Токсин холеры что это

Холера — это острое инфекционное заболевание, относящееся к особо опасным инфекциям.

Что это такое?

Из-за способности в короткое время поражать значительное количество людей (вызывать эпидемии) и 50-процентной смертности при отсутствии лечения может рассматриваться в качестве биологического оружия.

Возбудителем холеры является холерный вибрион (Vibrio cholerae)— слегка изогнутая палочка, отдаленно напоминающая запятую. Вибрионы оснащены жгутиками, что позволяет им очень быстро передвигаться. Микроорганизм был открыт известным немецким ученым Робертом Кохом в 1883 году.

Существует два типа вибрионов — классический и Эль-Тор — и оба они представляют опасность для человека. Они являются частью флоры многих водоемов, обнаруживаются даже в Москве-реке. Определяющий вопрос — количество этих самых вибрионов в единице объема воды. Для того чтобы заболеть холерой, надо проглотить от миллиона до триллиона микроорганизмов.

Такой большой разброс объясняется крайней неустойчивостью возбудителя к соляной кислоте, которая есть в нашем желудке. Если кислотность понижена (например, при атрофическом гастрите) или соляная кислота значительно разведена (при употреблении большого количества жидкости), количество вибрионов, необходимое для инфицирования, снижается в 100 тысяч раз.

Лучше всего вибрион размножается при температуре 30-40°С, поэтому его особенно много в водоемах Индии, Азии и Африки. Возбудитель практически мгновенно погибает при кипячении, при температуре 50 С — в течение 30 минут. Не выносит микроб и высушивание, а прямые солнечные лучи убивают его в течение часа.

На поверхности овощей и фруктов, например, арбузов, вибрион может жить до 5 суток. Единственный источник распространения инфекции — больной человек или вибрионоситель из региона, неблагополучного по холере, выделяющий возбудителя с фекалиями или рвотными массами. Такой способ передачи эпидемиологи называют фекально-оральным.

Что при этом происходит?

Основные события начинают развиваться в организме человека, когда критическая масса вибрионов попадает из желудка в тонкую кишку. Здесь тепло и влажно, среда уже щелочная, что вполне подходит для массового размножения микроорганизмов-вредителей.

Инкубационный период длится от нескольких часов до 2-3 дней.

В ходе своей бурной жизнедеятельности вибрионы вырабатывают токсин — холероген. Этот токсин вызывает интенсивное выделение жидкости из тканей в просвет тонкой кишки. И начинается мощнейший, так называемый профузный понос. А общая интоксикация вызывает неукротимую рвоту. Человек начинает изливать из себя огромное количество жидкости.

Клиническая выраженность зависит от многих факторов — состояния организма, количества попавших внутрь возбудителей и т.п. При стертых формах возможен однократный жидкий стул, а также слабые проявления интоксикации. Существует также бессимптомная форма носительства — когда человек не чувствует себя больным, но выделяет во внешнюю среду огромное количество возбудителей.

Классическая картина холеры — это частый, до 10 и более раз в сутки, понос. Потеря жидкости колоссальна — до 20 литров в сутки, причем в каждом миллилитре содержится до миллиарда вибрионов.

В результате массивной потери жидкости происходит сгущение крови и обезвоживание организма. Состояние больного быстро и резко ухудшается. Из-за потери с жидкостью микроэлементов появляются мышечные судороги, чаще всего — начиная с икроножных мышц.

При отсутствии лечения современными средствами половина больных погибает в течение первых суток.

Диагностика

Диагностика холеры во время эпидемической вспышки не представляет трудностей и основана, по большей части, на клинических проявлениях. Диагноз первых случаев требует бактериологического подтверждения — выделением возбудителя в рвотных или каловых массах. Главное в мероприятиях по обузданию вспышки — изоляция заболевших и дезинфекция источников распространения возбудителей.

Лечение

Лечение проводится в инфекционных стационарах, хотя из-за редкости передачи заболевания непосредственно от больного человека к здоровому эксперты ВОЗ считают возможным размещать подобных пациентов в обычных терапевтических палатах. Следует отметить, что в последнее время до 90% холеры протекает в легкой форме.

Основа лечения — восполнение потери жидкости и микроэлеметов, поддержание водно-электролитного и кислотно-щелочного балансов в организме. Антибиотики — лишь дополнительное средство лечения, вибрион до сих пор чувствителен к обычному тетрациклину. Благодаря комплексной терапии смертность от холеры в настоящее время не превышает 1%.

Профилактика

Перенесенная инфекция не оставляет после себя стойкого иммунитета, и повторное заражение холерой возможно в любой период жизни, да и попытки создать эффективную вакцину пока бесплодны. Эффективность вакцинации в настоящее время оценивается в 25-50% при длительности действия 3-6 месяцев, хотя появлялись сообщения и о создании более эффективной вакцины.

Основные меры профилактики при посещении неблагоприятных по холере районов — мыть руки перед едой и приготовлением пищи, а также после посещения туалета. Пить только кипяченую воду, овощи и фрукты после мытья проточной водой обязательно обдавать кипятком; исключить покупку продуктов у случайных лиц; купаться только в разрешенных местах.

Попков В. М., Чеснокова Н. П., Ледванов М. Ю.,

Холера представляет собой острое диарейное заболевание, индуцируемое токсигенными штаммами Vibrio cholerae серогруппы 01, включающей классический биовар Эльтора, а также серогруппы 0139.

Характерной особенностью холерных вибрионов является их способность заселять тонкий кишечник с последующим развитием острого воспалительного процесса и диареи. Селективность повреждения тонкого кишечника обусловлена продукцией возбудителями холеры адгезивных молекул, включающих токсинорегулируемые пили (toxin coregulated pilus) или TCP, маннозофукорезистентные и маннозочувствительные гемагглютинины–адгезины, а также белки внешней мембраны с выраженными адгезивными свойствами.

Как стало очевидно в последние годы, TCP – это белок, состоящий из повторяющихся субъединиц с ММ 20,5 кД, продуцируемый серогруппами возбудителей холеры 01 и 0139. Обнаружены определенные различия аминокислотных последовательностей TCP различных серогрупп и биоваров Vibrio cholerae [17]. Вслед за адгезией к энтероцитам и колонизацией тонкого кишечника Vibrio cholerae возникают интенсивная продукция и секреция холерного токсина – СТ (Cholera toxin).

Описание структуры и биологических свойств холерного токсина приведено в ряде монографий и обзорных работ [4, 8, 11, 10, 17].

В настоящее время известно, что СТ – белок с ММ 84 кД, состоящий из 1 субъединицы А и 5 субъединиц В. Субъединица А с ММ 27,2 кД состоит из 2 пептидов – А1 и А2, отвечающих за токсическую активность всей молекулы.

Комплекс В–субъединиц (ММ 58 кД) обеспечивает связывание токсина с клеточным рецептором – ганглиозидом Gm1 энтероцитов, несет антигенные детерминанты, вызывает развитие мукозальных иммунных реакций и синтез IgA.

В последние годы описаны два семейства токсинов (ST), являющихся причиной диареи при кишечных инфекциях (STа и STв). STа–токсины продуцируются самыми разнообразными бактериями, вызывающими заболевания желудочно-кишечного тракта: энтеротоксигенными E. coli, Vibrio cholerae, Vibrio mimicus, Yersinia enterocolitica, Citobacter freundii, Klebsiella spp.

STа транслируются в виде молекулы – прекурсора, которая после двукратного расщепления в процессе созревания выделяется во внешнюю среду. Зрелые ST – небольшие пептиды, содержащие от 19 до 53 аминокислотных остатков. Токсины, относящиеся к семейству STа, имеют на С-конце последовательность из 13 аминокислотных остатков, определяющую токсичность и термостабильность токсина. 6 остатков цистеина, объединенных 3 дисульфидными мостиками в составе данного домена, обусловливают токсичность этой молекулы.

Связывание STа со специфическим клеточным рецептором приводит к активации мембраноассоциированной гуанилатциклазы, которая, в свою очередь, превращает внутриклеточный ГМФ в циклический ГМФ. Возрастание в энтероцитах уровня ц-ГМФ сопровождается подавлением адсорбции ионов натрия и увеличением секреции ионов хлора. Изменение ионных потоков приводит к развитию секреторной диареи [8].

Как известно, особенностями холерной инфекции являются взаимопотенцирующие эффекты холерного токсина и эндотоксина (ЛПС), а также ферментных факторов патогенности, продуцируемых возбудителями холеры.

Ферменты холерного вибриона представляют собой термолабильные белки. Наиболее значимыми в дезорганизации биологических мембран и межклеточного матрикса в динамике холерной инфекции являются протеаза, коллагеназа, эластаза, фибринолизин, муциназа, амилаза [1, 2].

Касаясь молекулярно-клеточных механизмов патогенного действия основных токсических факторов возбудителей холеры, следует отметить ряд общепринятых концепций и современные взгляды относительно цитокинопосредованных биологических эффектов холерных токсинов. Установлено, что цитопатогенные эффекты холерного токсина связаны прежде всего с его способностью фиксироваться на клеточных рецепторах энтероцитов, включающих ганглиозид Gm1.

Однако рецепция холерного токсина может осуществляться и другими клеточными элементами, в частности, клетками печени, щитовидной железы, жировыми клетками, эритроцитами, тромбоцитами.

В течение 30 минут после контакта экзотоксина с рецептором происходят образование комплекса токсинганглиозид, гидролиз токсина на субъединицы А и В, формирование в мембране клеток канала при участии В–пептидных цепей и рецептора, транслокация токсической субъединицы А по указанному каналу на внутреннюю поверхность мембраны клеток с последующей диссоциацией ее на пептидные цепи [11, 17].

Пептид субъединицы А холерного токсина представляет собой фермент АДФ-рибозилтрансферазу, который катализирует отщепление АДФ–рибозы от НАД и перенос ее на белки, регулирующие функции других ферментов, в частности, ГТФ-азу. После АДФ-рибозилирования ГТФ-аза утрачивает специфическую активность, образует комплекс с ГТФ, обеспечивающий активацию аденилатциклазы и резкое увеличение цАМФ в энтероцитах [1, 2].

Значение цАМФ в развитии мукозального адъювантного ответа под влиянием холерного токсина отмечено и в более поздней работе.

Таким образом, сопоставляя приведенные выше данные, следует отметить две точки зрения на механизмы развития холерной диареи: либо через увеличение активности мембраноассоциированной гуанилатциклазы и уровня цГМФ в энтероцитах, либо за счет активации аденилатциклазной системы и возрастания в клетках цАМФ. Не исключена возможность взаимодействия двух указанных механизмов, индуцируемых холерным токсином.

Известно, что в динамике заболевания холерой биологические эффекты холерного токсина потенцируются при участии ЛПС. Детальная характеристика молекулярно-клеточных механизмов действия ЛПС представлена выше. Установлено, что токсичность О-антигена холерного вибриона коррелирует с содержанием глюкозамина [3].

В последнее время появились данные о том, что биологические эффекты ЛПС и холерного токсина опосредуются за счет внутриклеточного образования стереотипных мессенджеров, причем большинство экспериментов было выполнено в указанном направлении с использованием возбудителя холеры серогруппы 01. Однако в последнее время показана цитокинопосредованная патогенность и для возбудителей холеры серогруппы 0139 [21]. Так, при изучении влияния ЛПС и холерного токсина на активность макрофагов установлено, что каждый из токсинов индуцировал выделение ИЛ-1-бета. Вместе с тем выявлены и особенности их действия. ЛПС индуцировал выделение IL-12, а холерный токсин – экспрессию CD80–86 [19]. В другой работе установлена дозозависимая стимуляция синтеза IL-12 и TNF-альфа макрофагами под влиянием холерного ЛПС. Использование миметика ц-АМФ блокировало синтез обоих цитокинов макрофагами, подвергаемыми микробной стимуляции. В то же время установлено, что холерный токсин индуцирует образование мукозальными эпителиальными клетками цитокинов – Il-1, IL-6, IL-8, а также вызывает образование макрофагами IL-1 и IL-12 [20].

Между тем, IL-12 оказывает адъювантное действие на антигенные свойства холерного токсина, усиливает его эффекты на образование интерферона-гамма и IL-10 в легких и селезенке.

Показано, что инкубация альвеолярных макрофагов с холерным токсином ингибировала как базальную, так и ЛПС-стимулированную активность фосфолипазы А2. В последнее время описан ИЛ-17, полученный из Т-клеток. Оказалось, что холерный токсин, подобно Pg E2 и миметикам цАМФ, подавляет IL-17-индуцированное освобождение TNF-альфа.

В работах последних лет установлено, что при участии А-компонента холерного токсина обеспечивается дозозависимое ингибирование продукции IL-12 макрофагами на уровне генной транскрипции. В то же время очищенный В–компонент токсина оказывает менее выраженное аналогичное действие. Холерный токсин ингибирует выделение TNF моноцитами, но не влияет на выделение IL-10, IL-6, Pg E2.

Обращает на себя внимание тот факт, что в динамике развития холеры, наряду с доминирующим в клинике диарейным синдромом, возникают резкие нарушения коагуляционного потенциала, реологических свойств и клеточного состава периферической крови.

Как показали результаты экспериментов, проведенных на различных моделях холерной интоксикации, общими закономерностями расстройств гемостаза при холерном эндотоксикозе у высокочувствительных и относительно резистентных животных являются развитие прогрессирующей недостаточности внутреннего и внешнего механизмов формирования активности протромбиназного фактора, активация антикоагулянтных механизмов и системы фибринолиза, истощение запасов фибриногена на ранних стадиях холерной интоксикации, индуцируемой введением ЛПС или сочетанным воздействием токсинов возбудителей холеры.

Развитие холерного эндотоксикоза у высокочувствительных животных сопровождается формированием более глубоких и пролонгированных сдвигов коагуляционного потенциала крови, чем у относительно резистентных животных, вплоть до полного истощения внутреннего и внешнего механизмов формирования активного протромбиназного комплекса, развития афибриногенемии.

Холерный энтеротоксин при комплексном воздействии его с холерным ЛПС на высокочувствительных животных оказывает выраженный модулирующий и потенцирующий эффекты на сдвиги коагуляционного потенциала крови, свойственные ЛПС – интоксикации. На фоне комбинированного введения токсинов высокочувствительным животным возникает более выраженный дефицит плазменных факторов свертывания крови, обеспечивающих каскадную активацию протромбиназы, а также истощение активаторов плазминогена и запасов фибриногена.

На различных моделях холерной интоксикации показано, что в роли индуктора системных расстройств микроциркуляции, гемореологии, коагуляционного потенциала крови выступает эндотоксин. Системные патогенные эффекты эндотоксина усиливаются воздействием эндотоксина, обеспечивая в то же время сенсибилизацию кишечника к повреждающему воздействию холерогена за счет дегрануляции тучных клеток и освобождения вазогенных провоспалительных цитокинов [12, 13, 26, 27, 28, 29].

Нарушения реологических свойств крови при холерной ЛПС-интоксикации у высокочувствительных животных в достаточной мере обратимы. Оптимальный эффект коррекции вязкостных свойств крови и состояния эритроцитарных мембран достигнут при комплексном использовании глюкокортикоидов, антиоксидантов, мембранопротекторов, ингибиторов протеаз [13, 14].

Ведущая роль в патогенезе расстройств коагулогемостаза и реологических свойств крови при холере в соответствии с результатом проведенных нами экспериментов должна быть отведена активации свободнорадикального окисления и соответственно системной дезинтеграции биологических мембран.

Как оказалось, холерная ЛПС–интоксикация характеризуется активацией процессов липопероксидации, сочетающейся у относительно резистентных животных с дозозависимой недостаточностью ферментного звена антиоксидантной системы, а у высокочувствительных к действию ЛПС животных – с прогрессирующей активацией ферментов антиоксидантной системы. Холерный токсин оказывает модулирующее воздействие ЛПС на активность СОД и каталазы при сочетанном воздействии токсинов на относительно резистентных и высокочувствительных животных, не влияя существенно на уровень продуктов липопероксидации в крови [12, 13, 14, 26, 27, 28, 29].

Достигнута положительная динамика патоморфологических сдвигов микроциркуляции, а также гемореологии и активации процессов липопероксидации в динамике холерной интоксикации, индуцируемой комплексным введением ЛПС и экзотоксина или ЛПС под воздействием мембранопротекторов, антиоксидантов, препаратов антипротеазного действия, адреномодуляторов. Последнее указывает, с одной стороны, на патогенетическую значимость активации процессов липопероксидации в механизмах потенцирования цитопатогенных эффектов холерных токсинов, а с другой стороны – открывает перспективы в использовании новых принципов медикаментозной коррекции метаболических и гемореологических сдвигов при холерной инфекции и интоксикации.

Глава 25. Возбудители холеры

Вид Vibrio cholerae относится к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio.

Возбудители холеры представлены двумя биоварами. Биовар V. cholerae выделен и изучен Р. Кохом (1883) и биовар eltor выделен Ф. Готшлихтом (1906). В течение длительного времени биовар Эль-Тор не считали возбудителем холеры. В 1962 г. по решению ВОЗ он был признан биоваром вибриона холеры.

В последнее время из воды и других объектов внешней среды выделены НАГ-вибрионы, которые еще не получили окончательного наименования, но их роль в острых кишечных заболеваниях установлена. Природа НАГ-вибрионов изучается. По морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам они не отличаются от холерных вибрионов, имеют с ними общий Н-антиген. О-антигены у них разные. По О-антигену установлен 60 О-групп НАГ-вибрионов.

Морфология. Холерные вибрионы - небольшие (1-3 × 0,2-0,4 мкм) слегка изогнутые палочки, имеют вид запятой, очень полиморфны. На искусственных питательных средах, особенно в старых культурах, они могут иметь вид шаров, зерен, нитей, спиралей. Холерные вибрионы очень подвижны. Монотрихи - жгутик в несколько раз превышает длину клетки. Спор и капсул не образуют. Грамотрицательны. В окрашенных мазках располагаются в виде стаи рыб (см. рис. 51). При электронной микроскопии установлено, что между стенкой и цитоплазмой находятся вакуоли. Считают, что в этих вакуолях синтезируется экзотоксин.

Культивирование. Холерные вибрионы - факультативные анаэробы. К питательным средам неприхотливы. Щелочелюбивы. Размножаются при температуре 37-39° С и рН 8-9. Хорошо растут на МПА и МПБ. Элективной средой является щелочная 1% пептонная вода. На поверхности этой среды они образуют нежную голубоватую пленку. На плотной среде TBRS (тиосульфатцитратсахарозный агар с добавлением солей желчи) образуются колонии желтого цвета на фоне голубоватой среды. Размножаются быстро: в жидких питательных средах 6-8 ч, на плотных - 12-14 ч (на щелочных средах рост холерных вибрионов опережает рост других бактерий). Холерные вибрионы диссоциируют из S- в R-форму. Этот процесс сопровождается изменением антигенной структуры.

Ферментативные свойства. Холерные вибрионы биохимически активны. Они обладают сахаролитическими, протеолитическими и диастатическими свойствами. Сахаролитические свойства выражаются в расщеплении Сахаров до образования кислоты. Ферментация глюкозы, сахарозы, маннита, маннозы и отсутствие ферментации арабинозы являются важным диагностическим признаком. Протеолитические свойства: холерные вибрионы разжижают желатин, разлагают триптофан до образования индола, продуцируют оксидазу, восстанавливают нитраты в нитриты, свертывают молоко. Сероводород не образуют. Диастатические свойства выражаются в расщеплении растворимого крахмала.

Холерный вибрион продуцирует ферменты патогенности: фибринолизин, плазмокоагулазу, гиалуронидазу, лецитиназу, коллагеназу и др.

Токсинообразование. Холерные вибрионы продуцируют токсины трех типов. Токсин I типа - эндотоксин, выделяется при разрушении микробной клетки, термостабилен (липополисахарид). Считают, что он способствует развитию антибактериального иммунитета. Токсин И типа - экзотоксин (холероген) термолабилен, обладает энтеротоксическим действием и играет важную роль в патогенезе холеры (усиливает функцию секреторных клеток тонкого кишечника, что приводит к обезвоживанию организма). Токсин III типа термостабилен, считают, что он подавляет активный транспорт натрия через эпителий кишечника.

Антигенная структура. Холерные вибрионы имеют термостабильный соматический О-антиген и термолабильный Н-антиген. Н-антиген не специфический и является общим для всего рода Vibrio. О-антиген обладает видовой и типовой специфичностью. По О-антигену холерные вибрионы делят на 54 группы. Vibrio cholerae и Vibrio eltor относятся к О1 группе. Внутри О1 группы различают три компонента - А, В, С, по сочетанию которых выделяют три серовара. Сочетание АВ - серовар Огава, сочетание АС - серовар Инаба, сочетание ABC - серовар Гикокшима.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При температуре 60° С холерные вибрионы погибают в течение 5 мин, при кипячении - мгновенно. Низкие температуры они переносят хорошо. Во льду сохраняются несколько месяцев, в морской и речной воде - несколько недель, в кишечнике мух - 4-5 дней. К высушиванию и солнечному свету холерные вибрионы очень чувствительны. Общепринятые концентрации дезинфицирующих веществ убивают их быстро. Однако при работе с возбудителем холеры пользуются дезинфицирующими растворами большей концентрации. Холерные вибрионы чувствительны к кислотам (хлороводородной кислоте и др.). Вибрион холеры Эль-Тор более устойчив.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не болеют холерой. В экспериментальных условиях внутрибрюшинное введение холерных вибрионов кроликам и морским свинкам сопровождается выраженным токсикозом, который приводит их к гибели.

Источники инфекции и пути передачи. Единственным источником холеры является человек, который выделяет вибрион холеры во внешнюю среду в период заболевания либо носительства. При холере, вызванной вибрионом Эль-Тор, отмечается длительное носительство. Заражение человека происходит через продукты (овощи, фрукты), воду и другие объекты внешней среды.

Холера - это давно известная инфекция, которая периодически распространялась на многие страны и континенты и вызывала гибель миллионов людей. Известны несколько пандемий холеры. В 1917-1926 гг. было зарегистрировано 6 пандемий холеры. Эти пандемии вызывались классическим вибрионом Коха. В 60-х годах XX века начал распространяться возбудитель холеры вибрион Эль-Тор. В 70-х годах зарегистрированы случаи холеры, вызванные вибрионом Эль-Тор в некоторых городах Советского Союза.

Патогенез. Заражение происходит через рот. Попав в желудок, часть холерных бактерий гибнет в кислой среде желудка, а часть проникает в кишечник, где щелочная среда и обилие продуктов распада белков (в частности, пептон) способствуют их размножению.

На слизистой оболочке тонкой кишки накапливается большое количество холерных вибрионов и токсина, образующегося при их разрушении. Токсин нарушает функцию Слизистой оболочки, она гиперемируется, увеличивается проницаемость эпителия кишечника, нарушается секреторная и всасывающая функция его. Появляются профузные поносы, повторные рвоты, которые выводят из организма большое количество воды и солей (калия и натрия). Потеря большого количества жидкости и солей приводит к высушиванию ткани, сгущению крови, нарушению минерального обмена, поражению центральной и вегетативной нервных систем и других явлений интоксикации. От степени интоксикации зависит форма холеры, которая протекает в виде холерного энтерита, гастроэнтерита, альгидной и сухой формы (см. учебник инфекционных болезней).

Иммунитет. Стойкий, носит антимикробный и антитоксический характер, связанный с наличием агглютининов, вибриолизинов, антитоксинов и других антител. Кроме того, в иммунитете большое значение придают факторам местной защиты.

Профилактика. Проведение общих противоэпидемических мероприятий: раннее выявление больных, изоляция и госпитализация, дезинфекция, обсервация; охрана водоисточников, надзор за пищевыми продуктами, охрана границ при эпидемических вспышках и т. п. Для специфической профилактики используют убитую холерную вакцину (холероген-анатоксин в сочетании с О-антигеном холерного вибриона).

Лечение. Антибиотики тетрациклинового ряда, а также введение жидкости и электролитов (солей калия и натрия).

1. Какова морфологическая характеристика холерного вибриона? Какие Вы знаете биовары холерного вибриона?

2. Какая среда является элективной и средой накопления?

3. Каковы условия выращивания и культуральные свойства холерных вибрионов?

4. Каковы ферментативные свойства холерных вибрионов?

5. Какие токсины образуют холерные вибрионы?

Холерные вибрионы очень чувствительны к дезинфицирующим веществам, поэтому в посуде, куда помещают исследуемый материал, не должно содержаться даже следов дезинфицирующих веществ. Время от взятия материала до проведения посевов не должно превышать 3 ч. Лучше материал сразу брать в 1% пептонную воду, являющуюся средой накопления (можно использовать другие среды накопления - щелочную консервированную жидкость с морской солью и др.).

Цель исследования: выявление холерного вибриона и определение его серовара.

2. Рвотные массы.

3. Секционный материал.

Кроме того, обязательно исследуют воду, пищевые продукты и смывы с объектов внешней среды.

Способы сбора материала

При массовых обследованиях по эпидпоказаниям для выявления носительства можно делать групповые посевы. Материал от 4-5 обследуемых засевают в одну колбу с 100 мл 1% пептонной воды (исследование ведут как один анализ). При положительном ответе материал снова берут и засевают индивидуально.

При пересылке исследуемого материала банки с материалом плотно укладывают в металлическую посуду (бюкс, кастрюлю), прилагают сопроводительный документ с перечислением отправляемых материалов, указанием предполагаемого диагноза, времени и места взятия материала и фамилией собиравшего материал.

Исследование проводят поэтапно. Интервалы между этапами должны быть максимально короткими. Пересевы на жидкие среды проводят через 6-8 ч, а на плотные - через 12-18 ч (поэтапное исследование требует круглосуточной работы).

Этап I

Через 6-8 ч посевы на 1% пептонной воде вынимают из термостата. Пленку или материал с поверхности среды засевают на вторую пептонную воду и делают мазок, фиксируют, окрашивают карболовым фуксином и по Граму. Микроскопируют. Если в мазках обнаруживают сходные с холерным вибрионом подвижные бактерии, то ставят ориентировочную реакцию агглютинации с сывороткой. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю О-сыворотки, разведенной в 100 раз. Контролем служит капля изотонического раствора натрия хлорида. В обе капли вносят материал из пленки и тщательно эмульгируют. При наличии в капле сыворотки агглютинации и отсутствии ее в контроле пленку засевают на щелочной агар и инкубируют в термостате.

Через 12-14 ч вынимают посевы из термостата. Изучают рост посевов на плотной питательной среде. При наличии подозрительных колоний отбирают не менее пяти и ставят реакцию агглютинации с О-сывороткой, разведенной 1:100, при наличии положительной реакции агглютинации можно поставить ориентировочную реакцию агглютинации с типовыми сыворотками Огава и Инаба (в разведении 1:50). Наличие положительной агглютинации при типичной морфологии и культуральных свойствах дает право дать предварительный положительный ответ.

Кроме этого материал из типичных колоний (давших положительную реакцию агглютинации) высевают на полиуглеводную среду (содержит 2-3 сахара) для выделения чистой культуры, а также в бульон.

Бульон инкубируют 3-4 ч при 37° С. С молодой бульонной культурой ставят развернутую реакцию агглютинации.

Через 12-14 ч вынимают посевы из термостата. На полиуглеводной среде изменяется цвет столбика (расщепление сахарозы). Скошенная часть не изменяется. Полученную культуру идентифицируют.

Идентификация культуры производится по следующим тестам.

1. Изучение морфологических свойств, подвижности висячей и раздавленной капле).

2. Изучение культуральных свойств.

3. Изучение антигенных свойств (в реакции агглютинации).

4. Изучение сахаролитических свойств.

5. Определение протеолитических свойств.

6. Определение гемолитических свойств.

7. Определение уреазной активности.

8. Изучение восстановительных свойств (реакция холера-рот).

9. Изучение диастатической активности.

10. Постановка реакции Фогеса - Проскауэра.

11. Проба на оксидазу.

12. Определение чувствительности к фагам.

13. Определение чувствительности к полимиксину.

Изучение морфологических свойств, подвижности и культуральных свойств проводят с первых этапов исследования.

Определение антигенных свойств. Ставят развернутую реакцию агглютинации с видоспецифической холерной О-сывороткой и типоспецифическими сыворотками Огава и Инаба.

Реакцию ставят в объеме 1 мл. Сыворотки разводят начиная с 1:50 до титра. К каждому разведению добавляют по 2 капли выделенной культуры, реакцию сопровождают контролем сыворотки и контролем культуры. Учитывают реакцию через 18-20 ч. Положительная реакция должна быть не менее половины титра сыворотки.

Ферментацию углеводов определяют на средах Гисса. Результаты учитывают через 6-14 ч. Расщепление глюкозы, сахарозы, маннита, мальтозы и манозы при отсутствии ферментации арабинозы является диагностическим показателем.

Протеолитические свойства определяют путем посева выделенной культуры в столбик желатина; инкубируют при 22° С 2-3 дня. Положительная реакция выражается в воронкообразном разжижении желатина.

Гемолитические свойства определяют путем добавления к 1 мл 24-часовой бульонной культуры 1 мл 1% взвеси эритроцитов барана. Контролем служит 1 мл бульона + 1 мл 1% взвеси эритроцитов. Обе пробирки инкубируют 2 ч при 37° С. Затем переносят на холод.

Учет производят через 16 ч. При положительном результате в опытной пробирке (V. eltor) эритроциты гемолизируются (лаковая кровь), в контрольной - неизмененная взвесь эритроцитов. V. cholerae гемолиза не вызывает.

Уреазную активность определяют посевом выделенной культуры на среду с мочевиной. Положительный результат характеризуется изменением желтого цвета среды в красный.

Изучение восстановительных свойств (реакция холера-рот). Холерные вибрионы восстанавливают нитраты в нитриты. При добавлении к 24-часовой культуре концентрированной серной кислоты из расчета 2-3 капли на 1 мл культуры освобождается азотистая кислота, которая, связываясь к индолом, образует новое соединение (нитрозоиндол). Среда окрашивается в рубиново-красный цвет.

Диастатическую активность определяют на среде Кодама, содержащей растворимый крахмал. Индикатором служит раствор Люголя. Холерные вибрионы расщепляют крахмал, поэтому цвет среды после прибавления раствора Люголя не изменяется.

Реакция Фогеса - Проскауэра. Исследуемую культуру засевают в среду Кларка. Посев ставят в термостат. После 2-3 дней инкубации посевы вынимают из термостата и к 1 мл выросшей культуры добавляют 0,6 мл α-нафтола и 0,2 мл 40% раствора гидроксида натрия. Положительная реакция характеризуется появлением красного окрашивания (за счет ацетилметилкарбинола).

Проба на оксидазу. На поверхность 18-часовой агаровой культуры наносят каплю 1% водного раствора параамино-диметиланилина (гидрохлорида или оксалата), добавляют каплю 1% спиртового раствора α-нафтола. При положительной реакции на оксидазу через 2-3 мин культура окрашивается в ярко-синий цвет.

Определение чувствительности к фагам. Исследуемую культуру засевают на щелочной агар и наносят бактериофаг С Мукерджи IV типа и бактериофаг Эль-Тор. Реакцию учитывают через 14-16 ч (см. главу 8; табл. 40).

Таблица 40. Чувствительность к холерным фагам

Примечание. + лизируется; - не лизируется.

Определение чувствительности к полимиксину. В расплавленный и остуженный агар добавляют полимиксин (из расчета 50 ед. в 1 мл среды). Среду размешивают и разливают в чашки Петри. На застывшую среду петлей засевают выделенную культуру и инкубируют в термостате. Через 8-10 ч вынимают посевы из термостата. Холерные вибрионы не растут в присутствии полимиксина. Вибрионы Эль-Тор вырастают (табл. 41).

Таблица 41. Дифференциальные свойства V. cholerae, V. eltor и нехолерных вибрионов

Реакция иммобилизации. На предметное стекло наносят 2 капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды. К 1-й капле добавляют одну каплю О-сыворотки (1:100), ко 2-й - каплю изотонического раствора натрия хлорида. Каждую каплю эмульгируют пастеровской пипеткой или петлей, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. При положительном результате в первой капле прекращается движение вибрионов (действие специфической сыворотки), во второй наблюдается движение.

Люминесцентно-серологический метод. См. главу 2.

1. Каковы основные методы идентификации холерных вибрионов?

2. Результаты каких исследований дают право дать предварительный ответ?

3. Какие методы служат для дифференциации классического холерного вибриона от вибриона Эль-Тор?

4. На чем основан ускоренный метод иммобилизации холерных вибрионов?

1% пептонная вода. На 1 л дистиллированной воды берут 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 0,1 г нитрата калия и карбоната натрия до установления рН 9,0. Полученную среду разливают во флаконы и пробирки. Стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120° С.

Щелочной агар. К 1л МП А добавляют 30 мл 10% раствора карбоната натрия, кипятят 45 мин, устанавливают рН 8,0-9,0. Разливают во флаконы и пробирки. Стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120° С.

Среда Кларка. 5 г двузамещенного фосфата калия, 5 г пептона, 5 г глюкозы растворяют в 1 л дистиллированной воды. Среду доводят до кипения, фильтруют, разливают в пробирки. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин.

Среда ТСВ. Сухая среда (рН 8,6) выпускается фирмой Дифко (США).