Мук 4 2 2218-07 лабораторная диагностика холеры бесплатно

Бесплатная горячая линия юридической помощи

• Главная
• "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

4. Организация лабораторных исследований

Диагностические исследования на холеру в регламентированном объеме могут проводить:

- бактериологические лаборатории учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, лечебно-профилактических и противочумных учреждений, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III группы патогенности;

- лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора и ведомств, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру;

- лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру и на работу с возбудителем холеры.

Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями, регламентирующими:

- безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности - для бактериологических лабораторий учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и лечебно-профилактических учреждений;

- безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности - для лабораторий (отделов) особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, ведомств и противочумных учреждений;

- порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов IV группы патогенности.

Порядок получения лабораториями разрешения на диагностические исследования на холеру определяется действующими нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.

В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное разрешение на проведение диагностических исследований на холеру бактериологическим лабораториям учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и другим, функционирующим в составе лабораторной службы очага, в случае расширения их функциональных обязанностей представляется решением медицинского штаба очага.

4.1.1. Бактериологические лаборатории учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и лечебно-профилактические учреждения проводят плановые диагностические исследования на холеру материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме, предусмотренном действующими нормативными документами по эпидемиологическому надзору за холерой.

Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или до выделения культуры с характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на стекле (далее - слайд-агглютинации) с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, РО и О139.

При положительном результате слайд-агглютинации немедленно сообщают в органы Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации, культуру для окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную лабораторию в установленном порядке.

При отрицательном результате слайд-агглютинации:

- не агглютинирующиеся холерными сыворотками О1 и О139 культуры, выделенные от людей, направляют для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию;

- не агглютинирующиеся холерными сыворотками О1 и О139 культуры, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицируют на месте или по согласованию передают в учреждение Роспотребнадзора.

4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора и ведомств:

- выполняют диагностическое исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;

- идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп по регламентированным для этих лабораторий тестам;

- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в территориальных лабораториях;

- представляют оперативную информацию о выделении культур холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп;

- в установленном порядке немедленно передают в территориальное противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами диагностики не определяется;

- в течение 5 дней после окончания идентификации передают в территориальное противочумное учреждение или в головной по проблеме "Холера" Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт все культуры холерных вибрионов О1, О139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп при выделении от больных;

- контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.

4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:

- проводят исследования материала от больных и умерших с подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов окружающей среды;

- подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории;

- идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность культур;

- осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на курируемой территории;

- в установленном порядке выделенные культуры холерных вибрионов с паспортами передают в территориальный противочумный институт, головной по проблеме "Холера" Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт, одновременно паспорта на эти же культуры направляют в противочумный центр Роспотребнадзора.

Лабораторное обеспечение эпидемиологического надзора за холерой осуществляют в соответствии с действующими нормативными и методическими документами. Профилактические исследования на холеру проводят в течение рабочего дня с использованием соответствующих питательных сред, диагностические исследования материала от подозрительных на холеру больных (трупов) - в условиях круглосуточного режима работы лаборатории.

Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также формирование лабораторной службы в очаге холеры осуществляются в соответствии с действующими нормативными документами по организации и проведению противохолерных мероприятий.

страница	1/4
Дата	07.12.2012
Размер	452.71 Kb.
Тип	Документы

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г.Г.ОНИЩЕНКО 18 января 2008 года Дата введения: с момента утверждения 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ ХОЛЕРЫ

ДОПОЛНЕНИЕ К МУК 4.2.2218-07 "ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.2315-08
1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека; ФГУЗ "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный

институт"; ФГУЗ "Противочумный центр"; ФГУЗ "Ставропольский научно-исследовательский

противочумный институт"; ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт

"Микроб"; ФГУЗ "Причерноморская противочумная станция"; Управлением Роспотребнадзора по г.

Москве.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-

эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).
3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом

Российской Федерации Г.Г. Онищенко 18 января 2008 г.
4. Введены в дополнение к Методическим указаниям МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
диагностика холеры".
1. Область применения
1.1. Настоящий методический документ "Серологические методы в диагностике холеры"

разработан в дополнение к методическим указаниям МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика

холеры" в части, касающейся организации и проведения серологической диагностики холеры у

людей.
1.2. Документ предназначен для специалистов управлений по субъектам Российской

Федерации, центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации и противочумных

учреждений Роспотребнадзора, лечебно-профилактических учреждений.
2. Нормативные ссылки
2.1. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности

(опасности)".
2.2. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности

(опасности) и возбудителями паразитарных болезней".
2.3. СП 1.3.

2518-09 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности

(опасности) и возбудителями паразитарных болезней". Доп. и изм. 1 к СП 1.3.2322-08.
2.4. СП 3.3.2.1248-03 "Условия транспортирования и хранения медицинских

иммунобиологических препаратов".
2.5. СП 3.1.1.2521-09 "Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому

надзору за холерой на территории Российской Федерации".
2.6. МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры".
2.7. МР "Метод микрообъемной реакции агглютинации для идентификации холерных

вибрионов".
3. Значение серологических методов в диагностике холеры
Серологические методы в диагностике холеры используют как с целью выявления

противохолерных антител в крови больных (переболевших) и вакцинированных, так и в

идентификации возбудителя. Последние достаточно полно описаны в МУК 4.2.2218-07

"Лабораторная диагностика холеры", и в настоящем документе приводится описание лишь новых

реакций, упрощающих видовую идентификацию холерных O1 и O139 вибрионов в РКОА (реакция

коагглютинации) или ориентировочную оценку эпидемической значимости посредством выявления
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
липазной активности в РАО.
Что же касается выявления противохолерных антител у людей, то значимость этого факта,

величина и динамика их титров рассматриваются и оцениваются в сочетании с клинико-

эпидемиологической ситуацией и характеристикой обследуемого контингента.
Диагностика первых случаев холеры является наиболее ответственной и сложной и должна

быть максимально обоснованной, что связано с возможностью ошибок при сходных с холерой

состояниях. Следует иметь в виду, что официальная регистрация первых случаев холеры влечет за

собой, помимо чисто медицинских мер, введение ряда ограничительных мероприятий, требующих

больших экономических затрат.
Серологическое обследование людей на холеру имеет, как правило, дополнительное значение.

Но в отдельных случаях, при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического

анализа, серопозитивные результаты в структуре критериев диагностики холеры могут иметь

решающее значение.
Серологическое обследование позволяет подтвердить диагноз у больных с атипичной клиникой

холеры при отсутствии выделения возбудителя, в т.ч. при обследовании на фоне лечения

антибиотиками, или исключить диагноз холеры, поставленный на основании одних клинических

данных. Серологический анализ является также существенным методом ретроспективной

диагностики холеры. В ряде случаев иммунологические тесты дополняют клинико-

эпидемиологические данные и позволяют установить или исключить факт внутрибольничного

заражения холерой.
Определение токсиннейтрализующих антител в сыворотке людей позволяет сделать заключение

об эпидемичности (токсигенности) штаммов холерных вибрионов O1 или O139 серогрупп,

циркулирующих в очаге холеры, что играет важную роль в определении объема противохолерных

мероприятий. При этом целесообразно дифференфицировать серопозитивные результаты как

следствие холерной инфекции или иммунизации холерной вакциной.
Для серологической диагностики холеры используют различные иммунологические реакции,

выявляющие в сыворотке крови больных, вибриононосителей и реконвалесцентов, а также

вакцинированных специфические антитела: агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела.
У больных холерой специфические антитела, как правило, выявляются на 5 - 7 день от начала

заболевания.
Наиболее достоверные данные могут быть получены при исследовании парных сывороток с

интервалом 7 - 10 дней и/или при использовании системы иммунологических реакций.
Тактика применения иммунологических тестов зависит от конкретных целей и задач

серологического обследования людей на холеру, которое должно проводиться в основном по

эпидемиологическим показаниям и с использованием комплекса реакций. Выбор схем исследования

сывороток людей на холеру также определяется целями и задачами обследования больных,

вибриононосителей, переболевших, контактных с ними и др.
4. Методы выявления противохолерных антител
Специфические агглютинины к холерным вибрионам O1 серогруппы
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
можно
выявить путем постановки объемной реакции агглютинации

(РА), в
двухкомпонентной реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с

использованием
антигенного поливалентного O1 холерного диагностикума, а

также при
постановке трехкомпонентной реакции нейтрализации антигена

(РНАг) с
иммуноглобулиновым холерным диагностикумом. Реакция

пассивной
гемагглютинации с использованием энтеротоксического

холерного
диагностикума (РПГА ) позволяет выявлять иммуноглобулины к

токсигенным
ЭХЭД
штаммам холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп - антитоксины. С

помощью
реакции вибриоцидных антител (РВА) можно выявлять вибриоцидные

антитела.
4.1. Подготовка проб
Для постановки серологических реакций кровь берут из локтевой вены в объеме 1 - 5 мл, при

отсутствии такой возможности - из пальца. В последнем случае исследование ведут микрометодом с

учетом возможности получения результатов в 2 - 4 раза ниже, чем при постановке серологических

реакций макрометодом.
После свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной стеклянной палочкой

или платиновой петлей. Пробирки сохраняют в холодильнике или транспортируют в лабораторию

охлажденными (в сумке-холодильнике, термосе и т.п.). В лаборатории сыворотку инактивируют при

температуре (56,0 +/- 0,5) °C в течение 30 мин. Если кровь забирают в день постановки реакции, то

пробирки со свернувшейся кровью необходимо центрифугировать 10 - 15 мин. при 3000 оборотов в

минуту. Кровь из пальца берут в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый флакон или

пробирку с 1,6 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия (1:5).
При отсутствии возможности исследовать сыворотку немедленно ее сохраняют в ампулах при

температуре (4,0 +/- 0,5) °C.
4.2. Определение агглютининов в сыворотке крови
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
4.2.1. Реакция агглютинации (РА) с живыми культурами
Агглютинины в крови больных холерой обнаруживаются начиная с 6 - 9 дня болезни в титрах

1:40 - 1:80, достигая к 12 - 16 дню максимальных значений 1:640 - 1:1280. Диагностическими

считаются титры агглютинации в разведении 1:40 и выше или их 4-кратное нарастание в парных

сыворотках.
Работу с живыми культурами холерных вибрионов осуществляют с соблюдением требований

действующих санитарных правил по безопасности работы с микроорганизмами I - II групп

патогенности (опасности).
Методика постановки реакции агглютинации (РА) в макрообъеме
Исследуемую сыворотку титруют в 1%-й пептонной воде pH 7,5 +/- 0,1 в объеме 1 мл от 1:10 до

1:640. В качестве антигена используют 3-часовую бульонную культуру холерного вибриона,

выделенного в данном очаге, или сыворотку исследуют в 3-х рядах с 3-часовыми бульонными

культурами тест-штаммов холерных вибрионов O1 (сероваров Огава, Инаба) и O139 серогрупп. В

пробирки с титрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 ч в

термостат при 37 °C, затем до утра в холодильник при температуре (4,0 +/- 0,5) °C, после чего

отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки.
При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3 - 4 креста.
Методика постановки реакции агглютинации (РА) в микрообъеме
Материалы и оборудование.
Микропланшеты для иммунологических реакций с круглодонными лунками и прозрачными

крышками.
Механические 1-, 4- и 8-канальные дозаторы с переменным объемом 50 - 200 мкл и

соответствующие наконечники.
Кюветы (подносы) эмалированные, фаянсовые.
Стереомикроскоп типа МБС-10.
Культура холерного вибриона, выделенная в данном очаге, или тест-штаммы холерных

вибрионов O1 (сероваров Огава и Инаба) и O139 серогрупп (допускается использование убитых

культур).
Постановка реакции.
Реакция осуществляется в объеме 0,1 мл (100 мкл).
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Готовят взвесь культуры (антигена) холерного вибриона,

выделенного в
данном очаге, или тест-штаммов холерных вибрионов O1 (сероваров

Огава и
Инаба) и O139 серогрупп в 3 - 4 мл 0,85%-го раствора хлорида натрия

из 6 -
9
18-часовой агаровой культуры до концентрации 2 х 10 м.к. в 1

мл, что
соответствует 10 ед. стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Микропланшеты маркируют, надписывая карандашом с левой стороны номер исследуемой

сыворотки, а сверху ее разведения от 1:5 до 1:640, номер штамма (живой или убитой культуры).
В лунки каждого ряда дозаторами разливают по 50 мкл 0,85%-го

раствора
хлорида натрия. Затем в 1-ю лунку вносят 50 мкл исследуемой

сыворотки,
инактивированной при 56 °C 30 мин., в разведении 1:5 и проводят

двукратное
ее разведение микропипеткой на 50 мкл, из последней лунки удаляют

50 мкл.
Затем в каждую лунку вносят 50 мкл взвеси культуры-антигена в

концентрации
9
2 х 10 м.к. в 1 мл. Реакция сопровождается контролями антигена

(антигенов)
и исследуемой сыворотки. Планшет накрывают крышкой и помещают в

термостат
при 37 °C на 2 ч.
Учет реакции.
Учет реакции проводят в косо проходящем свете под стереомикроскопом МБС-1, МБС-2 или

МБС-10.
Реакцию оценивают по характеру агглютинации на дне лунки:
- полная агглютинация: наличие на дне лунки рыхлой разорванной пленки, четких хлопьев на

фоне темного поля;
- неполная агглютинация: наличие нежной пленки и полиморфных комочков агглютината на

темном фоне;
- слабая агглютинация: наличие мелких хлопьев на фоне сероватого поля;
- следы агглютинации: мелкие единичные хлопья на фоне мутной жидкости.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Реакцию оценивают отрицательно, когда в луночке вибрионы равномерно выстилают дно или

собираются в "пуговку". Под микроскопом видно равномерное мелкозернистое поле без темных

промежутков.
Положительной считают реакцию при наличии полной и неполной агглютинации.
При постановке реакции агглютинации в микрообъеме дополнительно предусматривают

следующее:
- планшеты помещают на поднос (фаянсовый, эмалированный). На дно подноса

предварительно расстилают марлевую салфетку, смоченную дезинфицирующим раствором (3%-й

раствор хлорамина, 3%-й раствор перекиси водорода с 0,5% моющего средства);
- после внесения дозатором в каждую лунку 50 мкл взвеси живых

культур
9
холерных вибрионов в дозе 2 х 10 м.к./мл планшет накрывают

крышкой и на
подносе ставят в термостат при 37 °C на 2 ч;
- для учета реакции поднос с планшетом переносят на лабораторный стол, затем планшет ставят

на стеклянную подставку и оценивают характер реакции агглютинации в косо проходящем свете с

помощью стереоскопического микроскопа (системы МБС);
- при учете реакции крышку с планшета не снимают. В случае запотевания крышки ее меняют на

другую, а запотевшую помещают в емкость с 3%-м раствором хлорамина;
- после учета реакции крышку снимают, планшет и крышку складывают в кювет, заливают 3%-м

раствором хлорамина, накрывают и оставляют на 24 ч. Разовые планшеты обеззараживают

физическим способом - автоклавированием при 1,5 кгс/кв. см в течение 60 мин. Стеклянную крышку