Метод биочипов в диагностике туберкулеза

Автор - Рано Кравченко

Два месяца назад в России было создано первое коммерческое предприятие по производству биочипов. Уникальные технологии позволяют, среди прочего, за считанные часы проанализировать генетические мутации и, тем самым, определить предрасположенность к раковым заболеваниям. В течение дня можно провести диагностику туберкулеза, тогда как другие методы требуют нескольких недель или даже месяцев. Примечательно, что в основе этих разработок лежат исследования отечественных ученых, отстоявших во время экономического кризиса 90-х годов права России на оригинальные идеи, контроль над которыми хотели получить компании США.

В отличие от этого вида чипов, разработки российского Института молекулярной биологии (ИМБ) являются инструментами химического многопараметрического анализа и дают информацию сразу о нескольких характеристиках образца. Так, например, при помощи одной пластинки размером с почтовую марку можно получить данные о нескольких тысячах генов или о группе свойств возбудителя. Другой отличительной особенностью отечественных технологий является возможность работы с уже взятыми образцами, поэтому вводить биочипы в организм не обязательно.

С помощью биочипов российского производства один специалист может провести исследование 1000 образцов в день. Анализ каждого из них занимает 15 секунд, плюс 2-3 минуты на то, чтобы зафиксировать результаты. Предварительная работа продолжается 12 часов, однако этот фактор не является серьезным ограничением, поскольку готовиться для анализа могут сотни образцов одновременно.

В середине 90-х годов, когда в России наступил экономический кризис и науку почти перестали финансировать, академика Мирзабекова пригласили в Аргоннскую национальную лабораторию (Чикаго, США). В ответ на предложение он заявил, что будет работать там только при условии создания совместной исследовательской группы, включающей американских специалистов, а также российских сотрудников из его лаборатории в ИМБ, насчитывающей в то время 30 человек. Сначала американцы не соглашались, но в конце концов приняли поставленное условие. В течение 5-6 лет, когда исследования в области биочипов проводились совместно, финансирование этой группы обошлось в несколько миллионов долларов. Проект контролировал Департамент энергетики США, в свое время курировавший разработку атомной бомбы.

Базовый патент на биочипы, объединяющий в одном пакете несколько технологий, разработанных в Аргоннской лаборатории, принадлежал России. Однако право использовать данный патент купили Motorola и НР. По соглашению с руководством Аргоннской национальной лаборатории, 50% доходов от патентов поступало ей, 50% - в Московский институт молекулярной биологии.

Компаниям, выкупившим технологию у ученых, не нравилось, что выплаты за пользование патентом увеличивались в геометрической прогрессии. Если до коммерческого запуска проекта они платили только за использование технологии, то впоследствии прибавились еще и выплаты процентов от доходов. После этого Motorola и НР зарегистрировали свой патент на модифицированную технологию. Специалисты из ИМБ хотели подать в суд, но, возможно, в силу особенностей менталитета разбирательства не состоялось. Вместо этого группой академика Мирзабекова была разработана и запатентована более совершенная технология биочипов.

В настоящее Институтом молекулярной биологии (ИМБ) им. Энгельгардта основана компания "Биочип-ИМБ" (Biochip-IMB), руководителем которой стал Виктор Барский.

Сообщения о том, что туберкулез – колоссальная проблема России, в последние годы звучат все чаще. Число страдающих этой болезнью в нашей стране постоянно увеличивается. Диагностика обычными методами длится 10 недель, в течение которых пациент занимает койко-место в больнице и, возможно, заражает окружающих. Самый эффективный западный метод диагностики туберкулеза позволяет поставить точный диагноз через две недели после взятия проб. Метод с использованием российских биочипов позволяет сделать это за один день.

Биочип для диагностики туберкулеза недавно был сертифицирован Министерством здравоохранения и социального развития России. После этого компания получила от министерства заказ по оснащению оборудованием и технологиями восьми центров по борьбе с туберкулезом. Сумма контракта составила 6 млн. рублей. Руководят данным проектом академик РАН Виталий Литвинов и директор ИМБ, член-корр. РАН Александр Макаров. До сертификации биочипы могли использоваться в России только для научных исследований, их применяли в 10 научно-исследовательских учреждениях, в том числе в Центре по борьбе с туберкулезом и в Институте туберкулеза.

Зато в области диагностики гриппа и определения его штаммов у отечественного рынка широкие перспективы. Российские ученые уже получили грант американского центра по контролю заболеваний (CDC) для совместной работы по выявлению штаммов вирусов гриппа. Однако коммерческое производство таких чипов в ближайшее время также не планируется.

Производство зонда включает в себя от 10 до 12 процессов, большинство из которых можно осуществлять в автоматическом режиме. В 80-х годах зонды наносили вручную - тогда плотность биочипа составляла всего 2 ячейки. В начале 90-х годов зонды стали производить полуавтоматически, а сейчас технология производства полностью автоматизирована.

Мировой рынок биочипов, включая чипы для анализа ДНК и белков, достигнет в 2005 году $950 млн., считают авторы доклада из BioInsights (теперь BioPerspectives). По их мнению, новые продукты и новые игроки в текущем году расширят рынок на 33%. Анализ генов с объемом продаж $434 млн. останется в 2005 году ведущей областью применения технологии.

По данным Freedonia, рынок биочипов, сопутствующих услуг и оборудования только в США будет расти ежегодно на 20%, достигнув $2,1 млрд. в 2008 г. Из них $875 млн. будет приходиться собственно на биочипы, а $1,2 млрд. – на инструменты, реагенты, программные средства и услуги. По мнению аналитиков компании, рост рынка (особенно в секторе исследования генов и белков), приведет к открытию новых лекарств и к успехам в борьбе с опасными болезнями. Прогнозируется также смещение в сторону производства чипов для синтеза новых белков.

Основная задача современной персонифицированной медицины — выявлять риски возникновения заболевания у конкретного человека. Это поможет предупреждать болезни заранее и назначать адекватное лечение. Можно детально исследовать весь организм человека, чтобы понять, что именно в нем поражено, однако это дорогостоящий процесс, который занимает много времени. Именно поэтому учеными были разработаны биочипы, которые выявляют в одном анализе сотни и тысячи биомаркеров — соединений, свидетельствующих о наличии какого-либо расстройства или подверженности заболеванию.

Идея разработки биочипов появилась в конце 1980-х годов и принадлежала нескольким группам ученых, в том числе из СССР, Югославии и Великобритании. В Советском Союзе директор Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской академии наук академик Андрей Дарьевич Мирзабеков предложил идею биочипов как альтернативу сложному на тот момент методу расшифровки последовательностей ДНК. Мирзабеков постулировал возможность размещения коротких фрагментов ДНК — зондов на плоской поверхности микроматриц в трехмерных полусферических ячейках гидрогеля. Ячейки с зондами размещались на подложках в строго упорядоченном виде. Поскольку локализация зондов в ячейках известна заранее, взаимодействие зондов с анализируемыми молекулами ДНК позволяло установить структуру протяженных участков ДНК. Таким образом, была впервые в мире предложена и обоснована теория секвенирования на ДНК-биочипах.

Биологический микрочип — это матрица ячеек, каждая из которых содержит специфичный зонд (молекула ДНК, белок, гликан, низкомолекулярный лиганд и так далее), распознающий свою мишень в анализируемом образце, например в капле крови. Предварительно обработанные и помеченные флуоресцентным красителем молекулы анализируемого образца, введенного в камеру биочипа, способны проникать внутрь ячеек и взаимодействовать со специфичными зондами. При облучении светом определенной длины волны поверхности биочипа ячейки, в которых произошло специфичное взаимодействие, флуоресцируют. Эту флуоресценцию можно зарегистрировать с помощью специального анализатора-микроскопа. Затем рассчитать интенсивность сигналов в каждой ячейке и, зная алгоритм обработки сигналов, установить наличие в исследуемом образце специфичной мишени — микроорганизма, вируса, мутации, хромосомной перестройки, онкомаркера, аллергена и так далее. Этот процесс позволяет оперативно выбирать адекватную стратегию лечения пациента.

Матрица ячеек биочипа изготавливается посредством переноса капель смеси зондов и гидрогеля объемом 0,1 нанолитра из колодцев микропланшета на пластиковую подложку. Это делается с помощью сверхтонких металлических стержней механического робота. Такие капли могут перемещаться и сливаться на гидрофобной поверхности подложки, поэтому их очень важно зафиксировать через реакцию фотополимеризации с образованием ковалентных связей как между каплей и подложкой с активными группами подложки, так и между молекулами зонда и мономерами гидрогеля. Для этого подложки облучают светом с определенной длиной волны при строгих условиях: температура, влажность, время облучения, наличие инертного газа, вытесняющего молекулы кислорода. Таким образом, под действием ультрафиолетового излучения происходит совместная полимеризация молекулярных зондов (фрагментов ДНК, белков и так далее) с основными компонентами гидрогеля. В ходе реакции молекулярные зонды ковалентно присоединяются к растущим полимерным цепям и равномерно распределяются по всему объему геля, тем самым происходит иммобилизация зондов.

Матрицу ячеек биочипов формируют на стекле, покрытом мономолекулярным слоем вещества, содержащего активные химические группы, взаимодействующие с наносимыми зондами. Технология гидрогелевых биочипов ИМБ РАН использует подложки из пластика, что существенно упрощает и удешевляет изготовление матриц. Российскими инженерами созданы пресс-формы для производства подложек и реакционных камер биочипа методом литья под давлением, что обеспечивает нашу технологическую независимость в данной области.

История биочипов начиналась с анализа последовательностей ДНК. Одновременно проводимые в каждой ячейке реакции взаимодействия анализируемых молекул ДНК с иммобилизованными ДНК-зондами обеспечивают параллельную идентификацию множества геномных мишеней. Это позволяет использовать ДНК-биочипы в качестве эффективного молекулярного инструмента выявления клинически значимых маркеров возбудителей и причин социально значимых заболеваний, мониторинга пищевых продуктов, растительного сырья, возможных агро- и природных биоценозов.

Такой тест необходим для исследований в области протеомики, для диагностики всех типов заболеваний, которые характеризуются изменением большого числа показателей в сыворотке крови пациента. Персонифицированная медицина подразумевает всестороннее обследование пациента, то есть анализ его биологических жидкостей по максимальному спектру параметров.

С момента первой публикации по теории взаимодействия молекул ДНК с зондами, закрепленными на подложке биочипа, прошло 30 лет. За этот период сотрудниками лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН была выстроена универсальная методология анализа белковых и ДНК-маркеров на биочипах. Была создана и сертифицирована по международному стандарту ISO 13485 производственная линия по изготовлению гидрогелевых биочипов мощностью до 1 миллиона в год.

Разработанные диагностические тест-системы на основе биочипов охватывают широкий спектр приложений — от идентификации маркеров лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов, выявления мишеней в геноме человека, ассоциированных с риском и развитием злокачественных опухолей и эффективностью терапии, до мультиплексного иммуноанализа белковых маркеров в сыворотке крови пациента.

Такие биочипы для анализа лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза с 2005 года применяются более чем в 30 учреждениях противотуберкулезной службы РФ и стран СНГ, бактериологических лабораториях Федеральной службы исполнения наказаний. За этот период выполнено свыше 500 тысяч анализов и доказана диагностическая, экономическая и клиническая эффективность биочипов, позволившая по меньшей мере в 3 раза повысить число излеченных больных с лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза.

Еще одна разработка — уникальный способ выявления разновидностей вируса гепатита С — была создана в совместных исследованиях с Лабораторией вирусологии Госпиталя Университета города Тулузы (Франция). Биочип позволяет выбирать режим противовирусной терапии препаратами прямого действия в зависимости от установленной разновидности вируса.

Также учеными ИМБ РАН был создан биочип для анализа генетических маркеров антибиотикорезистентности микроорганизмов — возбудителей инфекций органов репродукции человека. Этот биочип с 2016 года является эффективным инструментом мониторинга лекарственной устойчивости возбудителя гонококковой инфекции. Его применение позволило впервые описать молекулярную эволюцию лекарственной устойчивости современной популяции гонококка в России и зафиксировать уровень резистентности на рекордно низком уровне, в отличие от стран ЕС и США.

Важным направлением приложения технологии гидрогелевых биочипов явился анализ мутаций и полиморфизмов ДНК человека, ассоциированных с различными заболеваниями, для определения стратегии лечения и выбора терапии.

Разрабатываются варианты тест-систем на основе биочипов для определения чувствительности злокачественных клеток к противоопухолевой терапии. Для индивидуального подбора препаратов, действующих на молекулярные мишени в опухолевых клетках меланомы, создан биочип, позволяющий определять в генах BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11, MAP2K1 и MAP2K2 мутации, при которых показано (или, наоборот, бесполезно) применение таких препаратов таргетной терапии, как траметиниб (ингибитор протеинкиназ MEK½ или MAP2K½), иматиниб (ингибитор белка KIT) и вемурафениб (ингибитор протеинкиназы BRAF). Такой подход позволяет эффективно выявлять клинически значимые соматические мутации и сделать выбор в пользу определенного таргетного препарата у 70% больных меланомой.

Было проведено эпидемиологическое исследование, включавшее 800 пациентов ДГКБ имени Филатова в возрасте от 0 до 16 лет и 50 здоровых доноров как модельной популяции детей средней полосы России, на предмет оценки частот встречаемости различных причин аллергии в зависимости от возраста. Было обнаружено, что среди вдыхаемых аллергенов наиболее часто вызывают сенсибилизацию пыльца березы и эпителий кошки, в то время как среди пищевых аллергенов sIgE-ответ чаще всего вызван аллергенами яйца и молока. Продукцию sIgG4 в основном вызывают пищевые аллергены, в особенности яичный белок. С возрастом доля пациентов с повышенным уровнем sIgE к ингаляционным аллергенам увеличивается, в то время как для большинства пищевых аллергенов характерно снижение доли сенсибилизированных пациентов, за исключением аллергенов моркови, яблока и персика.

Проведение мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах позволяет охватить практически все области медицинской диагностики. Перспективным направлением развития белковых биочипов видится исследование маркеров воспалительных реакций для дифференциальной диагностики ревматологических, эндокринных заболеваний и других нарушений в работе иммунной системы.

Из-за стремительного развития технологий полимеразной цепной реакции и платформ секвенирования следующего поколения ДНК-биочипы столкнулись с серьезной конкуренцией. Сегодня они занимают промежуточную нишу в области методик анализа нуклеиновых кислот, подпираемую разнообразными тестами на основе полимеразной цепной реакции, и испытывают все большее давление со стороны высокопроизводительных технологий секвенирования. В случае технологии ИМБ РАН иммобилизация любых типов биомолекул в гидрогеле и возможность проведения в нем разнообразных биохимических реакций открывает перспективы в создании биосенсоров нового поколения. Гидрогелевые элементы станут платформой для иммобилизации ферментов — геномных редакторов — нуклеаз совместно с направляющими и детектирующими молекулами ДНК или РНК. Это позволит создать высокочувствительные биосенсоры, применение которых будет возможно в полевых условиях. Такие комплексные автономные системы на платформе гидрогелевых биочипов позволят получать результаты быстрее, информативнее и точнее, чем сейчас, и будут играть ключевую роль в персонализированной медицине будущего.

Открытие функционального значения тысяч генов и молекулярных механизмов действия множества ферментов стало революционным событием в биологии, оказавшим и продолжающим оказывать огромное влияние на развитие медицины XXI в. Перед учеными и медиками открылись уникальные возможности для выяснения причин многих инфекционных и наследственных заболеваний, а также разработки эффективных методов их лечения. В свою очередь, развитие новых диагностических методов потребовало и создания новых технологий многопараметрического анализа биологических образцов, с помощью которых можно одновременно исследовать множество белковых и ДНК-маркеров различных заболеваний, функционально-значимых биологических макромолекул и их комплексов. Так появилась технология биологических микрочипов, способных, подобно микрочипам электронным, извлекать и обрабатывать огромные массивы информации из одного небольшого образца биологического материала, полученного от конкретного пациента.

Дмитрий Александрович Грядунов — кандидат биологических наук, заместитель директора по научной работе и заведующий лабораторией технологий молекулярной диагностики Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (Москва). Лауреат Государственной премии РФ для молодых ученых (2003), российской Премии Галена (2014). Автор и соавтор 60 научных работ и 27 патентов.

Александр Сергеевич Заседателев — доктор физико-математических наук, профессор, заведующий лабораторией биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (Москва), заведующий кафедрой молекулярной и клеточной биологии Московского физико-технического института. Лауреат российской Премии Галена (2014), кавалер ордена Академических Пальм Франции (2016). Автор и соавтор 190 научных работ и 37 патентов.

За последние десятилетия был накоплен огромный объем знаний о молекулярных основах биохимических процессов в живых организмах. Это дало возможности не только точно диагностировать то или иное заболевание, но и оценить вероятность его возникновения еще до проявления у пациента клинических симптомов, а также подобрать эффективную терапию. Подавляющую часть такой информации получают с помощью лабораторной диагностики, на которую в мире ежегодно расходуется свыше 100 млрд долларов. В России в 1970 г. она насчитывала 81 биохимический / молекулярный тест, в 2000 г. — 170, а сегодня число тестов измеряется тысячами!

Сегодня ведущие научные журналы регулярно публикуют обзоры, посвященные биологическим микрочипам, которые производят многие десятки компаний, а объем продаж составляет сотни миллионов долларов в год. Вместе с тем сама идея создания биочипов родилась лишь четверть века назад, и одним из мест рождения этой технологии стал Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

С самого начала подход российских исследователей отличался удачным выбором ключевых технологических решений, благодаря которым технологии биочипов ИМБ РАН продолжают оставаться конкурентоспособными в мировой науке. Многие из этих подходов (например, замена радиоактивных меток на флуоресцентные, применение гидрогеля и элементов сферической формы) стали использовать в своей работе другие исследователи, занимающиеся разработкой биочипов. А с 2000 г. в ИМБ РАН при поддержке Международного научно-технического центра начались работы по созданию биочипов для медицинской диагностики возбудителей социально значимых заболеваний.

Биочипы в деле

В биочипе ячейки с иммобилизованными зондами располагаются упорядоченными рядами, причем каждая ячейка содержит уникальный зонд. В зависимости от типа биочипа диаметр ячеек варьирует от 50 до 300 мкм, а их число зависит от сложности анализируемой мишени(ей) и задач эксперимента и составляет от нескольких десятков до нескольких тысяч. Молекулы исследуемого образца помечают флуоресцентой меткой, поэтому при облучении светом определенной длины волны ячейки, где произошло связывание зондов с молекулами-мишенями, будут светиться (две крайние ячейки)

Для регистрации результатов анализа используют флуоресцентные метки, которые вводят в молекулы образца. Если зонд специфично распознает и свяжется с мишенью, в ячейке возникает флуоресценция. Интенсивность свечения ячеек биочипа измеряется с помощью специальных аппаратно-программных комплексов-анализаторов, которые и выдают отчет о присутствии в исследуемом образце специфичных молекулярных мишеней, информирующих о наличии микроорганизмов или генных мутаций, онкомаркеров или аллергенов и т. п.

Анализатор биочипов состоит из оптико-электронного блока, системы лазеров для возбуждения флуоресценции и оптической части, совмещенной с CCD-камерой, которая передает изображение чипа на компьютер, где сигналы в каждой ячейке вычисляются и анализируются по определенному алгоритму. Для получения матрицы биочипа растворы молекул зондов смешивают с гелеобразующими добавками. Капли смеси наносят на поверхность полимерной подложки будущего чипа с помощью робота и облучают ультрафиолетовым светом, под действием которого идет полимеризация. В ходе реакции молекулярные зонды присоединяются к растущим полимерным цепям геля и в итоге равномерно распределяются по всему объему ячейки

Оригинальная технология создания таких гелевых чипов, разработанная в ИМБ РАН, была запатентована и сертифицирована по европейским стандартам. Биочипы, созданные по этой технологии, занимают отдельную нишу диагностических микроматриц и применяются в российских клиниках. Коммерческие микроматрицы, произведенные ведущими научно-производственными корпорациями Германии и США применяются, в основном, в исследовательских целях.

Большие матрицы с ДНК и белками, иммобилизованными на фильтре или зафиксированными в лунках планшета, были известны достаточно давно. Но идея о создании микрочипов современного формата появилась лишь в конце прошлого века. Первая работа по ДНК-микрочипам и одна из первых — по белковым чипам были опубликованы группой академика А. Д. Мирзабекова из московского Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР (Khrapko et al., 1989; Arenkov et al., 2000).

Эта революционная идея родилась как предложение для нового метода секвенирования ДНК с использованием гибридизации — процесса объединения двух комплементарных одноцепочечных молекул ДНК в двуцепочечную. Работы по совершенствованию методик секвенирования были стимулированы все более возраставшим интересом к проблеме расшифровки генома человека.

Выдающийся молекулярный биолог, академик А. Д. Мирзабеков в лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН (Москва)

Технология производства гелевых биочипов прошла несколько этапов развития. Технология первого поколения, еще достаточно громоздкая и несовершенная, была разработана и запатентована в ИМБ в 1989–1993 гг., а впоследствии реализована в совместной лаборатории, организованной институтом и Аргоннской национальной лабораторией (США), и лицензирована американскими компаниями Motorola и Packard Instruments. Однако из-за технологических проблем фирмы стали производить биочипы, матрица которых представляла собой поверхность, сплошь покрытую полиакриламидным гелем.

В ИМБ РАН технология гелевых биочипов продолжала развиваться. Современная, достаточно простая, универсальная и дешевая технология позволяет производить даже в лабораторных условиях сотни и тысячи олигонуклеотидных, ДНКовых или белковых микрочипов в день (Колчинский и др., 2004).

Туберкулез и лекарственная устойчивость

Почему внимание исследователей привлек именно туберкулез? Дело в том, что многие десятилетия для борьбы с этой болезнью использовали комбинированное лечение сразу несколькими химиопрепаратами, чтобы повысить его эффективность. При монотерапии больные быстро приобретали устойчивость к лекарству. Однако такая стратегия привела к тому, что уже в конце прошлого века в мире, в том числе и в России, начал повсеместно распространяться туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью. Именно этот фактор в наши дни чаще всего является причиной неудачного исхода лечения и возникновения рецидива болезни, от которой ежегодно в мире умирает более 3 млн человек.

От гепатита до рака и аллергий

Еще одной актуальной проблемой мирового здравоохранения является лечение больных гепатитом С. Возбудитель этого вирусного заболевания может долгое время размножаться в печени, ничем не выдавая себя, а первые признаки болезни обнаруживаются лишь спустя пару месяцев после заражения. Еще недавно гепатит С считался практически неизлечимой болезнью, а основным терапевтическим средством служила комбинация из интерферона и рибавирина, которая зачастую оказывалась неэффективной и имела много негативных побочных эффектов.

Сегодня созданы новые антивирусные препараты, обладающие так называемым прямым противовирусным действием и блокирующие ключевые внутриклеточные этапы размножения возбудителя. Но вся сложность в том, что вирус гепатита С имеет 7 вариантов генотипа, при этом каждый генотип имеет еще несколько подтипов. Более того, разные генотипы / подтипы обладают и разной чувствительностью к традиционным и новым препаратам, и выбор противовирусной терапии должен проводиться в соответствии с генотипическими особенностями возбудителя.

Важнейшим направлением приложения технологии гидрогелевых биочипов служит анализ мутаций и полиморфизмов ДНК самого человека: ДНК-маркеров, ассоциированных с возникновением различных неинфекционных заболеваний.

Важно, что для анализа антител на 30 и более аллергенов на биочипе требуется очень небольшой (всего 60 мкл) объем сыворотки крови — ровно столько, сколько требуется для анализа на один аллерген традиционным иммуноферментным методом! Такое отличие особенно значимо в педиатрии. Лабораторный вариант этой тест-системы уже проходит доклинические испытания в Детской городской клинической больнице № 13 им. Н. Ф. Филатова (Москва).

Примеры изображений флуоресцентных картин и соответствующие профили концентраций, полученные при анализе образцов сывороток крови двух пациентов

Двенадцать специализированных тест-систем, созданных на основе технологии гидрогелевых биочипов в ИМБ РАН, получили разрешение к применению как медицинские изделия для лабораторной диагностики. Эти тест-системы успешно используются более чем в 50 научно-исследовательских и медицинских центрах РФ, стран СНГ и ЕС.

Технологии биочипов, разработанные в ИМБ РАН, защищены 42 отечественными и международными патентами. И эти технологии продолжают интенсивно развиваться. Разрабатываются новые подходы, позволяющие упростить и ускорить методики, интегрировать в единую процедуру все стадии проведения анализа: от обработки биологического образца до количественной идентификации в режиме реального времени.

Литература
1. Грядунов Д. А., Зименков Д. В., Михайлович В. М. и др. Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике // Медицинский алфавит. 2009. № 3. С. 10–14.
2. Заседателев А. С. Биологические микрочипы для медицинской диагностики // Наука и технологии в промышленности. 2005. № 1. С. 18–19.
3. Колчинский А. М., Грядунов Д. А., Лысов Ю. П. и др. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекулярная биология. 2004. Е. 38. № 1. С. 5–16.
4. Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., et al. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions // Analytical Biochemistry. 2000. V. 278. N. 2. P. 123–131.
5. Emelyanova M., Ghukasyan L., Abramov I. et al. Detection of BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11 and MAP2K1/2 mutations in Russian melanoma patients using LNA PCR clamp and biochip analysis // Oncotarget. 2017. V. 32. N. 8. P. 52304–52320.
6. Feyzkhanova G., Voloshin S., Smoldovskaya O. et al. Development of a microarray-based method for allergen-specific IgE and IgG4 detection // Clinical proteomics. 2017. doi: 10.1186/s12014-016-9136-7.
7. Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V. et al. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia // Expert review of molecular diagnostics. 2011. N. 11. P. 839–853.
8. Khrapko K. R., Lysov Yu. P., Khorlyn A. A. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Letters. 1989. V. 256. N. 1-2. P. 118–122.
9. Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Antonova O. V., et al. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray // Journal of antimicrobial chemotherapy. 2016. V. 71. N. 6. P. 1520–1531.