Наборы для диагностики брюшного тифа

Диагностикум Ви-антигенный эритроцитарный сальмонеллезный жидкий для РПГА. (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера)

Набор реагентов "Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный для РПГА" (СЭД-Vi)

Набор реагентов предназначен для выявления антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа в сыворотках крови в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

При наличии антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа наблюдается гемагглютинация куриных эритроцитов, сенсибилизированных Vi-антигеном. Это приводит к образованию на дне лунок планшета с U-образным дном "зонтика" из осевших эритроцитов. При отсутствии антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа осевшие эритроциты образуют "точку".

Набор рассчитан на исследование 42 сывороток крови в варианте скрининга или 10 сывороток крови в варианте их раститровки.

Набор предназначен только для in vitro диагностики. Компоненты набора безопасны, однако исследуемые сыворотки крови, а также находившиеся с ними в контакте реагенты, оборудование и инструменты могут представлять собой потенциально инфекционный материал. При работе с ними следует принимать следующие меры предосторожности:

* работать в резиновых перчатках;

* после завершения работы исследуемые образцы сыворотки крови, находившиеся с ними в контакте реагенты и инструменты дезинфицировать растворами 6 % перекиси водорода или 70 % этилового спирта, или 3 % хлорамина Б в соответствии с СП 1.3.2322-08.

При работе с набором следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).

Подготовка исследуемых образцов

Исследуемые образцы сыворотки крови хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 3 суток от момента взятия крови. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре минус 18 °С и ниже не более 1 года. Перед использованием образцы размораживают при комнатной температуре и перемешивают встряхиванием. Повторное замораживание не допускается. Нельзя использовать образцы с выраженным бактериальным проростом.

Подготовка контрольной сыворотки (К+)

Готовят рабочий раствор сыворотки сальмонеллезной адсорбированной рецептор Vi (К+) в разведении 1:10. Для этого содержимое флакона с К+ растворяют добавлением 1 мл раствора ФБР. Хранят (аликвотами по 0,2 мл) в замороженном состоянии при температуре минус 18 °С и ниже не более 6 месяцев.

Подготовка эритроцитарного диагностикума (СЭД)

К содержимому флакона с СЭД добавляют 0,6 мл дистиллированной воды и оставляют для гидратации на 2 ч при комнатной температуре. Затем к раствору добавляют 2,4 мл раствора ФБР. Хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 6 месяцев. Замораживание не допускается.

Постановка РПГА при скрининге сывороток

Сыворотки крови для скринингового исследования разводят в парных лунках планшета (на каждую сыворотку используется две лунки) следующим образом:

* предварительные разведения 1:20 готовят в первых лунках, внося в них сначала по 190 мкл раствора РИП, а затем - по 10 мкл исследуемых сывороток, и перемешивают трехкратным пипетированием (цвет растворов в лунках после добавления сывороток должен измениться с сине-фиолетового на зеленый);

* скрининговые разведения 1:40 готовят во вторых лунках, внося в них сначала по 25 мкл раствора ФБР, а затем - по 25 мкл предварительно разведенных сывороток, и перемешивают трекратным пипетированием.

При каждой постановке РПГА необходимо проводить контрольное определение титра К+. Для этого в 8 лунок длинного ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР. Затем в первую лунку вносят 50 мкл рабочего раствора К+, перемешивают пипетированием и переносят в следующие лунки по 50 мкл, получая 2-кратные разведения от 1:20 до 1:2560. Еще в 4 лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР для контроля СЭД на отсутствие спонтанной агглютинации.

В лунки со скрининговыми разведениями исследуемых сывороток и контролями вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! После внесения СЭД содержимое лунок перемешивают постукиванием о край планшета. Планшет выдерживают при комнатной температуре в течение 30 - 40 минут.

Учет результатов при скрининге сывороток крови

Учет результатов проводят по условной шкале четырех крестов:

* ++++ (4+) - эритроциты образуют на дне лунки перевернутый "зонтик", края его опадают;

* +++ (3+) - эритроциты образуют на дне лунки перевернутый "зонтик", края его ровные;

* ++ (2+) - эритроциты образуют на дне лунки тонкое кольцо;

* + (1+) - эритроциты образуют на дне лунки плотное кольцо или диск;

* (-) - эритроциты образуют на дне лунки точку.

Положительным результатом считают гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат 4 лунки контрольного ряда, в которые вносили только раствор ФБР и СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной агглютинации (-). В этом случае следует повторить исследование. Если при повторном исследовании появляется агглютинация, то препарат не используют.

Сыворотки с отрицательным результатом следует считать не содержащими антител к Vi-антигену в диагностическом титре 1:40 и ниже.

Сыворотки, дающие положительный результат в разведении 1:40, необходимо исследовать повторно в варианте с раститровкой сыворотки для установления ее титра.

Результаты можно считать достоверными только в том случае, если титр прилагаемой контрольной сыворотки (К+) не ниже, чем ½ титра, указанного на ее этикетке.

Поствновка РПГА при раститровке сывороток крови

Раститровку исследуемых сывороток и рабочего раствора К+ проводят в коротких рядах планшета. Еще один короткий ряд используют для контроля на отсутствие спонтанной агглютинации СЭД.

В первые лунки коротких рядов для раститровки исследуемых сывороток вносят 180 мкл раствора РИП. Во все остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки короткого ряда для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки с раствором РИП вносят 20 мкл исследуемых сывороток. Каждую сыворотку вносят индивидуальным наконечником и перемешивают раствор в лунке трехкратным пипетированием (цвет растворов в лунках должен измениться с сине-фиолетового на зеленый).

В первую лунку короткого ряда для раститровки К+ вносят 100 мкл рабочего раствора К+, в остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

Затем из первых лунок коротких рядов для исследуемых сывороток и контрольной сыворотки переносят по 50 мкл в следующие лунки рядов, получая двукратные разведения от 1:20 до 1:1280. В конце титрования из последних лунок растворы в объеме 50 мкл удаляют.

Во все лунки кроме первых лунок каждого короткого ряда вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! После внесения СЭД содержимое лунок перемешивают постукиванием о край планшета. Планшет выдерживают при комнатной температуре в течение 30 - 40 минут.

Учет результатов при раститровке сывороток крови

Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат лунки короткого ряда для контроля СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной агглютинации (-). В противном случае следует повторить исследование с диагностикумом другой серии.

Лица, у которых обнаружены антитела к Vi-антигену в титре 1:40 и выше, рассматриваются как подозрительные на хроническое носительство возбудителя брюшного тифа. Для окончательной постановки диагноза необходимо углубленное бактериологическое обследование.

Условия транспортирования и хранения, срок годности

* Транспортирование в соответствии с СП.3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С. Допускается кратковременное (в течение до 10 сут.) транспортирование при температуре от 10 до 35 °С.

* Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С.

Срок годности - 1 год. По истечению срока годности набор реагентов использованию не подлежит.

Назначение

Набор реагентов "Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный для РПГА" (СЭД-Vi) предназначен для выявления антител к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа в сыворотках крови людей реакцией пассивной гемагглютинации (РПГА).

Характеристика набора

При наличии антител к возбудителю брюшного тифа наблюдается гемагглютинация сенсибилизированных Vi-антигеном куриных эритроцитов, что приводит к образованию на дне U-образных лунок планшета "зонтика" из осевших эритроцитов. При отсутствии антител к возбудителю брюшного тифа осевшие эритроциты образуют "точку".

Наименование реагента	Описание	Количество в наборе
Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный Vi-антигенный, сухой 6 % (СЭД)	Формалинизированные куриные эритроциты, сенсибилизированные Vi-антигеном S.typhi. Сухая гигроскопическая масса коричневого цвета. После растворения — суспензия красно-коричневого цвета.	1 фл., из 0,6 мл
Сыворотка диагностическая сальмонеллезная адсорбированная, рецептор Vi, сухая (в разведении 1:20, (К+))	Кроличья сыворотка сальмонеллезная адсорбированная, рецептор Vi, в разведении 1:20. Сухая гигроскопичная пористая масса белого цвета. После растворения — прозрачная жидкость желтоватого цвета или бесцветная.	1 фл., из 0,3 мл
Разбавитель исследуемых проб (РИП)	Прозрачная жидкость сине-фиолетового цвета.	1 фл., 10 мл
Фосфатный буферный раствор (ФБР)	Прозрачная бесцветная жидкость.	1 фл., 10 мл
Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения	Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения из прозрачного бесцветного полистирола.	1 шт.

Диагностические характеристики

Диагностикум должен агглютинироваться в РПГА сывороткой диагностической сальмонеллезной адсорбированной, рецептор Vi, сухой (в разведении 1:20), до титра, указанного на этикетке сыворотки. Условным уровнем диагностической характеристики сыворотки крови здоровых людей следует считать разведение сыворотки не выше 1:20. Время проведения анализа – 3040 минут. Набор рассчитан на исследование 42 сывороток крови в варианте скрининга или 10 сывороток крови в варианте их титрования.

Набор предназначен только для in vitro диагностики. Входящие в компоненты набора вещества инактивированы и безопасны. При работе с набором следует соблюдать СП 1.3.2322-08 и СанПиН 2.1.7.2790-10.

Оборудование, материалы, растворы:

дозаторы пипеточные 1-канальные с варьируемым объёмом дозирования 5 — 40 мкл; 40 — 200 мкл; 200 — 1000 мкл и 1000 — 5000 мкл;
дозаторы пипеточные 8- или 12-канальные с варьируемым объемом дозирования 5 — 40 мкл и 40 — 200 мкл;
вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72).

Исследуемые образцы сыворотки крови хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 3 суток от момента взятия крови. Допускается хранение сыворотки в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °С не более 1 года. Перед использованием образцы размораживают при температуре от 16 до 25 °С и перемешивают встряхиванием. Повторное замораживание не допускается. Нельзя использовать образцы с бактериальным проростом и гемолизом. Перед постановкой реакции испытуемые сыворотки прогревают при 56 °С в течение 30 минут.

Готовят рабочий раствор сыворотки диагностической сальмонеллезной адсорбированной, рецептор Vi, сухой (в разведении 1:20) из 0,3 мл (К+). Для этого к содержимому флакона с К+ добавляют 0,3 мл фосфатного буферного раствора (ФБР). Оставшееся количество сыворотки можно аликвотировать и хранить в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °С не более 6 месяцев.

Для приготовления рабочего разведения суспензии диагностикума эритроцитарного сальмонеллезного к содержимому флакона с сухим 6 % СЭД добавляют 0,6 мл дистиллированной воды и оставляют для гидратации на 2 часа при температуре от 16 до 25 °С. Затем к раствору добавляют 2,4 мл фосфатного буферного раствора (ФБР). Рабочий раствор хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 мес. Замораживание не допускается.

Сыворотки крови для скринингового исследования разводят в лунках планшета следующим образом:

предварительные разведения 1:20 готовят в первых лунках планшета, внося в них сначала 190 мкл раствора РИП, затем – по 10 мкл исследуемых сывороток. Каждую сыворотку вносят отдельным наконечником и тщательно пипетируют (при этом цвет раствора в лунках после добавления сывороток должен измениться с сине-фиолетового на зеленый);
скрининговые разведения 1:40 готовят во вторых лунках, внося в них сначала по 25 мкл раствора ФБР, а затем по 25 мкл предварительно разведенных сывороток и тщательно пипетируют.

При каждой постановке РПГА необходимо проводить контрольное определение титра К+. Для этого в 8 лунок длинного ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР. Затем в первую лунку вносят 50 мкл рабочего раствора К+ (1:20), тщательно пипетируют и переносят в следующие лунки по 50 мкл, получая 2-кратные разведения от 1:40 до 1:5120. Еще в 4 лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР для контроля СЭД на отсутствие спонтанной гемагглютинации.

Во все лунки планшета со скрининговыми разведениями исследуемых сывороток (кроме первых, содержащих РИП) и контролями вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! Планшет тщательно встряхивают и оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 30 - 40 минут до полного оседания эритроцитов в контроле.

Титрование исследуемых сывороток и рабочего раствора К+ проводят в коротких рядах планшета. Еще один короткий ряд используют для контроля на отсутствие спонтанной гемагглютинации СЭД.

В первые лунки коротких рядов для титрования исследуемой сыворотки вносят 180 мкл раствора РИП. Во все остальные лунки вносят по 50 мкл раствора ФБР.

В лунки с раствором РИП вносят 20 мкл исследуемых сывороток (получают разведение 1:10). Каждую сыворотку вносят своим наконечником и тщательно пипетируют (цвет раствора в лунках должен измениться с сине-фиолетового на зеленый). Затем из первых лунок переносят по 50 мкл в следующие лунки рядов, получая двукратные разведения от 1:20 до 1:1280. В конце титрования из последних лунок растворы в объеме 50 мкл удаляют.

При каждой постановке РПГА необходимо проводить контрольное определение титра К+. Для этого в 8 лунок длинного ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР. Затем в первую лунку вносят 50 мкл рабочего раствора К+ (1:20), тщательно пипетируют и переносят в следующие лунки по 50 мкл, получая 2-кратные разведения от 1:40 до 1:5120.

Для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной гемагглютинации во все лунки короткого ряда вносят по 50 мкл раствора ФБР.

Во все лунки (кроме первых лунок каждого ряда для исследуемых сывороток, содержащих РИП) вносят по 25 мкл СЭД. Суспензию СЭД во флаконе или ванночке перед использованием перемешать! Планшет тщательно встряхивают и оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 30 — 40 минут до полного оседания эритроцитов в контроле.

Учет и интерпретация результатов

Учет результатов проводят по условной шкале четырех крестов. Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее чем на 3 (+++) креста.

Положительным результатом считают гемагглютинацию нагруженных Vi-антигеном эритроцитов не менее, чем на 3 креста (+++).

Контролем качества диагностикума служат 4 лунки контрольного ряда, в которые вносили только раствор ФБР и СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной гемагглютинации — реакция отрицательная (-). В противном случае следует повторить исследование. Если при повторной постановке появляется гемагглютинация, то препарат не используется.

Сыворотки, дающие положительный результат в разведении 1:40, следует исследовать повторно в варианте с титрованием сыворотки для установления ее титра.

Результаты можно считать достоверными только в том случае, если титр прилагаемой контрольной сыворотки (К+) соответствует титру, указанному на этикетке.

Титром сыворотки считается ее разведение, дающее гемагглютинацию не менее, чем на 3 (+++) креста.

Контролем качества диагностикума служат лунки ряда для контроля СЭД. В этих лунках не должно быть спонтанной гемагглютинации — реакция отрицательная (-). В противном случае следует повторить исследование. Если при повторной постановке появляется гемагглютинация, то препарат не используется.

Утилизация отходов после использования набора реагентов осуществляется в соответствии с СанПиН 2.1.7.279010 ("Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами").

Брюшной тиф и паратифы А, В и С являются антропонозными кишечными инфекциями. В настоящее время чаще регистрируется брюшной тиф, реже – паратиф B, редко – паратиф A и крайне редко – паратиф C. Заболевания характеризуются циклическим клиническим течением с выраженной интоксикацией, бактериемией, лихорадкой, язвенным поражением лимфатической системы тонкой кишки, розеолезной сыпью на кожных покровах туловища, гепато- и спленомегалией. Изъязвление пейеровых бляшек подвздошной кишки в 1% случаев приводит к кишечному кровотечению и прободению кишечника с самыми неблагоприятными последствиями для больного. Частота рецидивов при брюшном тифе может достигать 10–15% и несколько реже отмечается при паратифах. Современной особенностью эпидемиологии брюшного тифа является резкое увеличение частоты заноса инфекции с территорий эндемичных по брюшному тифу из стран ближнего и дальнего зарубежья, а также заражение жителей России при выезде в эти страны. У части переболевших может сформироваться хроническое бактерионосительство, которое способствует возникновению новых случаев заражения.

Показания к обследованию

Подозрение на тифопаратифозное заболевание;
лихорадка неясного генеза, продолжающаяся 5 и более дней;
оформление на стационарное лечение в больницы (отделения) психоневрологического (психосоматического) профиля, дома престарелых, интернаты для лиц с хроническими психическими заболеваниями и поражениями ЦНС, в другие типы закрытых учреждений с круглосуточным пребыванием;
поступление на работу и по эпидемиологическим показаниям работников отдельных профессий, производств и организаций;
пациенты, переболевшие брюшным тифом и паратифами, во время диспансерного наблюдения;
больные брюшным тифом и паратифами после исчезновения клинических симптомов перенесенного заболевания перед выпиской из стационара;
хронические бактерионосители, выявленные среди работников отдельных профессий, производств и организаций, при повторном поступлении на работу на указанные предприятия и объекты;
секционный материал при подозрении на заболевание брюшным тифом и паратифами.

Материал для исследований

Кровь, испражнения, моча, желчь (дуоденальное содержимое); соскобы кожных высыпаний (розеол), костный мозг, грудное молоко – культуральные исследования;
сыворотка крови – выявления АТ к АГ сальмонелл групп А, В, С, Д и Vi-антигену.

Этиологическая лабораторная диагностика включает выделение чистой культуры патогена из биологического материала и его идентификацию по культуральноферментативным и антигенным свойствам, выявление АГ возбудителя, определение специфических АТ.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Культуральное исследование имеет приоритетное значение, т.к. в этом случае удается получить наиболее полную информацию о биологических свойствах возбудителя, включая чувствительность к антибактериальным препаратам. Исследование биологического материала включает выделение чистой культуры и идентификацию микроорганизма по культурально-ферментативным и антигенным свойствам. Возбудители относятся к роду Salmonella сероварам: S. typhi (брюшной тиф), S. paratyphi A (паратиф А), S. paratyphi B (паратиф В), S. paratyphi C (паратиф С). Наборы реагентов для выявления АГ возбудителя с использованием методов ИХА и ИФА позволяют достоверно определить только родовую принадлежность возбудителей (род Salmonella). Идентифицировать возбудителя брюшного тифа и паратифа А, В и С можно с высокой степенью достоверности при использовании микробиологических анализаторов. Наборы реагентов для выявления НК возбудителей паратифов методами АНК в РФ пока практически недоступны.

Клиническое течение инфекционного процесса не всегда позволяет различить брюшной тиф и паратифы, поэтому единственным способом их дифференциальной диагностики является лабораторное исследование биоматериала с выделением возбудителя и идентификация его до уровня серологического варианта. Дифференцировать брюшной тиф и паратифы от сальмонеллезов, вызванных сальмонеллами серологических групп В, C, D по уровню АТ к О-антигенам сальмонелл не представляется возможным.

Выявление АТ носит вспомогательный, ретроспективный характер. В отечественной практике для выявления АТ применяется метод РПГА с эритроцитарными диагностикумами для всех серотипов сальмонелл групп А, В, С, D, E. Наличие АТ к Vi-АГ возбудителя брюшного тифа является скрининговым тестом для выявления состояния хронического бактерионосительства.

Показания к применению различных лабораторных исследований. В острой фазе заболевания при лихорадке целесообразно использовать для культурального исследования образцы крови, при появлении симптомов ОКИ – образцы испражнений, мочи; можно исследовать соскобы с розеол. Исследование желчи позволяет выявить формирование хронического бактерионосительства; при летальных исходах исследуют костный мозг. Все другие тесты для выявления сальмонелл как рода не могут применяться для идентификации возбудителей тифо-паратифозных заболеваний.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Выявление чистой культуры возбудителей в биологическом материале имеет высокую диагностическую ценность и служит основанием для лабораторного подтверждения этиологии заболевания.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Читайте также: