| Приоритеты: |
Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано для диагностики лепры. Сущность изобретения состоит в том, что при обнаружении в слюне антител к М. leprae класса IgA иммуноферментным анализом в слюне дополнительно определяют антитела к М. leprae классов IgG и IgM с помощью антигенов М. lufu и по показателю оптической плотности уровня антител 0,40 и более диагностируют лепру. Техническим результатом является повышение точности диагностики лепры. 7 табл.
Рисунки к патенту РФ 2171689
Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии? и может быть, в частности, использовано для диагностики лепры.
Из практики медицины известен способ диагностики лепры, заключающийся в обнаружении в крови антител к возбудителю лепры с помощью иммуноферментного анализа, использующего в качестве антигена M.lufu, культивируемые in vitro. (патент N 2124730, 1999 г. Способ диагностики лепры. Юшин М.Ю., Дячина М.Н., Дегтярев О.В., Калянина О.В.).
Недостатками известного способа является то, что способ инвазивен, для его осуществления требуется взятие крови у обследуемых с использованием инструментария, что несет потенциальную опасность инфекционного заражения и не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.
Известен способ диагностики лепры в полевых условиях, состоящий в обнаружении специфического антигена M. leprae - фенольного гликолипида-1 (ФГЛ-1) в моче обследуемых в реакции Dot ELISA на нитроцеллюлозной мембране (R. R. J. Kaldany, A. Nurlign. Development of a dot-ELISA for detection of leprosy antigen uria under field conditions. Leprosy Rev., 1986, v 57, Suppl. 2. p. 95-100). Недостатками известного способа являются: низкая диагностическая чувствительность (способом возможно обнаружение антигена только у больных с высокой бактериальной нагрузкой; через 2 месяца лечения антигены M.leprae перестают обнаруживаться данным способом в моче у больных), труднодоступность реагентов для проведения анализа (моноклональные антитела к ФГЛ-1), возможность получения только качественных (да/нет), а не количественных результатов анализа, многоэтапность и сложность подготовки пробы для исследования (концентрирование мочи в 10 раз, лиофилизация, растворение лиофилизата мочи до 1/100 начального объема, экстракция ФГЛ-1 смесью хлороформ-метанол, центрифугирование, лиофилизация, ультразвуковая дезинтеграция). Известный способ не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.
Наиболее близким к заявляемому является способ диагностики лепры, основанный на иммуноферментном определении в слюне нелеченных больных лепрой антител класса IgA к специфическому антигену M.leprae - ФГЛ-1 (M.Abe., J.Miyaji, T Okushita, F. Minagawa, Y. Yoshina, Y. Sakamoto, K. Saikawa. Anti-mycobacterial antibodies in saliva. Leprosy Rev. 1986, Sup. 2. p. 213-223).
Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к диагностике лепры, объектом исследования является слюна человека, а исследование проводится с помощью иммуноферментного анализа.
Однако известный способ имеет следующие недостатки:
- недостаточная точность способа, обусловленная использованием в качестве антигена ФГЛ-1 - компонента M. leprae, обладающего узкой видовой специфичностью, и конъюгата меченных пероксидазой антител к IgA человека, не выявляющих специфические антитела других классов иммуноглобулинов;
- труднодоступность ФГЛ-1 в качестве антигена.
Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение точности диагностики лепры. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением положительного результата. Решение поставленной задачи заключается в том, что при обнаружении в слюне антител к M.leprae класса IgA в иммуноферментном анализе предлагается совокупность отличительных от прототипа признаков, т.е. дополнительно определяют антитела к M.leprae классов IgG и IgM с помощью антигенов M.lufu и по показателям оптической плотности уровня антител 0,40 и более диагностируют лепру.
Предлагаемым способом достигается повышение точности диагностики лепры, т. е. повышение чувствительности способа, возможность прогнозирования активации болезни у больных с регрессом и контроля за эффективностью противолепрозного лечения, а также снижение трудоемкости способа.
Проблема диагностики лепры остается одной из наиболее актуальных в современной лепрологии. Иммунодиагностика лепры основана на определении в биологических средах человека антигенов и/или антител к M.leprae. Необходимость эпидемиологических обследований среди контактных лиц, а также больших групп населения регионов распространения лепры требует разработки технически простых, достаточно информативных и максимально неинвазивных способов диагностики. Одним из подходов для разработки таких методов диагностики является использование слюны в качестве объекта для исследования. Известно, что в слюне человека можно обнаружить многие метаболиты сыворотки крови, в том числе и различные классы иммуноглобулинов (антител) к возбудителям инфекционных заболеваний. Обнаружение антител к M.leprae в слюне можно использовать для диагностики инфицирования, а изучение динамики их уровня в процессе лечения - для оценки эффективности специфического лечения. При выявлении антител к M.leprae в слюне необходимо исследование "параллельных" проб сывороток крови и слюны для максимально возможных совпадений результатов в обеих биологических средах, так как в слюну антитела попадают главным образом из сыворотки крови.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Слюну от каждого исследуемого пациента в количестве 2-3 мл. собирали в стеклянные флаконы и хранили до использования при -20 o C. В день постановки иммуноферментного анализа флаконы размораживали, центрифугировали 15 мин при +4 o C со скоростью 3000 об./мин, надосадочную жидкость использовали в цельном виде без разведения.
M. lufu культивировали на среде Левенштейна-Иенсена в течение 7 дней, затем смывали со среды 0,85% раствором NaCl (из расчета: 500 мг бакмассы - 10 мл раствора NaCl). Бактериальную суспензию подвергали ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) (7-10 мин дробно при 18 кГц). Разрушенную суспензию центрифугировали 30 мин при 10000 об./мин. Супернатант использовали в качестве антигена для сенсибилизации планшетов.
Постановку ИФА осуществляли на поскодонных полистироловых планшетах для иммунологических реакций (Ленмедполимер ТУ 64-2-278-79). Антиген M.lufu разводили в 10 мл карбонат-бикарбонатного буфера pH 9,6 (Na 2 CO 3 1,59 г, NaHCO 3 2,93 г H 2 O 1 л) до конечной концентрации белка 5 мкг/мл и заливали в лунки планшета по 100 мкл. Планшет инкубировали 18 часов при +4 o C. Затем планшет трижды отмывали забуференными физраствором (34 г NaCl на 4 л H 2 O, доводили pH до 7,4 2М Na 2 PO 4 + 0,05% Твин-20) и заливали в каждую лунку по 100 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (0,584 г NaCl, 12,8 г Na 2 HPO 4 , 2,62 г NaHPO 4 , pH 7,2-7,4) и инкубировали 1 час при +37 o C. Затем планшет вновь отмывали вышеуказанным способом.
Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в клинике и амбулатории НИИ по изучению лепры на 116 больных лепрой в течение 1998-1999 г. В качестве здорового контроля (лица, не контактировавшие с больными лепрой) обследованы 23 рабочих одного из промышленных предприятий г. Астрахани, проходившие ежегодные профилактические медицинские осмотры. Ниже приводятся результаты апробации.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется таблицей 1.
Из таблицы 1 видно, что проведенный корреляционный анализ результатов тестирования предлагаемым способом образцов сыворотки крови и слюны у больных лепрой показал высокую степень связи уровня антител в обеих биологических средах, что подтверждает возможность использования слюны в качестве биосреды, альтернативной сыворотке крови, для выявления антител к M.leprae.
Больная К. , 1932 г.р., история болезни N 2044. Больна лепрой с 1955 г. Диагноз: лепроматозный тип лепры (LLs). С 1968 г. выписана на амбулаторное лечение, но периодически поступает в клинику НИИ по изучению лепры по поводу осложнения лепрозного процесса - хронического специфического полиневрита, хронического остиомиелита костей стоп, трофических язв стоп. В декабре 1998 г. поступила в клинику с обострением полиневрита. В настоящее время у больной специфический процесс находится в состоянии регресса. Активных проявлений на коже нет, БИН=0, M.leprae в коже не обнаружены. При посещении амбулатории и в период пребывания в клинике было произведено исследование содержания антител к M.leprae в слюне. В примере 1 и в последующих примерах приведены также показатели ОП уровня антител к M.leprae в образцах сывороток крови у этих же больных, чтобы показать, что уровень антител к M.leprae в слюне коррелирует с таковым в сыворотке крови. Слюну больной К. собирали в стеклянные флаконы, центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин, надосадочную жидкость использовали для ИФА в цельном виде. Планшет сенсибилизировали антигеном M. lufu, разведенным в 10 мл карбонат-бикарбонатного буфера (Na 2 CO 3 1,59 г, NaHCO 3 2,93 г, Н 2 О 1 л pH 9,6) до конечной концентрации белка 5 мкг/мл по 100 мкл в каждую лунку. Планшет инкубировали при +4 o C 18 часов. Затем планшет трижды отмывали забуференным физраствором (34 г NaCl на 4 л H 2 О, доводили pH до 7,4 2М Na 2 PO 4 + 0,05% Твин-20) и заливали в каждую лунку по 100 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (0,584 г, NaCl, 12,8 г Na 2 HPO 4 , 262 г NaHPO 4 pH 7,2-7,4) и инкубировали 1 час при +37 o C. Затем планшет вновь промывали вышеуказанным способом. Образцы слюны (цельные) заливали в 2 лунки планшета по 50 мкл в каждую лунку. В качестве положительного контроля (K+) использовали сывороточный пул от больных с активной лепрой, показатель оптической плотности (ОП) уровня антител которого в ИФА с антигеном M.lufu соответствовал 1,50 - 1,70. Планшет инкубировали 1 час при +37 o C. После инкубации планшет отмывали, как указано выше. Затем в лунки вносили по 100 мкл конъюгата (кроличьи антитела к общим иммуноглобулинам человека - IgG, IgA, IgM классов, меченные пероксидазой, производства ВЕКТОР-БЕСТ) в разведении 1:1000 и инкубировали 1 час при +37 o C. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл субстрата (4 мг ортофенилендиамина, 0,1 мл 3,3% H 2 O 2 , 10 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,5, 0,05М лимонная кислота + 0,05М однозамещенный фосфорнокислый натрий) и инкубировали 40-60 мин при +20 o C. Об окончании реакции судили по появлению желто-коричневого окрашивания в лунках положительного контроля (K+), после чего реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл 2М H 2 SO 4 . Результаты реакции оценивали на фотометре "УНИПЛАН" при длине волны 490 нм и выражали в единицах оптической плотности (ОП). Положительными считали образцы, показатели ОП которых в 2 и более раз превышали показатели отрицательного контроля т.е. 0,40 и более. В данном случае уровень антител к M. leprae IgG, IgA и IgM классов у больной К. составил 0,40, т.е. был положительным.
Из приведенных в табл. 2 данных видно, что у больной К. лепрозный процесс в стадии регресса, но обострение полиневрита подтверждено серологически повышением уровней антител к M.leprae как в сыворотке крови (0,45), так и в слюне (0,40). Снижение уровня антител в процессе лечения также шло параллельно в сыворотке и слюне.
Больная Г. , 1939 г.р., история болезни N 3861. Поступила в клинику НИИ по изучению лепры 26.02.98 с диагнозом: лепроматозный тип лепры (LLp), лепрозный полиневрит прогрессирующего течения, хронический остиомиелит костей кистей. На коже - активные проявления лепрозного процесса: пятна, инфильтраты, лепромы. В скарификатах кожи M.leprae, БИН-7,86, 16,68, 4,14, 1,83+. Гистология кожи - инфильтрат лепроматозной структуры с наличием большого количества гомогенных M. leprae. Несмотря на проводимое противолепрозное лечение, инфекционный процесс имел прогрессирующее течение с частыми обострениями. Трижды проводилось определение уровня антител к M.leprae в сыворотке крови и в слюне, как описано в примере N 1.
В приведенном примере (см. табл. 3) у больной Г. клинически активная лепра, подтвержденная бактериоскопически и серологически. Высокий уровень антител к M.leprae в сыворотке крови коррелировал с высоким уровнем антител в слюне (0,82-1,00 -0,65). Показатели уровня антител в слюне больше 0,40.
Больной А., 1967 г.р., история болезни N 3859. Поступил в клинику НИИ по изучению лепры 08.08.94. Диагноз - лепроматозный тип лепры (LLs). Клинически на коже туловища, конечностей - инфильтраты, лепромы. Бактериоскопически в скарификатах кожи большое количество M.leprae. БИН-11,7-11,7-0,8-1,8+. Биопсия кожи - инфильтрат лепроматозного характера с большим количеством M.leprae. Серология - высокий уровень антител к антигенам M.leprae в сыворотке крови. С 1997 года лепрозный процесс стал постепенно регрессировать.
На коже - остаточные элементы лепрозных проявлений, БИН=0, в скарификатах кожи M.leprae не обнаружены. Серология - антитела к M.leprae не обнаружены. Биопсия - регрессирующий инфильтрат лепроматозной структуры без M.leprae. У больного трижды было произведено определение антител к M.leprae в крови и слюне по методике, описанной в примере N 1.
Как видно из примера (см. табл. 4), у больного А. третий год лепрозный процесс в стадии клинического и бактериоскопического регресса, что подтверждается результатами серологических анализов сыворотки крови и слюны: показатели ОП слюны ниже фоновых значений (0,02-0,15-0,06) т.е. - повышении точности способа диагностики лепры на 27,4%
- снижении трудоемкости в осуществлении способа посредством использования M. lufu, культивируемой in vitro, вместо труднодоступного антигена ФГЛ-1
- повышении чувствительности способа путем дополнительного выявления в слюне антител классов IgG и IgM
- возможности применения способа для оценки эффективности лечения и прогнозирования активации процесса, т.к. способ позволяет обнаруживать в слюне антитела к M. leprae и у длительно леченных больных лепрой (более 5 лет), находящихся в стадии регресса (в прототипе - только у активных больных), что показано в примерах 1 и 4.
Предложенный способ может быть рекомендован для осуществления в противолепрозных учреждениях, а также в научных и клинических лабораториях, занимающихся проблемами туберкулеза.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ диагностики лепры, состоящий в обнаружении в слюне антител к М. leprae класса lg А иммуноферментным анализом, отличающийся тем, что в слюне дополнительно определяют антитела к М. leprae классов lg G и lg М с помощью антигенов М. lufu, и по показателю оптической плотности уровня антител 0,40 и более диагностируют лепру.
Способ используется в медицине, а именно в лепрологии, в частности, для диагностики лепры. У пациента берут кровь из пальца и исследуют отстоявшуюся сыворотку с помощью иммуноферментного анализа. Для обнаружения антител к антигенам M. Leprae в сыворотках крови больных лепрой в иммуноферментном анализе в качестве тест-антигена используют культивируемые микобактерии Mycobacterium lufu . Способ прост в исполнении, при этом повышается точность диагностики лепры. 3 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано, в частности, для диагностики лепры.
Из практики медицины известен способ обнаружения антител к M. leprae в сыворотке крови больных лепрой с применением иммуноферментного метода, где в качестве тест-антигена используются водорастворимые белки из лепром человека (Alonso S. M., Mangiaterra M.L., Szarfman A. La reaccion de immunoperoxidasias indirecta aplicata a la lepra humana // Medicina (Argent).-1978.-Vol. 38.- N 63.- P.541-544.). Способ позволяет проводить серологическую диагностику лепры, а также осуществлять исследования с целью прогнозирования заболевания. Недостатком способа является травматичность метода получения антигенного материала: необходимость взятия биоптатов из кожных поражений больных лепрой людей. Способ невозможно внедрить в клиническую практику, поскольку даже при распространенных процессах количества M.leprae в кожных лепромах больных лепроматозной лепрой недостаточно для получения диагностикума.
Известен также способ обнаружения антител к антигенам M.leprae в сыворотке крови больных лепрой на основе иммуноферментного анализа, где в качестве тест-антигена используются препараты из М.leprae, полученные из тканей экспериментально зараженных девятипоясных броненосцев (Stanford J.L., Rook G. A.W., Samuel N., Madlener F., Khamenei A.A., Nemati Т., Modabber F., Rees R.J.W. // Preliminary immunological studies in search of correlates of protective immunity carried out on some Iranian leprosy patients and their families.- Lepr. Rev.- 1980.- Vol.51.- N 4.- P.303-314.). Способ позволяет выявлять специфические антитела к М.leprae в сыворотке крови у больных лепрой, а также у лиц, находящихся в тесном семейном контакте с больными лепрой. К недостаткам способа относится необходимость воспроизведения на броненосцах экспериментальной лепрозной инфекции, которая развивается в течение 2-5 лег. Броненосцы имеют ограниченный ареал обитания (Южная Америка), не размножаются в неволе и требуют особых условий содержания. Выделение М.leprae из тканей броненосца предусматривает использование многоэтапного метода очистки, что в свою очередь повышает стоимость и усложняет процесс получения антигенного диагностикума.
Наиболее близким способом к предлагаемому является способ обнаружения антител к M.leprae в сыворотке крови человека и броненосца при лепре, где в качестве специфического тест-антигена использованы препараты из M.leprae, пассируемые на мышах и крысах (Дячина М.Н., Сухенко Л.Т., Ющенко А.А., Ермолин Г. А. Диагностические тест-системы на основе иммуноферментного метода при лепре // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.-1985,- N 1.- С.64-68). Использование известного способа позволяет выявлять антитела к M.leprae в сыворотке крови больных лепрой людей и броненосцев с экспериментальной лепрозной инфекцией, причем уровни антител коррелируют со степенью активности лепрозного процесса. Способ также позволяет прогнозировать сроки развития экспериментальной лепрозной инфекции у броненосцев.
Недостатки способа в длительности и многоэтапности его осуществления: - моделирование инфекционного процесса на экспериментальных животных с целью накопления бактериальной массы занимает в среднем 1,5-2 года; - получение очищенных M.leprae связано с многоэтапным процессом выделения возбудителя из тканей животных с экспериментальной лепрозной инфекцией.
Известный способ принят авторами в качестве прототипа.
Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа диагностики лепры.
Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в иммуноферментном анализе в качестве тест-антигена используют культивируемые микобактерии - Mycobacterium lufu.
Отличительной особенностью осуществления способа является использование в иммуноферментном анализе (ИФА) в качестве антигеннного диагностикума препаратов из M.lufu, ранее не используемых для этих целей. Известно, что M. lufu пригодны как тест-штамм для первичного скрининга противолепрозных препаратов in vitro.
Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что в известных способах диагностики лепры M.lufu не применялись.
Отсутствие воспроизводимых методов культивирования M.leprae на питательных средах является серьезным препятствием на пути создания диагностических тест-систем. Лабораторные животные (мыши, крысы, броненосцы), в организме которых размножаются M.leprae, до настоящего времени являются единственным источником бактериальной массы, используемой для создания диагностических препаратов. Получение этих препаратов осложняется еще и тем, что M. leprae, полученные в результате пассажа на лабораторных животных, необходимо выделить из инфицированных тканей организма-хозяина. Очистка возбудителя лепры от тканей экспериментальных животных представляет собой сложный, трудоемкий, многоэтапный процесс, требующий участия квалифицированного персонала, специального оборудования и реагентов, что в свою очередь также затрудняет задачу получения диагностикума.
M. lufu, выделенные из почвы в Заире (Portaels, 1980), являются сапрофитными кислотоустойчивыми микобактериями, способными расти на питательных средах. Авторами предлагается M.lufu в качестве источника бактериальной массы для получения антигенного диагностикума вместо используемых в настоящее время некультивируемых in vitro M.leprae. Предлагаемый способ позволяет сократить сроки получения тест-антигена на 1,5-2 года, т.е. ограничить сроки до 1-2 недель.
Использование культивируемых M.lufu для получения тест-антигена является существенным отличием в подходе к диагностике лепры, и именно это отличие позволило получить положительный эффект в виде упрощения способа. Предлагаемый способ позволяет отказаться от использования M.leprae, не способных расти на искусственных питательных средах, в качестве материала для получения антигенного диагностикума.
Предлагаемый способ осуществляли следующим образом: кровь из пальца в количестве 0,1 мл собирали в пробирку и помещали на 1 час в термостат (+37 o C), а затем в холодильник (+4 o C) на 1 час для ретракции сгустка. Отстоявшуюся сыворотку исследовали с помощью иммуноферментного метода. Для длительного хранения сыворотку замораживали при -20 o C.
Использовали два водорастворимых антигенных препарата: - антиген из M.leprae, разрушенных ультразвуком; - антиген из M.lufu, разрушенных ультразвуком.
Бактериальную массу M.leprae накапливали путем пассирования на мышах и крысах в течение 2-х лет. M.leprae выделяли из инфицированных тканей крыс с экспериментальной лепрой по методу Draper (Draper P. Problems related to purification of M.leprae from armadillos tissues and standartization of M. leprae preparations // Report on the Enlarged S.C.Mutina.- Geneva, 1979.- W. H. O. Document. - Annex I, prot. 1/79.- P.4-4,), включающего в себя дифференциальное центрифугирование тканевых гомогенатов в гредиенте плотности сахарозы. Отделение от тканевых частиц проводили в двухфазной полимерной системе, состоящей из 7% декстрана Т-500 (фирмы Pharmacia) и 5% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6 кДа (фирмы BDH). Очищенные M.leprae подвергали ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) в физиологическом растворе в течение 7 мин при 18 кГц. Эффект разрушения контролировали микроскопически. Суспензию разрушенных M.leprae центрифугировали (10000 об./мин), надосадок использовали в качестве нативного водорастворимого антигена (УЗД-М.leprae).
M. lufu культивировали на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 дней. Антигены получали из синхронизированной холодом (при 4 o C в течение 72 ч) культуры M.lufu. Клеточные культуры подвергали ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) в физиологическом растворе в течение 7 мин при 18 кГц. Эффект разрушения контролировали микроскопически. Суспензию разрушенных микобактерий центрифугировали (10000 об/мин), надосадок использовали в качестве нативного антигена (УЗД-M.lufu).
Постановку ИФА осуществляли на полистироловых планшетах для иммунологических реакций однократного применения (производственное объединение "Ленмедполимер" ТУ 64-2-278-79). Одновременно сенсибилизировали два планшета: 1-й - антигенами из M.leprae (УЗД-М.leprae), 2-ой - антигенами из М.lufu (УЗД-М.lufu).
Первый планшет сенсибилизировали УЗД-М.leprae в карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,0-9,5 (1,18 г Na2CO3 3,47 г NaHCO3 и 0,2 г NaN3 растворяли в 1 л дистиллированной воды) из расчета 27 мкг антигена на 1 мл буфера в объеме 0,1 мл на 1 лунку (18 ч при +4 o C). Затем планшет отмывали 3 раза в забуференном физиологическом растворе (34 г NaCI на 4 л воды, доводя 2M Na2PO4 pH до 7,4) с добавлением 0,05% твина-20, после чего в лунки планшета заливали по 0,01 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) и выдерживали 1 ч при +37 o C. Затем вновь производили промывку лунок вышеуказанным способом и заливали лунки исследуемыми сыворотками больных лепрой, разведенными (1:400) фосфатно-солевым буфером (pH 7,3 - 7,4), содержащим 1% сыворотки крупного рогатого скота в объеме 0,1 мл. На планшете ставили также положительный контроль (сыворотки больных с активными проявлениями лепрозного процесса) и отрицательный контроль (донорские сыворотки) в том же разведении (1:400). Каждый образец сывороток заливали в 2 лунки (дубликат). Планшет инкубировали при +37 o C 1 ч, после чего снова повторяли процесс отмывки. Затем в каждую лунку добавляли по 0,1 мл конъюгата (кроличьи антитела к общим иммуноглобулинам человека, меченые пероксидазой) в разведении 1: 1000 и инкубировали 1 ч при +37 o C. После отмывки добавляли субстратную смесь - 5-аминосалициловая кислота с 0,05% перекисью водорода (к 100 мл подогретой до 70 o C дистиллированной воды добавляли 80 мг 5- аминосалициловой кислоты, раствор охлаждали до комнатной температуры и устанавливали pH 5,5 - 6,0. К 18 мл полученного раствора добавляли 2 мл 0,05% раствора перекиси водорода). Планшет выдерживали при комнатной температуре 60 мин. При наличии в сыворотке антител к УЗД-M.leprae субстратная смесь окрашивалась в темно-коричневый цвет (положительная реакция), а контрольные лунки оставались бесцветными или слегка желтоватыми (отрицательная реакция). Результаты реакции оценивали инструментально на фотометре (Minireader MR 590, США), при длине волны 450 нм по интенсивности окраски исследуемого образца и выражали в единицах оптической плотности (ОП). Положительными считали образцы, показатели ОП которых в 2 и более раз превышали показатели в отрицательном контроле. ОП отрицательного контроля не превышала 0,2.
Одновременно осуществляли сенсибилизацию второго планшета. Антигены из M. lufu (УЗД-M.lufu) разводили в карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,0-9,5 из расчета 33 мкг антигена на 1 мл буфера в объеме 0,1 мл на 1 лунку (1,18 Na2CO3, 3,74 NaHCO3 и 0,2 NaN3 растворяют в 1 л дистиллированной воды) и оставляют на 18 ч при +37 o C). Затем планшет отмывали 3 раза в забуференном физиологическом растворе (34 г NaCl на 4 л воды, доводя 2М Na2PO4 pH до 7,4) с добавлением 0,05% твин-20. После промывки в лунки планшета заливали по 0,1 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,3-7,4) и выдерживали 1 ч при +37 o C. Затем вновь производили промывку вышеуказанным способом и заливали в лунки исследуемые сыворотки больных лепрой (в объеме 0,1 мл), разведенные 1:400 фосфатно-солевым буфером pH 7,4 (0,584 г NaCI, 12,8 г Na2HPO4, 2,62 г NaHPO4), содержащим 1% сыворотки крупного рогатого скота. Таким же образом разводили сыворотки от больных с активной лепрой (положительный контроль) и сыворотки доноров (отрицательный контроль). Планшет инкубировали 1 ч при +37 o C, после чего снова отмывали. Затем в каждую лунку добавляли по 0,1 мл конъюгата (кроличьи антитела к общим иммуноглобулинам человека, меченые пероксидазой) в разведении 1:1000 и выдерживали 1 ч при +37 o C. После отмывки добавляли субстрат - 5-аминосалициловая кислота с 0,05% перекисью водорода. Планшет выдерживали при комнатной температуре 40-60 мин. При наличии в сыворотке антител к УЗД-M.lufu субстратная смесь окрашивалась в темно-коричневый цвет (положительная реакция), а контрольные лунки оставались бесцветными или слегка желтоватыми (отрицательная реакция). Результаты реакции оценивали на фотометре (Minireader MR 590, США), при длине волны 450 нм по интенсивности окраски исследуемого образца и выражали в единицах ОП. Положительными считали образцы, показатели ОП которых в 2 и более раз превышали показатели в отрицательном контроле. ОП отрицательного контроля не превышала 0,3.
Изложенная сущность изобретения поясняется табл. 1, где представлены результаты иммуноферментного анализа сывороток крови больных лепрой и контрольных групп при использовании различных антигенов.
Таким образом, из данных табл.1 следует, что показатели уровня антител во всех исследуемых группах, полученные в тест-системе с использованием антигенов из М.leprae, полностью сопоставимы с показателями, полученными в ИФА, где тест-антигеном являются препараты из M.lufu.
Результаты ИФА сывороток больных лепрой с использованием антигенов из М. leprae и из M.lufu представлены в табл.2.
Авторами проведена оценка чувствительности, специфичности и эффективности иммуноферментного анализа. За диагностическую чувствительность ИФА принимали процентное выражение частоты истинно положительных результатов ИФА у больных с активными проявлениями лепрозного процесса.
За диагностическую специфичность ИФА принимали процентное выражение частоты истинно отрицательных результатов ИФА у лиц, не имеющих лепры.
С использованием приведенных формул проводили сравнительную оценку диагностических тест-систем на основе ИФД с антигенами из M.leprae и из M.lufu (табл.З)
Таким образом, из данных табл. 3 видно, что при 100% чувствительности тест-система, в которой в качестве антигена использовали УЗД - M.lufu, обладает сопоставимой специфичностью и эффективностью с тест-системой, где в качестве антигена применяли УЗД- М.leprae.
Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в НИИ по изучению лепры Минздравмедпрома РФ в 1994-1995 годах.
Ниже приводятся результаты апробации способа.
Пример 1. Больная А (и/б N 3844) впервые поступила в НИИ по изучению лепры 29.05.93 г. При поступлении: лепрозный процесс распространенный. Брови, ресницы разрежены, отмечается глубокая диффузная инфильтрация кожного покрова лица, ушных раковин и мочек ушей, большое количество дермальных и гиподермальных лепром. Локтевые, малоберцовые нервы утолщены, болезненны при пальпации. Анестезия по стволовому типу до верхней трети плеч, бедер. Бактериоскопический индекс (БИН) = 1,83+. Гистологическое исследование биоптата кожи: активно формирующаяся гранулема лепроматозной структуры (лепрома) на фоне лепрозной узловатой эритемы. Диагноз: лепроматозный тип лепры.
Читайте также:
Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.
Copyright © Иммунитет и инфекции
