Анализ методом пцр на сальмонеллез

Исследование для выявления возбудителей кишечных инфекций рода Salmonella, в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется генетический материал (ДНК) бактерий в образце кала.

Возбудители сальмонеллеза, ПЦР.

Salmonella species, PCR.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исследование рекомендуется проводить до начала приема антибиотиков и других антибактериальных химиотерапевтических препаратов.
Не использовать слабительные препараты, ректальные свечи, ограничить прием медикаментов, влияющих на перистальтику кишечника (белладонны, пилокарпина и др.) и на окраску кала (железа, висмута, сернокислого бария), за 72 часов до сдачи кала.

Общая информация об исследовании

Salmonella (cальмонеллы) – это род грамотрицательных бактерий, насчитывающий свыше 2000 серотипов. Сальмонеллы попадают в организм при употреблении зараженной воды, яиц или мяса и способны вызывать сальмонеллез – острую кишечную инфекцию. При поражении кишечника и абдоминальных лимфатических узлов развивается сальмонеллезный гастроэнтерит, который сопровождается тошнотой, рвотой, диареей, спастическими болями в животе и лихорадкой. Если инфекция генерализуется, в 5-10 % случаев возможны тромбоэмболические осложнения, сальмонеллезный сепсис и менингит, пневмония, эндартериит, эндокардит, пиелонефрит. При поражении клеток ретикулоэндотелиальной системы развивается системная инфекция – брюшной тиф с лихорадкой, нарушением стула, сыпью в области живота и грудной клетки и симптомами поражения центральной нервной системы (заторможенностью, нарушением сознания и бредом).

Возможно бактерионосительство – острое (выделение возбудителя в течение 3 месяцев после выздоровления), хроническое (выделение возбудителя более 3 месяцев с момента выздоровления) и транзиторное (однократный положительный результат бактериологического или серологического исследования при отсутствии клинических проявлений заболевания). Для диагностики сальмонеллеза, наряду с серологическими и бактериологическими исследованиями, используется метод полимеразной цепной реакции, позволяющий выявить ДНК бактерий рода Salmonella.

Для чего используется исследование?

Чтобы определить текущую инфекцию, вызванную бактериями рода Salmonella.
Для выявления бактеpионосителей, в том числе сpеди pаботников пищевых пpедпpиятий.

Когда назначается исследование?

Когда есть подозрение на инфекцию, вызванную бактериями рода Salmonella.
При обследовании pаботников пищевых пpедпpиятий, чтобы выявить бактеpионосителей (например, пpи поступлении на pаботу новых сотрудников).
Если у пациента есть заболевание, протекающее со сходными с сальмонеллезом симптомами:
- повышение температуры (иногда до 39 °С и выше),
- общая слабость,
- головная боль,
- озноб,
- тошнота, рвота,
- боли в эпигастральной и пупочной областях,
- расстройство стула (диарея).

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Наличие ДНК бактерий рода Salmonella в кале, что указывает на острую инфекцию или хроническое бактерионосительство.

Отсутствие ДНК бактерий рода Salmonella, что чаще всего означает отсутствие вызываемых этими бактериями заболеваний.

Дети, пожилые люди, а также лица с сопутствующими заболеваниями желудочно-кишечного тракта и нарушениями в иммунной системе входят в группу риска по развитию сальмонеллеза, особенно генерализованных форм.
Для постановки диагноза "сальмонеллез" обязателен положительный результат бактериологического или серологического исследования.

Кто назначает исследование?

Инфекционист, терапевт, врач общей практики, гастроэнтеролог.

Анализ кала на Salmonella spp. методом ПЦР

Выявление Salmonella spp. в образце кала методикой ПЦР представляет собой генетическое исследование, при котором обнаруживают участки ДНК бактерии.
Анализ назначают для диагностики острой кишечной инфекции, вызванной возбудителем рода Salmonella, сальмонеллеза.

Подготовка к исследованию:

Обследование необходимо проходить до приема антибактериальных препаратов
За 3 суток до сбора биоматериала исключить прием медикаментов, влияющих на перистальтику кишки (пилокарпин, препараты белладонны)
За 72 часа до исследования отменить лекарственные средства, изменяющих окрас каловых масс (сернокислый барий, препараты железа и висмута)

Тип биоматериала: кал

Синонимы (rus): Возбудители сальмонеллёза, ПЦР

Синонимы (eng): Salmonella species, PCR

Методы: полимеразная цепная реакция

Единицы измерения: тест качественный: результат может быть либо положительным, либо отрицательным

Сроки выполнения: 1 день

Сальмонеллы – это грамотрицательные бактерии, способные вызывать острые кишечные инфекции. Инфицирование происходит посредством употребления воды, мяса и яиц, зараженных возбудителем сальмонеллеза. После попадания в организм они вызывают гастроэнтерит, который сопровождается учащением стула, рвотой, лихорадкой, общим недомоганием.

При неблагоприятных условиях происходит генерализация инфекции, развивается сальмонеллезный менингит, эндокардит, пиелонефрит, сепсис. В тяжелых случаях диагностируют брюшной тиф, осложненный поражением центральных отделов нервной системы. Группой риска генерализации инфекции являются дети, пожилые люди, пациенты с заболеваниями органов пищеварения и иммунодефицитами.

При помощи методики ПЦР выявляют участки ДНК микроорганизма в исследуемом биоматериале. Анализ обладает высокой информативностью и помогает обнаружить бактерии даже при малом содержании в каловых массах. Для этого геном подвергают каскадному удвоениюпри помощи ферментов-активаторов. Обследование проводят в режиме реального времени, подсчитывая количество генетического материала после каждой сессии копирования.

Проникновение возбудителя в организм орально-фекальным путем обычно вызывает сальмонеллез различной степени тяжести в зависимости от работы иммунной системы. В некоторых клинических случаях инфекция не дает явных симптомов поражения кишечника и других органов, что приводит к бактерионосительству. Такое состояние может возникать при недостаточном лечении болезни и нарушении больничного режима.

Бактерионосительство может быть острым и сопровождается выделением бактерий с калом на протяжении 3 месяцев. При развитии хронического процесса сальмонеллы выделяются постоянно до проведения санации очага инфекции. Иногда наблюдают транзиторный процесс, который характеризуется однократным выявлением микроорганизмов в выделениях кишечника. Обнаружение в кале возбудителя может свидетельствовать о заболевании или бактерионосительстве. В пользу активного инфекционного процесса говорят клинические проявления в анамнезе.

Обследование назначают в следующих случаях:

диагностика сальмонеллеза;
дифференциальная диагностика сальмонеллеза с другими кишечными инфекциями со сходной симптоматикой;
профилактическое регулярное исследование работников пищевых предприятий, детских учреждений.

Для выявления заболевания также обязательно проведение серологического и бактериологического исследования.

Обследование на сальмонеллез методикой ПЦР позволяет диагностировать заболевание с высокой степенью вероятности на ранних этапах развития инфекции, назначить своевременное комплексное лечение.

S. paratyphi вызывает паратифы, они различаются по типу заболевания и делятся на А, В и С. Salmonellatyphi вызывает брюшной тиф. Эти инфекционные заболевания сопровождаются циркуляцией возбудителя в крови, высокой температурой тела, реакцией лимфатических узлов и токсическими проявлениями. Сальмонеллы вызывают сальмонеллез, который протекает несколько легче чем тифы и паратифы. Эти патологии трудно отличить, основываясь лишь на клинических явлениях - для этого используются лабораторные методы исследования. Их объединяет то, что они тропны к пищеварительному тракту и большинство симптомов наблюдается именно со стороны этих органов.

Эпидемиологические особенности патологий

Важным моментом при постановке диагноза являются особенности проникновения возбудителя в организм. В зависимости от этого различают несколько типов инфекций. К примеру, бактерии, которые приводят к развитию тифа и паратифов, являются антропонозными - передача инфекции наблюдается от людей, которые болеют и являются носителями. Сальмонеллез и некоторые паратифы являются зооантропонозами - инфекциями, которые общие и для животных. и для людей.

Строение сальмонелл позволяет им переживать условия внешней среды и продолжать свой жизненный цикл в воде, почве. Чтобы уничтожить их, необходимо использовать дезинфектанты и другие агрессивные вещества. В сточные воды и землю бактерии поступают, в основном, с испражнениями, поэтому путь передачи называется фекально-оральным. Кроме кала и мочи, значительное количество бактерий содержит слюна пациента, из чего также можно сделать выводы о передаче заболевания.

Когда необходимо пройти диагностику?

Анализы необходимо сдать тем, кто работает на пищевом производстве, посещает детский коллектив или работает в нем. Это нужно для того, чтобы исключить факт носительства бактерии. Пищевая промышленность опасна в эпидемиологическом плане, так как возбудитель превосходно чувствует себя на питательных средах, которые используются в производстве готовых блюд или продуктов. Детские коллективы также имеют свою особенность - в детском возрасте не так серьезно соблюдаются гигиенические меры, чаще наблюдается некачественное мытье рук, контакт грязных поверхностей со слизистой рта. Особенно важна диагностика и для беременных. В остальных случаях, анализы проводятся при наличии следующих симптомов:

острое повышение температуры;
нарастающая интоксикация, которая проявляется слабостью, головной болью, ломотой в костях и суставах;
боль в животе, которая имеет спастический характер, локализуется вокруг пупочного кольца и в месте, где сходятся реберные дуги;
тошнота, за которой следует неоднократная рвота;
диарея, при которой может наблюдаться зеленоватый оттенок каловых масс и их неприятный запах;
бледность кожных покровов;
сухость слизистых;
мелкопятнистая сыпь красного цвета, которая постепенно становится более бледной.

Наблюдаются различные формы и особенности течения заболеваний, поэтому симптомы могут несколько отличаться. Как правило, при подозрительной клинической картине пациенты обращаются к врачу, а он направляет их на сдачу анализов. Лабораторная диагностика используется и ретроспективно - после выздоровления, для определения иммунологической картины, а также для выявления устойчивых форм патологии.

Виды исследований при данных инфекционных заболеваниях

Начало диагностики - забор материала. Биологические жидкости и ткани необходимо правильно собрать, в зависимости от фазы развития болезни. Лучше сделать это до начала приема антибактериальной терапии.

Постановка диагноза “брюшной тиф” происходит такими методами:

Данные методы актуальны для ранней постановки диагноза. Возбудителя можно выявить в крови, тканях костного мозга, дуоденальном содержимом, в каловых массах и в моче. Посев палочек тифа дает точную информацию для постановки диагноза.

Для исследования берется кровь пациента, 10 мл, венозная. Посев производится на специфические питательные среды. В некоторых случаях, часть крови используется для посева, а сыворотка - для серологического анализа. Ожидается рост культур, которые идентифицирует с помощью макро- и микроскопического исследования.

На определенных стадиях патологического процесса можно выделять возбудитель из костного мозга - для этого проводится стернальная пункция и забор небольшого количества материала. Это безопасно и безболезненно, так как проходит на фоне анестезии. Посев происходит на питательные среды. Особенность метода - большая чувствительность. Методика обладает диагностической точностью даже при стертых формах болезни, которые невозможно определить методом гемокультуры.

Забор желчи происходит путем зондирования 12-перстной кишки. Сеются 3 порции кишечного содержимого. Особенность методики - эффективность при поиске носителей или устойчивых форм болезни у носителей.

Материал находится в элементах сыпи - это прозрачная жидкость в центре розеолы. Используется при негативном ответе на другие методы исследования и при наличии характерной сыпи. Для забора крови необходимо обработать кожу и скарифицировать её острием скальпеля. Содержимое элемента сыпи наносится на питательную среду, как и в остальных случаях.

Определение культур в моче больше направлено на поиск бактерионосителей, чем пациентов с активной формой болезни. Мочу собирают после тщательного туалета, а еще лучше с помощью катетера. В остальном, исследование происходит также, как и в случае с остальным биологическим материалом.

Методика используется не так часто, так как в каловых массах возбудитель появляется через время после заболевания. Исследование используется для здоровых лиц и носителей.

Для выявления тифозных микроорганизмов может использоваться исследование воды.

Для того, чтобы идентифицировать сам микроорганизм используется специальный метод окраски - он позволяет увидеть под микроскопом типичные палочки, красного цвета, которые на концах имеют закругленные образования. Исследуют её форму, размеры, биохимические свойства и идентифицируют вид микроорганизма. Производится также фаготипирование, то есть определение конкретного вида возбудителя.

Используются для определения носительства или наличия патологического процесса. В диагностике тифа используется реакция Видаля, а также РИГА. Еще один серологический метод - иммуноферментный анализ.

Реакция Видаля позволяет выделить возбудитель из сыворотки крови. Реакция специфическая, начиная с 7-10 дня болезни. Особенность брюшного тифа - разные скорости повышения тех или иных типов антигенов. Определение всех антигенов позволяет правильно диагностировать процесс. Реакция имеет специфические особенности в плане забора материала и постановки исследования, поэтому её точность зависит от условий лаборатории.

Реакция гемагглютинации широко используется для диагностики тифа и паратифа. Особенно важна методика для определения носительства бактерий. Достоверность реакции подтверждается выделением чистой культуры микроорганизмов. Для носителей используются методики исследования мочи, желчи или каловых масс.

Серологические пробы более достоверны, если использовать методику парных сывороток и отслеживать динамическое изменение количества антител. Также, определение вида антител позволяет сказать, какая стадия процесса происходит в организме.

Аллергопроба при тифе основана на воздействии тифина, который обладает аллергеном. Он вызывает реакцию, если в организме есть антитела к нему. Реакция сопровождается небольшим местным отеком, покраснением. Проба используется для реконвалесцентов и необходима в ретроспективном плане.

Диагностика сальмонеллеза происходит с помощью таких процедур:

Бактериологическое исследование каловых масс используется наряду с аналогичным исследованием рвотных масс, мочи, желчи, промывных вод желудка. Посев производится на питательные среды, в которых созданы наиболее благоприятные условия для роста культур. Такие реактивы создаются на основе биохимических свойств возбудителя. Если в исследуемом материале есть культура сальмонелл, в благоприятных условиях она даст рост на среде. Исследователь ждет необходимое количество дней (от 7 до 10) и осматривает реактивы. Сальмонеллы отличаются характерным ростом, который дает основания для постановки диагноза.

Копрограмма при сальмонеллезе - один из наиболее быстрых методов постановки диагноза. Макроскопическое исследование дает основания заподозрить патологические изменения слизистой пищеварительного тракта. Об этом говорят непереваренные частицы клетчатки, воспалительные клетки, выделения слизи и крови вместе с калом, крахмальные зерна. Это говорит о том, что нарушена пищеварительная функция и многие компоненты пищи не расщепляются до своих единиц. Такие изменения вместе с клиническими данными позволяют поставить диагноз и начать лечение. Сбор каловых масс нельзя проводить после приема слабительных препаратов.

Для постановки полимеразно-цепной реакции используется кровь пациента. Современные методы диагностики позволяют обнаружить частицы генетического материала и составить из них фрагмент нуклеиновой кислоты. Полученный образец сопоставляют с таковым у искомого возбудителя и при их совпадении ставят диагноз. Метод обладает высокой чувствительностью, он является точным основанием для постановки диагноза.

Серологические методы диагностики основаны на поиске антител в крови пациента. Если в организме находятся антитела, они создадут иммунокомплекс вместе с антигеном, который добавляют к биологическому материалу. Если реакция произошла, её повторяют через время, чтобы увидеть динамическую картину заболевания. Это называется методом парных сывороток, определяется нарастание титра антител. Различают виды антител, которые есть в острой стадии, у носителей, у пациентов с реконвалесцентной формой патологии. Среди серологических методов - иммуноферментный анализ, реакции гемагглютинации, иммунофлюоресцентные методики. Они различаются добавлением дополнительных реактивов, прицельным изучением эритроцитов.

Каждый из методов диагностики используется при определенных обстоятельствах - в зависимости от состояния пациента, дня с начала болезни, а также для разных целей диагностики. Это важно и для назначения лекарственной тактики, и для получения эпидемиологических данных.

Острые кишечные инфекции опасны тем, что приводят к интоксикации и быстрому обезвоживанию. Вместе с жидкостью из организма выводятся полезные минералы, соли и другие вещества. За короткий срок может наступить критическое состояние организма, ведь потеря влаги происходит также за счет высокой температуры, частого дыхания, потоотделения и других процессов. Особенно опасно это для тех, кто имеет ослабленный иммунитет, для детей. Поэтому, своевременная и качественная диагностика настолько важна, ведь именно на её основе можно назначить необходимое лечение, которое приведет к положительному результату.

Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента

Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма

Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.

Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.

Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"

Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
- Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
- Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
- Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
- Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
- Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
- Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализа	Цена, руб.
Определение ДНК хламидия	750
Определение ДНК микоплазмы хоминис	540
Определение микоплазмы гениталиум	350
Определение ДНК уреаплазмы	350
Гонококк, определение ДНК	350
Определение ДНК герпеса (разные типы)	350–600
Определение ДНК кандиды	570
Вирус краснухи, определение РНК	800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы)	350–1900 [1]

Читайте также: