Лабораторная диагностика туберкулеза микробиология

*Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Читайте в новом номере

ЦНИИ туберкулеза РАМН, Москва

В настоящее время лабораторная диагностика занимает ведущее место в выявлении многих инфекционных заболеваний. Подтверждение диагноза туберкулеза основывается на результатах микробиологических анализов при выделении из биологического материала возбудителя – микобактерий туберкулеза. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на выявление возбудителя, определение лекарственной чувствительности и типирование микобактерий.

Обнаружение возбудителя начинается с наиболее простых и быстрых бактериоскопических методов с использованием светового микроскопа с окраской по Циль–Нильсену и люминесцентного с окраской флюорохромами. Преимущество бактериоскопии – в быстроте получения результата. Однако возможности ее ограничены из–за низкой чувствительности. Этот метод является наиболее экономичным и рекомендован ВОЗ в качестве основного для выявления заразных больных (табл. 1).

При антибактериальной терапии обнаружение микобактерий туберкулеза имеет прогностическое значение. Поэтому бактериовыделение оценивается количественно. Золотым стандартом выявления микобактерий признаны культуральные исследования. Для посева патологического материала используют яичные среды: Левенштейна–Йенсена, среду Финна II, Мордовского и др. Количество микобактерий (или колоний в пробирке при культуральном методе исследования) в процессе химиотерапии является ориентировочным показателем ее эффективности или косвенным свидетельством развития устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Для повышения процента выделения микобактерий посевы патологического материала проводят на несколько сред, в том числе и на жидкие в автоматизированных системах учета роста типа BACTEC, что позволяет удовлетворить все культуральные потребности возбудителя. Посевы инкубируют до двух с половиной месяцев. При отсутствии роста к этому времени посев считается отрицательным. Наиболее чувствительным способом обнаружения микобактерий туберкулеза считается метод биологической пробы – заражение диагностическим материалом высокочувствительных к туберкулезу морских свинок.

Развитие молекулярной биологии позволило значительно повысить эффективность обнаружения микобактерий. Базовым методом молекулярно–генетических исследований является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле.

Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением. Однако при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

Интереснейшая область исследования, которая открывается благодаря ПЦР–диагностике, – изучение латентной инфекции M. tuberculosis. По современной концепции туберкулезной инфекции, из 100 человек, контактирующих с M. tuberculosis, 90 могут быть инфицированы, но только у 10 развивается активная болезнь. У остальных 90% инфекция будет оставаться латентной из–за противотуберкулезного иммунитета. Положительные ответы ПЦР при отрицательных результатах посевов патологического материала отмечаются у 55% лиц, подвергавшихся бытовым контактам с M. tuberculosis, и у 80% лиц, у которых туберкулез протекал без рентгенографических проявлений. Проведение ПЦР–исследований у пациентов из групп риска выявляло больных с отрицательными результатами микроскопии и посевов, но с субклинической инфекцией M. tuberculosis [11]. Подобные результаты были получены и в наших исследованиях [6].

Определение лекарственной устойчивости микобактерий

Для определения лекарственной устойчивости микобактерий используется несколько групп методов (табл. 2). По приказу № 558 МЗ РФ от 1978 г. в бактериологических лабораториях России используется метод абсолютных концентраций. В лаборатории ЦНИИТ РАМН внедрен ускоренный метод по тестированию нитратредуктазной активности микобактерий с помощью реактива Грисса.

В крупных противотуберкулезных центрах используются методы определения лекарственной устойчивости в жидких средах с автоматизированной радиометрической и флюоресцентной системой учета роста микобактерий типа ВАСТЕК, позволяющие сокращать срок анализа до 14 дней.

В последнее время разрабатываются новые методы оценки лекарственной устойчивости на уровне генотипа [10]. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, связанных с устойчивостью к различным препаратам: к изониазиду – гены katG, inhA, kasA, к рифампицину – rpoB, к стрептомицину – rpsL и 16SрРНК, к этамбутолу – emb1, к фторхинолонам – gyrA и т.д. [7].

Широкомасштабные исследования по изучению спектра мутаций в геноме устойчивых микобактерий показали, что наиболее распространенными были мутации в 531, 526 и 516 кодонах rpoB гена, устойчивость к изониазиду характеризовалась мутациями в 315 кодоне katG гена. В целом спектр мутаций не отличался от выявленных исследователями в разных регионах мира [2].

Доступность данных по молекулярной основе лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам дала возможность разработки новых, основанных на ПЦР, методов, представленных в табл. 2. Наши работы, проведенные совместно с Институтом физико–химической медицины МЗ РФ и Институтом молекулярной биологии РАН, продемонстрировали перспективность использования молекулярно–генетических методов для быстрого определения лекарственной устойчивости [1, 3, 4].

Наибольшие надежды по совершенствованию методов для определения лекарственной устойчивости микобактерий связаны с развитием микрочиповой технологии, позволяющей определять устойчивость одновременно к нескольким противотуберкулезным препаратам микобактерий непосредственно из диагностического материала в течение 2 дней [9].

Комплекс методов имеется и для типирования микобактерий, когда используются традиционные культуральные и биохимические методы, биологические, а также молекулярно–генетические (табл. 3). На основе молекулярно–генетического типирования микобактерий интенсивно развивается область молекулярно–эпидемиологических исследований, в которой по генотипу микобактерии выявляются очаги и прослеживаются пути распространения туберкулезной инфекции [5, 8].

#Pt6982.gif В заключение необходимо подчеркнуть, что в настоящее время имеется научный потенциал для совершенствования бактериологических исследований, а благодаря успехам молекулярной биологии существует возможность значительного сокращения сроков выявления микобактерий, определения лекарственной устойчивости и контроля за эффективностью химиотерапии.

1. Альтшуллер М.Л. и др. Применение аллель–специфической амплификации и SSCP для выявления устойчивости к рифампицину клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis. // БЭБиМ, 1999; 128(11): 555–8.

2. Генерозов Э.В. и др. Молекулярная характеристика полирезистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis из России. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2000; 1: 11–7.

3. Генерозов Э.В.и др. Детекция и характеристика мутаций в rроВ гене резистентных к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Проблемы туберкулеза, 1999; 2: 39–42.

4. В.М. Михайлович и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ–микрочипе для обнаружения рифампицин–резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis // БЭБ и М, 2001, 1: 112–7.

5. Черноусова Л.Н.и др. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в тюрьмах. // Актуальные проблемы пенитенциарной медицины. Мат–лы международной научно–практич. конференции, Минск, 2001: 48–50.

6. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Голышевская В.И. Роль ПЦР–анализа в комплексных бактериологических анализах во фтизиатрии. // Проблемы туберкулеза, 2001; 3: 58–60.

Лабораторная диагностика. Для диагностики туберкулеза применяют все методы: бактериоскопический, бактериологический, серологический, биологический, аллергические пробы, ПЦР. При бактериоскопическом исследовании исходного материала (мокрота, моча, гной, спинномозговая жидкость, испражнения) необходимо учитывать, что содержание в нем микобактерий может быть незначительным, выделение их эпизодическим и в нем могут быть измененные варианты возбудителя, в том числе L-формы. Поэтому для повышения вероятности обнаружения микобактерий туберкулеза используют методы концентрирования их с помощью центрифугирования или флотации, а также фазово-контрастной (для обнаружения L-форм) и люминесцентной микроскопии (в качестве флуорохромов используют аурамин, аурамин-родамин, акридиновый оранжевый и др.).

Биологический метод — заражение морских свинок — является одним из наиболее чувствительных. Считается, что заражающая доза возбудителя для них составляет несколько клеток. Морские свинки могут быть использованы и для обнаружения L-форм туберкулезных бактерий, но в этом случае необходимо сделать несколько последовательных заражений, так как L-формы обладают меньшей вирулентностью и вызывают у свинок доброкачественную форму туберкулеза, которая в случае реверсии L-форм в исходное состояние может перейти в генерализованный процесс.

Из числа серологических реакций для диагностики туберкулеза предложены РСК, РПГА, реакции преципитации, методы иммуноферментного анализа (в том числе точечного), радиоиммунный метод, иммуноблотинг, реакция агрегат-гемаг- глютинации (для обнаружения ЦИК) и др. Использование различных антигенов позволяет обнаруживать наличие определенных антител. Для совершенствования серологических методов диагностики туберкулеза важное значение имеет получение моноклональных антител к различным антигенам микобактерий. Это позволит выявить те специфические эпитопы туберкулезных бактерий и соответственно те антитела к ним, обнаружение которых имеет наибольшее диагностическое значение, а также позволит создать коммерческие тест-системы для иммунодиагностики туберкулеза.

Среди всех методов микробиологической диагностики туберкулеза решающим все же остается бактериологический. Он необходим не только для постановки диагноза болезни, но и для контроля эффективности химиотерапии, своевременной оценки чувствительности микобактерий к антибиотикам и химиопрепаратам, диагноза рецидивов туберкулеза, степени очищения больного организма от возбудителя и выявления его измененных вариантов, особенно L-форм. Исследуемый материал перед посевом необходимо обрабатывать слабым раствором серной кислоты (6— 12 %) для устранения сопутствующей микрофлоры. Выделение чистых культур микобактерий ведут с учетом скорости их роста, пигментообразования и синтеза ниа- цина. Дифференциацию между отдельными видами микобактерий осуществляют на основании их биологических свойств, как указано выше. Вопрос о вирулентности микобактерий решается с помощью биологических проб и на основании обнаружения корд-фактора. Для этой цели предложены цитохимические реакции. Они основаны на том, что вирулентные микобактерии (содержащие корд-фактор) прочно связывают красители — нейтральный красный или нильский голубой — и при добавлении щелочи сохраняют цвет краски, а раствор и невирулентные микобактерии изменяют свою окраску.

Для более быстрого выделения возбудителя туберкулеза предложен метод микрокультур. Суть его состоит в том, что на предметное стекло наносят исследуемый материал, обрабатывают его серной кислотой, отмывают, стекло помещают в цит- ратную лизированную кровь и инкубируют при температуре 37 "С. Уже через 3— 4 сут. рост микобактерий на стекле проявляется в виде микроколоний, которые к 7—10-му дню достигают максимального развития, а микобактерии хорошо выявляются при микроскопии. При этом вирулентные микобактерии образуют змеевидные колонии, а невирулентные растут в виде аморфных скоплений.

Для обнаружения L-форм используют культуральный, биологический и иммунофлуоресцентный методы. В связи с широким распространением лекарствен- ноустойчивых штаммов микобактерий возникла необходимость усилить контроль за этим процессом. С этой целью, а также для более точной идентификации и дифференциации микобактерий используют молекулярно-генетические методы, в частности, метод типирования штаммов, основанный на выявлении различий в структуре генома микобактерий — геномная дактилоскопия. Метод заключается в обнаружении в геноме микобактерии ряда повторяющихся нуклеотидных последовательностей и анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции. В качестве зонда (праймера) обычно используют IS6110 (англ. insertion sequence — вставочная последовательность). В хромосоме микобактерии, как правило, имеется несколько копий элемента IS6110, которые отличаются высокой стабильностью своего местоположения, что позволяет точно идентифицировать различные штаммы.

Биологический способ обнаружения L-форм заключается в серии последовательных пассажей на морских свинках.

Для иммунофлуоресцентного метода используют диагностические сыворотки, содержащие меченные флуорохромом антитела к антигенам L-форм.

9. Бактериологическая диагностика туберкулеза. Схема дифференцирования микобактерий в ходе их выделения. Специфическая профилактика туберкулёза. Вакцина БЦЖ, состав, способы применения. Химиотерапия туберкулеза.

По патогенным свойствам род Mycobacterium подразделяют на две группы:

1) патогенные и условно-патогенные (потенциально патогенные)

2) сапрофита. Для их ускоренной предварительной дифференциации учитывают прежде всего три признака: а) скорость и условия роста; б) способность к пигментообразованию; в) способность синтезировать никотиновую кислоту (ниацин).

По скорости роста род Mycobacterium подразделяют на три группы:

1) Быстрорастущие — крупные видимые колонии появляются ранее 7-го дня инкубации (18 видов).

2) Медленнорастущие — крупные видимые колонии появляются после 7-ми и более дней инкубации (20 видов).

3) Микобактерии, которые требуют специальных условий для роста или не растут на искусственных питательных средах. К этой группе относятся два вида: М. leprae и М. lepraemurium.

По способности к пигментообразованию микобактерии также делят на 3 группы:

1) Фотохромогенные — образуют пигмент лимонно-желтого цвета при росте на свету.

2) Скотохромогенные — образуют пигмент оранжево-желтого цвета при инкубировании в темноте.

3) Нефотохромогенные — пигмента не образуют (независимо от наличия света), иногда культуры имеют светло-желтоватую окраску.

К патогенным и потенциально патогенным относится 24 вида.

Профилактика. Помимо проведения широких социально-экономических мероприятий, направленных на улучшение жизни населения, раннего и своевременного выявления больных туберкулезом и оказания им эффективной лечебной помощи, большое значение имеет плановая массовая вакцинация против туберкулеза. Она осуществляется вакциной БЦЖ, полученной А. Кальметтом и Ш. Гереном из ослабленного многолетними пересевами штамма М. bovis. Вакцинации подлежат все новорожденные дети на 5—7-й день жизни. Вакцину, содержащую 0,05 мг сухих живых бактерий в объеме ОД мл, вводят внутрикожно. Ревакцинацию проводят в возрасте 7—12—17—22 и 27—30 лет только лицам, отрицательно реагирующим на внутри- кожную пробу Манту (5 ТЕ/0,1 мл).

Лечение. Консервативное лечение туберкулеза проводят с помощью антибиотиков и химиопрепаратов. Препараты I ряда (более ранние) включают производные парааминосалициловой кислоты (ПАСК), гидразида изоникотиновой кислоты (ГИНК) — изотиазид (тубазид), фтивазид и др. и препараты группы стрептомицина. Препараты II ряда — циклосерин, канамицин, флоримицин, рифампицин и другие антибиотики. У микобактерий к химиопрепаратам, в особенности I ряда, часто наблюдается устойчивость, поэтому лечение должно сопровождаться контролем степени чувствительности их к применяемым препаратам.

Консультант по гематологии,

цитохимии и микробиологии

Важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для профилактики, диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у больных в лечебно-профилактических учреждениях занимают микробиологические исследования. Современная клиническая медицина предъявляет к микробиологическим (бактериологическим) исследованиям возрастающие требования по увеличению объема, повышению качества исследований, разработке и внедрению новых более совершенных методов. Это связано как с новыми научными достижениями в области эпидемиологии и бактериологии, так и с увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, ростом госпитальных инфекций.

Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат: отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в предварительно простерилизованные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитирующей микрофлоры, развитию процессов гниения и брожения, что искажает результаты анализа. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1-2 часа. Самым простым методом выявления микобактерий туберкулеза в выделениях больных является микроскопия мазка, приготовленного из мокроты. При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии.

Чувствительность метода люминесцентной микроскопии значительно выше - от 10 000 до 100 000 микобактерий в 1 мл материала, кроме того, этот метод дает возможность за значительно более короткое время просмотреть необходимое количество препаратов. Эффективность бактериоскопии повышается также при передаче изображения на компьютер при помощи присоединенной к микроскопу видеокамеры.

Чтобы диагностировать туберкулез, необходимо сделать все возможное для выявления возбудителя заболевания. Микробиологически диагноз может быть подтвержден на основе результатов культурального исследования на комплекс M. tuberculosis (или, при возможности, путем идентификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот) в пробах, взятых в месте локализации патологического процесса. Однако на практике в настоящее время многие лаборатории не располагают материально-технической базой для проведения культуральных исследований. К счастью, микроскопия окрашенных препаратов мокроты доступна практически везде, поэтому диагностика туберкулеза может проводиться на основе выявления кислотоустойчивых микобактерий. На территориях с высокой распространенностью туберкулеза выявление кислотоустойчивых микобактерий в окрашенных препаратах мокроты демонстрирует высокую специфичность, поэтому положительный результат микроскопии мокроты можно рассматривать как подтверждение диагноза. Кроме высокой специфичности к комплексу M. tuberculosis, выявление кислотоустойчивых микобактерий при микроскопии играет важную роль по трем причинам: это – наиболее быстрый метод диагностики туберкулеза; позволяет выявить больных с тяжелым развитием патологии, чреватым высоким риском летального исхода; дает возможность выявить больных, являющихся распространителями инфекции.

Оценка качества работы лабораторий микроскопии должна проводиться соответствующим государственными органом (как правило, представителями национальной программы борьбы с туберкулезом).

Неправильный диагноз, поставленный перед началом лечения, приводит к риску ненужного, неправильного или неудачного лечения. Более того, подобный подход чреват несвоевременной постановкой правильного диагноза и назначением соответствующего лечения. При надлежащем подходе и контроле в большинстве случаев у детей в возрасте пяти лет и старше могут быть получены образцы мокроты. У подростков (хотя они часто относятся к детской возрастной группе, по крайней мере, до 15 лет) получить пробы мокроты не составляет большого труда. Поэтому фактор возраста не может рассматриваться как препятствие для сбора проб мокроты у детей и подростков.

Исходя из имеющихся данных, можно прийти к заключению, что для диагностики туберкулеза необходимо взять не менее двух проб мокроты. В случаях, когда имеются соответствующие возможности, можно направлять для лабораторного исследования еще и третью пробу, но исследование более трех проб мокроты вряд ли целесообразно, поскольку не может в значительной мере повысить эффективность диагностики. Кроме того, исследование третьей пробы может оказаться полезным только для подтверждения диагноза, если одна или две предыдущие пробы дали положительный результат. Крайне желательно, чтобы результаты микроскопии мокроты направлялись лечащему врачу в течение одного рабочего дня с момента отправки проб. Не меньшее значение имеет также и время сбора проб. Результаты исследований показывают, что эффективность лабораторных анализов максимальна, если пробы мокроты получены утром, после пробуждения от ночного сна. Возможно, совершенно необязательно собирать только утренние пробы, но, про крайней мере, одна из них должна быть получена утром.

Как правило, внелегочные очаги туберкулезного процесса содержат гораздо меньшее количество M. tuberculosis, поэтому микроскопическое выявление кислотоустойчивых микобактерий в пробах из внелегочных очагов весьма затруднено, и в таких случаях результаты культуральных исследований приобретают большое значение. Учитывая низкую результативность микроскопии, при внелегочном туберкулезе культуральные и морфологические исследования приобретают особое значение, например, в диагностическом исследовании проб ткани лимфатических узлов, полученных при помощи игловой биопсии.

Лечение пациентов, у которых наблюдаются тяжелое или быстро развивающееся заболевания, ассоциированные с туберкулезом, необходимо начинать немедленно, даже до лабораторного подтверждения диагноза. Лечение следует начинать до получения результатов лабораторного исследования и лишь позднее внести необходимые поправки и изменения в схему лечения с учетом результатов микроскопии.

Хотя микроскопия мокроты является наиболее доступным бактериологическим тестом, там, где ресурсы позволяют и имеются условия для качественной лабораторной диагностики, в диагностический алгоритм необходимо включать культуральные исследования мокроты, в случаях отрицательных результатов микроскопии. Правильное проведение культуральных исследований связано с определенными трудностями и дополнительными затратами, но этот метод отличается более высокой чувствительностью и повышает вероятность раннего выявления больных туберкулезом.

Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену является важнейшим элементом диагностики туберкулеза. Исследование 3 мазков мокроты позволяет выявить более 60% случаев туберкулеза легких и 95% наиболее заразных случаев (исследование одного мазка мокроты выявляет 75% наиболее заразных случаев, исследование второго мазка мокроты добавляет еще 20%, а исследование третьего - еще 5%).

Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену позволяет быстро получить результаты, выявить основные источники инфекции, является менее дорогостоящей, чем посев мокроты и широко доступна для применения. Но она должна быть надежной и хорошо контролироваться. Вероятность обнаружения МБТ при бактериоскопии мазков мокроты прямо пропорциональна концентрации возбудителя в исследуемом материале. Например, когда в 1 мл мокроты содержится от 1000 до 10000 МБТ, то вероятность получения положительного результата составляет около 40-50%. При концентрации МБТ менее 1000 в 1 мл мокроты вероятность их обнаружения резко снижается – отрицательные результаты получаются примерно в 96% случаев.

Основным и наиболее часто изучаемым биоматериалом в пульмонологической практике является мокрота. Требования к забору и качеству мокроты следующие:
1) первую пробу мокроты желательно получить до начала курса антибиотикотерапии;
2) мокроту оптимально собирать утром, до приема пищи, после тщательного туалета полости рта (полоскание кипяченой водой);
3) больным нужно доступно объяснить, что требуется получить именно содержимое нижних отделов дыхательных путей, а не ротоглотки, и, по возможности, проконтролировать их действия;
4) забор материала проводить в стерильные интактные контейнеры;
5) продолжительность хранения мокроты в контейнерах не должна превышать 2 ч (в летнее время желательно не более 1 ч);
6) в условиях лаборатории качество мокроты оценивается после окрашивания мазка по Граму (при наличии в мазке менее 25 лейкоцитов и более 10 эпителиальных клеток, при просмотре не менее 8-10 полей зрения при малом увеличении, мокрота признается некачественной, дальнейшее ее исследование нецелесообразно, так как, скорее всего, материал получен из ротовой полости);
7) высокая диагностическая ценность исследования признается при выделении возбудителя в концентрации і106 КОЕ/мл.

Вообще, в диагностике заболеваний туберкулезом можно выделить несколько этапов:

· Преаналитический этап (предварительный диагноз, выбор материала и метода исследования, забор биомтериала и его транспортировка)

· Аналитический этап (непосредственно проведение анализа)

· Постаналитический этап (оценка результатов)

Часть этих этапов проводится вне лаборатории, поэтому очень важна согласованная и качественная работа всех специалистов, привлеченных в этот процесс. Важен правильный выбор исследуемого материала. Важным этапом диагностики являются процедуры взятия и доставки материала в лабораторию.При взятии всех видов исследуемого материала следует ориентироваться на стандартные системы для этой цели: тампоны, цитощетки, тубсеры, контейнеры и т.п. Эффективность аналитического этапа во многом определяется уровнем технического оснащения лабораторий. Постаналитический этап исследования включает две составляющие: проверку достоверности полученного результата и оценку этиологической значимости выделенных штаммов. В лаборатории должен осуществляться строгий внутренний контроль качества исследований, важной составляющей которого является проверка полученных результатов на достоверность. Оценка этиологической значимости выделенных микроорганизмов принципиальна для выбора адекватной терапии. Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и обезжиренные в спирте или смеси для обезжиривания предметных стекол (производство АБРИС+) стекла без царапин и сколов. При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов. Не рекомендуется использовать саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям исследуемого изображения. Стекла должны соответствовать ГОСТу. Стекла, на которых при микроскопическом исследовании были обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, сохраняются в лаборатории в течение 1 года, а затем подлежат обязательному уничтожению и не должны использоваться повторно. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем промывают в проточной воде и протирают насухо.

… лабораторная диагностика занимает ведущее место в выявлении многих инфекционных заболеваний.

Диагностика туберкулеза основывается на данных клинических, гистологических, микробиологических исследований, оценке результатов туберкулиновых проб и тест-терапии. Из этих методов самым надежным является обнаружение микобактерий туберкулеза (МБТ), остальные же информативны только в комплексе. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на:

• выявление (обнаружение) возбудителя;
• определение лекарственной устойчивости;
• типирование микобактерий туберкулеза.

ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ

Бактериоскопические методы. Обнаружение возбудителя начинается с наиболее простых и быстрых бактериоскопических методов: световой микроскопии с окраской по Цилю–Нильсену и люминесцентной микроскопии с окраской флюорохромами. Преимущество бактериоскопии – в быстроте получения результата, однако возможности ее ограничены из-за низкой чувствительности. Этот метод является наиболее экономичным и рекомендован Всемирной организацией здравоохранения в качестве основного для выявления заразных больных.

Метод биологической пробы. Наиболее чувствительным способом обнаружения МБТ считается метод биологической пробы – заражение диагностическим материалом высокочувствительных к туберкулезу морских свинок.

Молекулярно-генетическая диагностика. Развитие молекулярной биологии позволило значительно повысить эффективность обнаружения микобактерий. Базовым методом молекулярно-генетических исследований является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале. ПЦР дает экспоненциальную амплификацию специфического участка ДНК возбудителя: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению содержания исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле. Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением. Однако при установлении диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

Туберкулинодиагностика. Косвенные методы для определения наличия МБТ в организме больного базируются в основном на выявлении специфических антител. Исторически первым методом является туберкулинодиагностика – она заключается в выявлении иммунных реакций, развивающихся в коже при введении туберкулина. Из большого количества вариантов туберкулиновых проб в настоящее время широко используется внутрикожная проба Манту. Методы туберкулинодиагностики сохранили свое диагностическое значение только среди пациентов детского и подросткового возраста.

Вспомогательную роль в диагностике внелегочного туберкулеза играют пробы с подкожным введением туберкулина, когда ориентируются на характерную очаговую реакцию (туберкулез глаз, туберкулез женских половых органов). Более широкому применению туберкулиновых проб с диагностической целью у взрослых препятствует невозможность в большинстве случаев отличить состояние инфицированности и болезни.

Иммуноферментный анализ. Существуют методики для определения антител к МБТ в различных биологических субстратах с помощью иммуноферментного анализа. Главная проблема, возникающая при разработке специфической иммунодиагностики, заключается в получении препаратов антигенов и антител, позволяющих добиться оптимального соотношения чувствительности и специфичности тестов. Сейчас преобладает мнение о целесообразности использования этих методов только для скрининга туберкулеза и отбора пациентов для детального обследования.

Диагностики ex juvantibus (тест-терапия). В случаях, когда указанные методы не позволяют подтвердить активный туберкулез (легких), можно использовать метод диагностики ex juvantibus. Больным с клиническими симптомами и рентгенологическими изменениями, которые свидетельствуют об активном туберкулезе или сомнительной активности процесса, а также при гиперергической туберкулиновой пробе назначают химиотерапию противотуберкулезными препаратами. В таких случаях через 2 – 3 месяца необходимо повторное рентгенологическое исследование. При заболевании туберкулезной этиологии отмечается частичное или полное рассасывание воспалительных изменений (это так называемый отсроченный диагноз).

Тест CLINISPOT-TB. Новый лабораторный тест для диагностики туберкулеза CLINISPOT-TB заключается в определении количества Т-лимфоцитов, высвобождающих -интерферон при контакте со специфическими антигенами МБТ. Наличие эффекторных Т-лимфоцитов свидетельствует об инфицировании МБТ. CLINISPOT-TB обладает высокой чувствительностью, позволяя выявлять единичные Т-лимфоциты и таким образом диагностировать латентную инфекцию, а также инфекцию у лиц со сниженным иммунным ответом. Высокая специфичность теста достигается использованием антигенов, специфичных для патогенных штаммов MБТ, что приводит к отсутствию ложноположительных результатов у вакцинированных или инфицированных другими микобактериями лиц. В ходе клинических исследований было показано, что чувствительность теста CLINISPOT-TB при активном туберкулезе достигает 96% даже у пациентов с внелегочной локализацией процесса, в то время как чувствительность кожной пробы составляла 69%.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

Метод абсолютных концентраций. По приказу Минздравсоцразвития России № 109 от 21 марта 2003 г. в бактериологических лабораториях используется метод абсолютных концентраций: посев выделенных культур микобактерий на плотную питательную среду с критическими концентрациями противотуберкулезных препаратов. В случае выявления устойчивости к препаратам первого ряда (рифампицину, изониазиду, пиразинамиду, стрептомицину и этамбутолу) проводят исследование на устойчивость к препаратам резервного ряда (фторхинолонам, амикацину,капреомицину, циклосерину, парааминосалициловой кислоте, этионамиду, протионамиду).

Посев на жидкие питательные среды в системе BACTEC MGIT 960. В крупных противотуберкулезных центрах используют методы определения лекарственной устойчивости МБТ при посеве на жидкие питательные среды в системе BACTEC MGIT 960. Эта система проводит автоматизированный учет роста микобактерий, позволяя сокращать срок анализа до 14 дней.

Разрабатываются и внедряются новые методы оценки лекарственной устойчивости по мутациям в геноме МБТ и на основе микрочиповой технологии. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, мутации в которых определяют развитие устойчивости к различным препаратам: к изониазиду – гены katG, inhA, ahpC/oxyR, kasA, furA и ndh, к рифампицину – rpoB, к стрептомицину – rpsL, к фторхинолонам – gyrA и т.д. Большие надежды в области определения лекарственной устойчивости микобактерий связаны с развитием микрочиповой технологии. Этот высокочувствительный метод позволяет определять устойчивость микобактерий одновременно к нескольким противотуберкулезным препаратам непосредственно в диагностическом материале в течение 2 дней.

ТИПИРОВАНИЕ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

Комплекс методов имеется и для типирования микобактерий, в котором используются культуральные, биохимические, биологические, а также молекулярно-генетические методы. На основе молекулярно-генетического типирования микобактерий интенсивно развивается область молекулярно-эпидемиологических исследований, в которой по генотипу микобактерии выявляются очаги и прослеживаются пути распространения туберкулезной инфекции.

Читайте также: