бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, "Новая", Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 - 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования - от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.

Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 - 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 - 14 суток.

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, "погашенный" высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и "вручную", тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой - посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей.

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.