Анализ на генетическую предрасположенность к туберкулезу

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 2, с. 262-271

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ТУБЕРКУЛЕЗУ

ЛЕГКИХ В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991;

4Московский научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения Москвы,

Поступила в редакцию 09.04.2009 г.

Заболеваемость туберкулезом (ТБ) остается одной из важных проблем здравоохранения. Есть данные, что предрасположенность к инфекционным заболеваниям, в том числе к туберкулезу, зависит от генетического статуса. Для определения генетических факторов риска развития ТБ с помощью аллель-специфичной гибридизации на биочипе определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, GSTT1, GSTM1, NAT2, MDR1 и NRAMP1 у 73 больных ТБ и 352 здоровых индивидов. У больных ТБ обнаружено увеличение частоты "нулевого" GSTT1 генотипа (OR = 3.26, 95% CI = 1.91-5.55, p = 0.000028) и двойного "нулевого" GSTT1/GSTM1 генотипа (OR= 4.05, 95% CI = 2.14-7.65, p = 0.000034) по сравнению с группой здоровых доноров. Впервые показано, что у больных ТБ генотип NAT2* 5/* 5 в сочетании с "нулевым" GSTT1 и двойным "нулевым" GSTT1/GSTM1 генотипами встречается достоверно чаще, чем в контроле. Таким образом, изученные полиморфные варианты генов GSTT1, GSTM1 и NAT2 могут потенциально модулировать риск развития ТБ у этнических русских и представляют интерес для дальнейших исследований на больших выборках.

Туберкулез (ТБ) — это инфекционное заболевание, вызываемое микобактериями туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis, МБТ) и характеризующееся развитием клеточной аллергии и специфических гранулем в различных тканях и органах [1].

В настоящее время ТБ занимает первое место среди причин смерти от инфекционных заболеваний. В мире ежегодно регистрируется около 8 млн. новых случаев заболевания ТБ органов дыхания, и прогноз дальнейшей динамики эпидемической ситуации остается неблагоприятным. В России эпидемиологическая ситуация по ТБ также остается напряженной: заболеваемость по итогам 2007 г. составила 83.2 на 100000 населения, распространенность — 194.5 на 100000 населения, смертность — 21.3 на 100000 населения [2]. Данное заболевание является социально зависимым, при этом на развитие ТБ влияют как неблагоприятные условия внешней среды, так и индивидуальные характеристики организма индивида.

На сегодняшний день подтверждена гипотеза, что предрасположенность к инфекционным заболеваниям зависит от эффективности активации клеточного иммунитета и определяется генетическим статусом. В частности, подтверждена

гипотеза о том, что генетическая предрасположенность к ТБ может быть обусловлена наличием полиморфизма в генах индивида, ответственных за естественный иммунитет к инфекциям. Так, показано, что носители распространенных производных аллелей генов семейства Toll-подобных рецепторов, которые отвечают за распознавание и элиминацию бактерий и вирусов, более подвержены развитию ТБ, чем индивиды, носители предковых аллелей [3, 4]. Наличие производного аллеля —336G в промотерной области гена CD209, кодирующего мембран-связанный распознающий рецептор DC-SIGN (замена —336A>G), напротив, обусловливает снижение экспрессии CD209 и концентрации рецептора DC-SIGN и, тем самым, определяет протективное действие в отношении ТБ в целом и кавернозной формы ТБ в частности [5]. Также нельзя не отметить ключевую роль генов цитокинов, белковые продукты которых участвуют в формировании гранулемы, а также в контроле внутриклеточного роста МБТ и распространении бацилл [6, 7]. Кроме того, следует отдельно остановиться на гене NRAMP1 (SLC11A1), который кодирует специфичный для макрофагов мембранный белок-переносчик, необходимый для активации макрофагального зве-

на иммунного ответа и раннего уничтожения внутриклеточных патогенов, тем самым обусловливающий устойчивость к ТБ в период непосредственно после первичного инфицирования [8, 9].

Многочисленные молекулярно-генетические исследования, сочетающие в себе возможности методов кандидатного и позиционного картирования, позволили локализовать гены-кандидаты предрасположенности к ТБ на 2-й, 6-й, 15-й, 17-й, 20-й и Х-хромосомах [8—12]. Однако, несмотря на активное изучение генетической составляющей в этиологии ТБ, на сегодняшний день известны далеко не все гены, аллели которых определяют предрасположенность к данному инфекционному заболеванию.

Получены результаты, что факторами риска развития ТБ помимо сниженных показателей иммунного статуса являются курение и неблагоприятные условия окружающей среды [13, 14]. В связи с этим помимо уже известных генов кандидатов предрасположенности к ТБ становится актуальным изучение генов, белковые продукты которых участвуют в метаболизме ряда ксенобиотиков (в том числе компонентов табачного дыма), т.е. анализ полиморфизма генов системы биотрансформации. О важности изучения функционального состояния ферментов системы биотрансформации при ТБ свидетельствуют также результаты ряда работ, в которых показано, что негативное воздействие факторов внешней среды и наличие определенных аллелей некоторых генов системы биотрансформации являются факторами риска развития обструктивных болезней легких и заболеваний верхних дыхательных путей, при этом данные патологические состояния часто сочетаются с ТБ [15—18].

Для проведения исследования нами были выбраны гены системы биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, GSTT1, GSTM1, NAT2, MDR1 и NRAMP1, белковые продукты которых играют важную роль в метаболизме широкого круга как ксенобиотиков, так и эндогенных субстратов. Гены CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9и CYP2C19 кодируют ферменты I фазы биотрансформации; гены GSTT1, GSTM1 и NAT2 — ферменты II фазы биотрансформации; ген MDR1 кодирует P-глико-протеин — важнейший белок-транспортер, участвующий в выведении продуктов метаболизма из клетки в III фазе биотрансформации; а также ген NRAMP1, который кодирует макрофагальный белок-переносчик, ассоциированный с естественной устойчивостью к инфекции [19, 20].

Для выяснения роли генов системы биотрансформации в развитии ТБ в настоящей работе определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, GSTT1, GSTM1, NAT2, MDR1 и NRAMP1 у 73 больных ТБ и проведено сравнение с частотами полиморфных вариантов данных генов у 352 здоровых ин-

дивидов — представителей этнически гомогенной популяции русских.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты. Обследовано 73 пациента с диагнозом ТБ в возрасте от 19 до 82 лет (64.4% мужчины), из которых 31 больной был с инфильтративным ТБ, 19 — с фиброзно-кавернозным, 9 — с диссеми-нированным, 6 — с экссудативным плевритом, 4 — с очаговым ТБ, 2 — с туберкулемой и 2 — с ТБ внут-ригрудных лимфатических узлов. Диагностика ТБ и определение конкретной формы заболевания основывались на данных клинического и рентгенологического исследований. Все пациенты с диагнозом ТБ находились на лечении в отделениях Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ) с 2006 г.

В качестве контрольной группы были протестированы 352 неродственных здоровых индивида (диапазон возраста от 20 до 65 лет, 48.6% мужчины). В эту группу вошли студенты Московского государственного открытого университета (МГОУ), сотрудники Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и сотрудники Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (ИОГен РАН), не имеющие легочной патологии.

Все пациенты и здоровые доноры являются жителями европейской части России и представлены этнически гомогенной популяцией русских. Весь материал был собран с соблюдением процедуры информированного согласия.

Исследуемые образцы. В работе использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови с помощью набора Wizard genomic DNA purification system ("Promega", США) или из слюны с использованием набора реагентов для выделения Oragene™ DNA Self-Collection Kit ("DNA Genotek", Канада).

Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer ("Applied Biosystems", США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Нуклеотидные последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов, представляющие собой полиморфные участки генов NRAMP1 (C274T) и MDR1 (C3435T), приведены в табл. 1. Последовательности остальных иммобилизованных олигонуклео-тидов опубликованы ранее [21].

Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для наработки фрагментов ДНК использовали двухэтапную мультиплексную ПЦР. Прай-меры подбирали с использованием программы Oligo 6 (Molecular Biology Insights, США). Типы изученных мутаций и последовательности прай-меров для полиморфных участков генов NRAMP1

NAT2 NRAMP1 MDR1 GSTT1 GSTM1

341T 481C 590G 857G 274C 3435C + +

341C 481T 590A 857A 274T 3435T - -

--^ CYP2D6 CYP2C9 CYP2C19

C4887A и A4889G T6235C >-А-v-^-v-л-\

CCATT ACATT 6235T 1934G 430C 1075A 681G

CCGTT ACGTT 6235C 1934A 430T 1075C 681A

Рис. 1. Схема олигонуклеотидного биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации и выявления генетической предрасположенности к ТБ. Пояснение в тексте.

(С274Т) и MDR1 (С3435Т) приведены в табл. 1. Для амплификации остальных генов системы биотрансформации использовали праймеры, последовательности которых опубликованы ранее [21].

Изучаемые гены были объединены в группы, соответствующие блокам олигонуклеотидных проб на биочипе. В группу 1 вошли гены: CYP1A1 (4887С>А, 4889Л>0 и 6235Т>С) и CYP2D6 (1934С>Л); в группу 2 - G

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

ГЛОТОВ А.С., ГРА О.А., КОЖЕКБАЕВА Ж.М., МАКАРОВА О.В., НАСЕДКИНА Т.В. — 2008 г.

БИКТАШЕВА А.Р., ГОЛДЕНКОВА-ПАВЛОВА И.В., ГРА О.А., КАРУНАС А.С., НАСЕДКИНА Т.В., РАМАЗАНОВА Н.Н., ФЕДОРОВА Ю.Ю., ХУЗИНА А.Х., ХУСНУТДИНОВА Э.К., ЭТКИНА Э.И., ЮЛДАШЕВА А.А. — 2009 г.

АЗИЗОВА Т.В., ВЯЗОВСКАЯ Н.С., ГЛАЗКОВА И.В., ГУРЬЯНОВ М.Ю., ОСОВЕЦ С.В., РУСИНОВА Г.Г. — 2014 г.

БАРАНОВА И.А., ГЛОТОВ А.С., ГОЛДЕНКОВА-ПАВЛОВА И.В., ГРА О.А., КОРОЛЕВА О.В., МОСКАЛЕНКО М.В., НАСЕДКИНА Т.В., СУРЖИКОВ С.А., ФИЛИМОНОВА Н.А. — 2012 г.

Владельцы патента RU 2398230:

Изобретение относится к области медицины, в частности к фтизиатрии. Сущность способа прогнозирования генетической предрасположенности к туберкулезу органов дыхания у детей заключается в том, что проводят молекулярное типирование генов семейства главного комплекса гистосовместимости в крови методом полимеразной цепной реакции. При обнаружении в генах, выделенных из ДНК, аллелей HLA-DR В1*04 или HLA-DR В1*16 определяют высокую степень риска заболевания туберкулезом. Использование способа позволяет повысить эффективность прогнозирования туберкулеза органов дыхания у детей. 1 табл.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано при контроле риска заболевания туберкулезом органов дыхания с целью адекватного лечения больного.

Проблема стала особенно актуальной в последние годы в связи со значительным ростом числа заболевших туберкулезом в мире. Туберкулез - болезнь, являющаяся одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения, - ежегодно уносит жизни более 1 млн человек (Dye С. et. al., 2005). В нашей стране туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее распространенных инфекций и представляет огромную опасность для здоровья населения. В последние годы туберкулез стал характеризоваться высокой тенденцией к прогрессированию, быстрым развитием каверн, полирезистентностью возбудителя болезни к противотуберкулезным лекарствам (Попович В.К., 2005; Мишин В.Ю., 2008). В 2007 году уровень заболеваемости туберкулезом в Российской Федерации составил 82,6 человека (в 2006 г. - 83 человека) на 100 тысяч населения, заболеваемость туберкулезом детей - 16,4 на 100 тыс. В течение 2007 года от туберкулеза в России умерло 25 900 человек, каждый день от туберкулеза в России умирает 71 человек (Туберкулез в Российской Федерации. Аналитический обзор основных статистических показателей по туберкулезу, используемых в Российской Федерации. Москва, 2007).

Следовательно, одной из важнейших задач, стоящих перед современной медициной, является разработка новых способов предупреждения заболевания.

Известен способ генетического прогнозирования туберкулеза органов дыхания (Довгалюк И.Ф. Роль иммуногенетических факторов в развитии и течении туберкулезной инфекции у детей: дис… д. м.н. - СПб., 1993 г.). В работе решается задача генетического прогноза заболевания и течения туберкулеза органов дыхания у детей. Способ заключается в изучении фенотипических характеристик HLA серологическим методом. Автор рассматривает различную частоту встречаемости фенотипов локусов HLA А, В, С (I класс) и DR у детей с различными проявлениями туберкулеза. Материалом исследования послужили результаты наблюдения детей, находившихся на излечении в клиниках СПбНИИФ в 1988-1991 гг., то есть в период эпидемиологического благополучия по туберкулезу. Несовершенство предложенного способа объясняется тем, что лимфоцитотоксический тест имеет пределы возможности метода и количество специфичностей, определяемых данной методикой, меньше, чем при определении методом полимеразной цепной реакции. Следует констатировать, что определение генетических детерминант туберкулеза представляется трудной задачей, а первоначальные выводы, основанные главным образом на результатах лимфоцитотоксического теста, нуждаются в верификации и в поисках более эффективных подходов в решении данной проблемы.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Выделение ДНК.

Геномную ДНК выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови (свежей или замороженной при -20°С), стабилизированной ЭДТА или цитратом натрия (конечная концентрация антикоагулянта 0,5%), с помощью набора реагентов для выделения ДНК "НПФ ДНК-технология" (Москва). Периферическую кровь центрифугируют в пластиковой пробирке типа "Eppendorf" при 13000 g в течение 1 минуты. Затем надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл лизирующего буфера и центрифугируют при 13000 g в течение 1 минуты. Процедуру лизиса повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не становится прозрачной.

После окончательного удаления надосадочной жидкости к осадку мононуклеаров добавляют 60 мкл буфера для протеиназы К, 1 мкл протеиназы К (концентрация 10 мг/мл) и ресуспендируют. Инкубацию с ферментом проводят не менее чем в течение 60 минут при +55°С. Инактивацию протеиназы К после инкубации проводят путем нагревания пробирки на водяной бане при 95°С в течение 10 минут. После охлаждения пробирку центрифугируют при 13000 g в течение 10-15 секунд. Раствор ДНК хранят при +4°С до использования.

2. HLA-DR B1 типирование.

Молекулярное типирование гена DR B1 проводят с использованием панели праймеров, позволяющей выявлять 13 групп его аллелей. Используемый способ включает в себя целую серию амплификации различных участков гена HLA-DR B1 и называется PCR-MSSP-методом (polimerase-chain reaction sequence specific primers mixed) (Алексеев Л.П. и соавт., 1997). Амплификацию проводят на амплификаторе "ТЕРЦИК" ("ДНК-Технология", Москва) в два этапа.

I этап - амплификация II экзона DR B1-гена проводят по следующему температурному режиму:

1) 94°С - 1 мин 1 цикл,

2) 94°С - 0 мин 20 с 7 циклов,

3) 58°С - 0 мин 5 с,

4) 92°С - 0 мин 5 с 28 циклов,

5) 56°С - 0 мин 2 с.

В результате этой амплификации получают продукт длиной 247 или 243 п.н., который затем разводят в 10 раз и используют во втором этапе амплификации. В качестве отрицательного контроля в реакции вместо ДНК используют дистиллированную воду.

II этап - серия амплификации со специфическими парами праймеров по следующему температурно-временному режиму:

1) 93°С - 0 мин 1 с 15 циклов,

2) 62°С - 0 мин 2 с.

Примечание: температурно-временной режим как I, так и II этапов амплификации всегда приводят в прилагаемой к набору реактивов инструкции.

Продукты амплификации оценивают методом гель-электрофореза в 3,2% агарозном геле. Аллельную идентификацию проводят путем сравнения длины полученных продуктов с маркером длин PUC19. Определенный аллель имеет амплификационный продукт определенной длины.

Материалом для выполнения задачи исследования служат результаты динамического наблюдения 50 подростков, больных туберкулезом органов дыхания.

Сопоставление проведено с группой здоровых лиц - жителей Северо-Запада России (346 человек) методом непараметрической статистики.

Автореферат диссертации по медицине на тему Генетические маркеры восприимчивости к туберкулезу у детей тувинской национальности

\> " '(0 / I \aK.v ^"МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКАЯ ОПЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ НАУЧНО -ИССЛЕЛ03А1ЕЛЬСКИЙ ИНСТЮГ ТУЬЕРНУЛЕЗА

На правах рукописи

МАТРАК1Ш Александр Георгиевич

ГСНЕТИЧЕСШ® МАРКЕРЫ ЗОСПРИШЧИЗОСГИ К ТУБЕРКУЛЕЗУ У ДЕТЕЙ ТУЗШСКОй НАЦИОНАЛЬНОСТИ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена з '"оско*ском научно-исследочательском институте туберкулеза Министерства Здравоохранения Российской Федерации, Республиканском противотуберкулезном диспансере Республики 1ува, г.Кызыл.

поктор медицинских наук, профессор А.А.Приймак канпипат ыепицинских наук Р.П.Селицкая

доктор медицинских наук Б.М.Малиев канлипат биологических наук А.Ф.Маленко

Ведущее учреждение - Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза Российской ака-пемии медицинских наук

Защита диссертации состоится "" & б. 1993 г. в

"_" часов на заседании специализированного Совета

К.064.01.01 при Московском научно-исследочательском институте туберкулеза МЗ Российской Федерации по адресу:101478,г.Москва ,ул.Достоевского,4.

Автореферат разослан " " & $._1993 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь специализированного Совета

ттоктор медицинских наук,профессор И.П.Соловьева

Изучение влияний условий внешней среды на развитие и уровень заболеваемости туберкулезом сыграло большую роль в борьбе с этой инфекцией. До недавнего времени туберкулез рассматривали только как социально-эпидемиологическую проблему и считалось,что предрасположенность к туберкулезу по наследству не передается.

Однако в настоящее время, целый ряд новых данных, полученных отечественными и зарубежными ученный, свидетельствуют о наличии генсггг'вс! тр^ерминированных, наследственных механизмов в патогенезе заболеваний,в том числе туберкулеза

Найдены положительные ассоциации ряда антигенов НЬА-системы, аллотипов иммуноглобулинов, некоторых полиморфных белковых локу-сов с заболеванием туберкулезом (Фоменко А.Г. с соавт.,1935; Довгалюк И.Ф.,1986; Ыитинская Л,А. с соавт.,198о; Поспелов Л.Е_., с соавт.,1937; Нагое .,о+ а1.,1335, Зо1Ъу «1. ,1978; Д1-Аг:>Г I. а с.1. ,1979).

О роли наследственных факторов при туберкулезе говорит преимущественная передача определенных НЪ А-специ^чностей от больных родителей больным детям (Поспелов Л.Б. с соявт.,1986,1991; Чуканова 3.П.,1936; Хоменко А.Г. с соавт.,1990; Зхг-сН 5. е^с!. , ■ 1984).

В связи с новыми аспектами в гекезе туберкулеза, в настоящее время не подлежит сомнению тот Rwb3.

При сегрегационном анализе сцепления генов системы HLA с заболеваемостью туберкулезом в многодетных семьях, в которых . есть больные туберкулезом установлена преимущественная наследственная передача антигена HLA-d>R2 от больных родителей . больным детям.

Разработана система оценки иммуногенетической основы восприимчивости к туберкулезу детского населения тувинской национальности, включающей определение аллотипов иммуноглобулинов, белковых полиморфных локусов и антигенов HLA-системы. При носительст-ве аллотипа иммуноглобулина GIm(2), фенотипа GImC+I, +2, +4), фермента Esd 2-2, антигенов HLA-системы BI5, DRw52, DR2, дети тувинской нпциональности должны входить в *групцу риска" по туберкулезу. В семьях больных туберкулезом необходимо обследование детей для установления HLA-dr-фенотипа. Детей, носяцих антиген HLA-d Й2, необходимо включать в "групцу повышенного риска" в отношении заболевания туберкулезом.

Положения,выносимые на защиту

1. Генетическими маркерами восприимчивости к туберкулезу у детей тувинской национальности является фенотип GIn(+I, +2, +4), аллотип (GIm/2/, антигены HLA-3I5, dR-2, dR53, генетический вариант Esd 2-2.

2. Семейный анализ в очагах туберкулеза показал преимущественнее наследование антигена НЬА- dK2, который является фактором восприимчивости к туберкулезу.

3. Для детей тувинской национальности характерно:

а) повышенная восприимчивость гомозиготных вариантов сывороточного белка гаптоглобина Кр 2-2, группоспецифического компонента Gcl-I, ферментов эритроцитов-фосфоглвкоиутазы (Р5У1-1),

г/слой фосфотазы (АСР-ЪЪ), аденозиндезаминазы (APA I-I), пс жена встречаемость гетерозиготных вариантоз Ge 1-2, PGM 1-2, ADA 1-2 и гомозиготного варианта Ge 2-2.

б) повышена частота встречаемости антигенов HbA-Cw3, Cw4, НЬА-340 и понижена частота встречаемости HLA-AI и BE по локусу сНповшена частота встречаемости антигена DR5.

в) повышена частота встречаемости аллотйпа Glm(I), фене па GIm(+I, -2, -4) и понижена частота встречаемости аллотиг GI п£4), фенотипа вЫ-1, -2, +4).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на кон ции молодых ученых (г.Улан-Удэ,1991), AI съезде врачей-фтизи ров (г.Санкт-Петербург,1992), Республиканском обществе фтизи ров С г.Кызыл,1992). Результаты исследований легли в основу о него из разделов разработанной программы "Оздоровление насел ния в Республике Тува" и создании многопрофильной научной ла Моратория медико-биологических проблем в Республике Тува.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы в центральном журнале, материалах съезда фтизиатров и конференции ыолодых ученых, одна работа сдана в печать.

Внедрение. Результаты исследований внедрены в Республик скоу противотуберкулезном диспансере (г.Кызыл) и при система чесних экспедиционных выездах в территорий' ^- облики.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из в гения, обзора литературы, главы "Материал и методы исследова ния", глаз собственных исследований, заключения, выводов,спи используемой литературы и содержит страниц машинописно, текста. Работа иллюстрирована /Я таблицами и / графикам:

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Иммунологические исследования выполнены у 135 больных локаль-нии формами туберкулеза и 335 здоровых детей тувинской национальности в возрасте от 2 до 15 лет.

Для типирования всех обследованных лиц по антигенам локусов HLА-систеыы А,3,С и DR был использован разработанный Т.Терасаки и Д.Мак-Клеландом метоп комплемент-зависимого лимфоцитолиза (Terasaki Р., ,I,!cCleland J. ,1964), который в модификации, предложенной национальным институтом здравоохранения США ( Ray J. et al . ,1974), находит широкое применение в качестве воспроизводимого и удобного способа тишрозания под названием "двухступенчатый микролнмфоцитотоксический тест".

Больные туберкулезом и контрольная группа были типированы по 12 антигенам локуса HLA-^,17 антигенам локуса HLA-3, 5 антигенам локуса HLA-C и по 9 антигенам локуса HLA-dR.

В работе использованы антисыворотки производства Ленинградского центра типирования органов и тканей Института гематологии и переливания крови Российской Федерации. Для обеспечения надежности типирования при определении каждого антигена применено от 3 до 4 антисывороток анти-НЬА.

Определение полиморфных белковых локусов проводили с применением методов электрофореза в пояиакриламидном к крахмальном гелях с последующим гистохимическим окрашиванием электрофореграмм. Изучено 7 белковых локусов: эстераза Д (Esi), фосфоглюкомутаза(РСМ), кислая фосфотаза САСР), аденозиндеаминаза(А1>А),гаптоглобин(Нр), трансферин (Tf), группоспецифический компонент (Gc).

Определение аллотипоз иммуноглобулинов (Sa) проводили по стандартной методике,основанной на реакции торможения гемагглвти-нации в модификации с использованием типирующих и контрольных сы-

вороток фирмы " ВеЬгЛгтегке "(ФРГ).

Проведено обследование 12 многодетных семей тувинской национальности. Б каждой семье было от одного до трех больных туберкулезом сибсоэ и один-два здоровых сибсов. В 4-х семьях было по одному, в 7- по два больных и в I семье три больных ребенка.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с пс мощью методов и форм, применяемых в болыпинствё лабораторий для поиска ассоциации болезней с антигенами НЬА ( Ма-идлиэп. Р. 1970; Певницкий Л.А., 1980).

Частоту антигена определяли по формуле:

где:! -частота антигена,

п -количество лиц с данным антигеном, Л -количество больна; или здоровых,взятых в обследование

Сравнение частоты встречаемости антигенов НЬА у больных и здоровых провопили по критерию х^ с поправкой Йейтса на непрерывность для малых выборок (Га1;ез Р . ,1934).

(а + Ь)-(с+с1Ха+с>(Ъ+с1) где: а-число больных с данным антигеном, б-число здоровых с данным антигеном, с-число больных с другими антигенами, й-число здоровых с .другими антигенами Н = а+Ъ+с+й

й„ а х а . НБ-1 _ рр_ О-ШО _____

где: Р-частота антигена у больных Ш -относительный риск Ер - показатель этиологической фракции й1 -величина превентивной фракции.

Статистическая обработка для аллотипов иммуноглобулинов и

белкозых полиморфных локусоз проводилась теми же методами.

Бри семейных исследованиях сегрегационный анализ проводили

по методу,предложенному и. ¿е yri.cs е* а1. (1976).

Условно обозначали гашютипы НЬА отца - "а", "б", матери -"с", "а".

Результаты исследования и их обсуждение

I. Оценка эпидситуации по туберкулезу в Республике Тува.

Выполнен анализ статистических показателей по Российской Федерации и Республики Тува за период с 1937 по 1991 г.г. Оценка проводилась в сравнительном аспекте по показателям заболеваемости и болезненности туберкулезом всего населения и детей, по удельному весу больных туберкулезом коренных и некоренных жителей Республики Тува.

Анализ эпидпоказателей по туберкулезу за 5 лет показал,что общая заболеваемость в Республике Туза в 2,4

4,0а распространенность в 3-4,5 раза яьше, чем в Российской Федерации. Высокие эпицпоказатели сохраняются среди детского населения: показатели детской заболеваемости в 5-13, а болезненности в 7-15 раз вызе среднероссийских. Графическое отображение среднегодовой заболеваемости и болезненности в Республике Тува в сравнении с Российской Федерацией показаны на рисунках I и 2.

Признаком особенно тяжелой эпидситуации по туберкулезу в республике является высокий удельный вес больных туберкулезом детей по отношению ко всем больным, который составляет 17-24$ (в Российской Федерации 4,4-5,7^).

Способствует высокому уровню заболеваемости большое число здоровых контактов, приходящихся на одного бациллярного больного, которых в республике в 2,2-2,4 раза больше, чем в Российской Федерации.

Заболеваемость в ресцублике на 81,2% обуславливается коренным населением, а дети заболевают туберкулезом в основном тувинской национальности (97-100^). Соотношение удельного веса заболевших туберкулезом лиц коренной и других национальностей пред-

Рис.1. Урозень заболеваемости всего населения и детей в Ресцублике ТуваСР.Т.) и Российской Федерации (РФ) (показатель на 100 тыс.населения)

70 6050403020 10

05щая за5оле6аемость 8 РТ ////Л 05щая задолейаемостпь В РФ

(ШЯ Нетсная заЕолебаемость В РТ 11П! i i I детская заБолеВаемость ß РФ

5 50 503 450 400 350 300 250 200 150 ■ТОО 50

Уровень болезненности всего населения и детей в Республике Туна (Р.Т.) и Российской Федерации(Р A-3I7, но оно было статистически незначимым.

Различий по локусу HLA-C не выявлено у здоровых и больных туберкулезом детей тувинской национальности.

По локусу HLA- IR2 обнаружены статистически достоверные различия в сравниваемых группах по двум антигенам - HL.A- DR2 и HLA DPw53 (61,5% против 25,0%, х2 =5,11, р^0,05; RR =3,19 и 33,3% против 7,7^, х2=7,45, р^0,01, RR =5,00 соответственно)

Для выяснения степени значимости каждого из трех выявленных антигенов HLA-системы (315, dR-2, pRv?53), ассоциирующихся с заболезаниеа туберкулезом, была определена величина этиологической фракции (Ер). Наиболее значимой эта величина оказалась для антигена HLA-d В2-0,Зб ( для DRv/оЗ - 0,2В, В15 - 0,20). Зто позволяет с большей долей вероятности предположить,что "пер вичной". положительной ассоциацией с заболеванием туберкулезом является ассоциация с антигеном HLA- DR2.

3 результате исследования аллотипических вариантов иммуног булиноз было обнаружено,что у больных туберкулезом тувинской национальности, значительно повышена частота встречаемости фено типа GIm (+1, +2, +4) и повышена частота встречаемости аллотипа GIa/2/ по сравнению со здоровыми лицами (44,4% против 15,2%, х2=23,67, р 0,0£

3. Обеим родителям 2-7,9,10 2в 17 15,50 7,Н Я2. Передача НЬА-йК2 к больным сибсам от больных родителей обнаружилась в II случаях из 12 возмонных (51,6%), 3 то хе время этот антиген передавался от больных родителей здоровым детям з..4 случаях из 10 возможных (40,0$).

Относительный риск в семьях больных туберкулезом для сибсоз, наследующих от больных родителей антиген НЬА- б!?2, выше,чем во всей популяции и равен КЯ=П,0.

Сравнительный анализ (таблица 3) изученных генетических маркеров у здоровых лиц тувинской и русской национальности показал значительное преобладание в тувинской популяции гомозиготных вариантов полморфных белкозых локусоз, что возможно является одной из причин снижения устойчивости макроорганизца к инфекциям в том числе к туберкулезной,поскольку гомозиготность ведет к снижению разнообразия ответа иммунной системы на инфекционное начало.

- генотипы семей больных туберкулезом, информативных пля сегрегационного анализа по-^Р-2

семей 0 т е ц М а т ь С и б с ы

заболе- I) Е-гено- заболе- £ К-гено- эаболерание -0 Р-генотип

вание тип вание ТИП

I ТБ 2/5 зтор. 1/3 ^Б,зпор. 1/2, 2/3

г ■ зпор. 1/3 ТБ 1/2 ЧБ.ЧБ.ТБ 2/1,2/1,2/3

3 зпор. 1/3 1Б 2/7 ТБ,ТЬ,зпор. ,зпор. 2/1,2/1,7/3,7/1

4 зпор. 3/7 те 2/6 1Б,ТБ,зпор.,зпор. 2/3,2/7,6/7,2/3

5 зпор. 1/5 1'Б 2/7 гБ,ТБ,эпор. 2/5, 2/5,7/1

8 зпор. 1/4 ТБ 2/5 тБ,зпор.,зпор. 5/1, 5/4,3/2

Ю ТБ 5/6 зпор. 2/3 ТБ,ТБ,зпор.,зпор: 3/6,3/6,3/5,2/5

12 1Ъ 2П зпор. 1/5 'ГБ.зпор.,зпор. 5/2,1/2,5/7

Распределение генетических маркерсз у здоровых лщ тувинской и русской национальности

Локусы генотипы здоровые русские _ _ здороэые_тувкнцы ^ ^

число частота число частота

Нр 2-2** 651 0,4227 130 0,5253 8,87 0,01

1-1™ 642 0,4134 152 0,6154 34,45 0,001

Сс 1-2х 739 0,4759 65 0,3441 14,37 С.СС1

2-2х 172 0,1107 10 0 ?04^5 -10^81 0 ,001

1-2 64а 0,4257 30 0,2084 о,02 0,05

АСР ЬЬХ* 436 0,4233 53 . 0, ¿576 6,40 0,05

т тхх 903 0,6625 100 0,5о1о 7,43 0,01

1-2 139 0,1328 Л 0,0384 о,09 0,01

А Iх 43 0,2500 7 0,0й33 9,07 0,01

Сг;3 ХХ 7 0,0407 18 0,2143 17,38 0.С01

СМ5® II 0,0640 30 0,3571 33,92 0,001

35х 49 0,2-349 8 0,С9с2 5, со 0,05

В40хх 7 0,0407 15 0,17со ¿2,31 0,001

ЭК)** 50 0,2907 25 0,4оСв 5,с5 0,05'

СЬп/ 1/хх 49 0,5385 198 0,8354 21,18 0,001

51ш/4/х 76 0,8352 133 0,5612 14,64 0,001

сь/л.-г,-^/** 4 0,0440 56 0,2363 10,89 0,001

61и/-1,-2,+4Ух 42 0,4615 39 0,1646 21,48 0,001

Примечание: хх - повышенная частота встречаемости антигеноз у лиц тувинской национальности

х -пониженная частота встречаемости у лиц тузин-екой. национальности.

1. Генетическими маркерами восприимчивости к туберкулезу

у детей тувинской национальности являются фенотип GIm(+I, +2,+4) аллогип Gim'k2), антигены НЬА-315, dR2,dRw53, генетический вариант ESD2-2.

2. 3 семьях больных туберкулезом установлено преимущественное наследование антигена HL A- DK2.

3. К особенностям генотипа тувинской популяции относятся:

а) поливенная частота гомозиготных вариантов сывороточного белка гаптоглобина, группоспецифического компонента, фер-ментоз эритроцитов - фосфоглюкомутазы, аденоаиндезоменазы, кислой фссфртазы (Нр2-2, Gcl-I, PGUI-I, АСР ЪЪ ,ADA I-I),

б) повышена частота встречаемости аллотипа Glm(I),фенотипа GlraC+1,-2,-4 ) и понижена частота встречаемости аллотипа GIm(4), фенотипа GlmX -I, -2,-н4),

в) повышена частота встречаемости антигенов HLA- Cw3, Cw4; HL А-340 j HLA-HR5 и ионике на частота встречаемости антигенов AI и 35.

4. Разработана система оценки иммуногенетической основы восприимчивости к туберкулезу у детей тувинской национальности (аллотипы иммуноглобулинов, белковые полиморфные локусы, система HL А), которая позволит сформировать "группы риска" среди летей коренных жителей Тувы и "группы повышенного риска" в семьях больных туберкулезом.

Практические рекомендации. Разработанную систему оценки иммуногенетической основы восприимчивости к туберкулезу рекоме дуется включить в обследование детей тузинской национальности для формирования "группы риска" в Ресцублике Тува. 3 очагах т^ беркулеза необходимо пополнительное обследование на HL A-J> Р2 носительство с целью ^ыя^ления детей с повышенным риском разв] тия заболевания туберкулезом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Матракшин А.Г. Определение специфических антигенов методом иымуноферментного анализа и аллотипов иммуноглобулинсз

2. Цой К.Н., Иатракшин А.Г., Поспелов Л.Е. Генетические маркеры у больных туберкулезом и здоровых лиц тувинской национальности. В сб."XI съезд врачей-фтизиатров. Санкт-Петербург, 1992, с.334.

Читайте также: