Иерсиниозу иммуноблот что это

Специфические иммуноглобулины класса IgG к бактериям Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, которые вырабатываются в организме при инфицировании данными микроорганизмами и указывают на острую или ранее перенесенную инфекцию – псевдотуберкулез или кишечный иерсиниоз.

Возбудители псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза.

Yersinia Species Antibodies, IgG.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Иерсинии – грамотрицательные палочки из семейства энтеробактерий. Y. pseudotuberculosis является причиной псевдотуберкулеза, Y. enterocolitica – кишечного иерсиниоза. Эти микроорганизмы опасны не только для человека, но и для многих животных. В распространении инфекции большое значение имеют грызуны. Бактерии устойчивы к окружающей среде, способны размножаться и накапливаться в почве, водопроводной воде, но быстро гибнут под действием солнечных лучей и при кипячении.

Источником инфекции может быть больной человек, животное или почва. Человек заражается в основном через мясо, рыбу, молоко, овощи, фрукты и сырую воду, а также при уходе за больными животными.

Отмечается сезонность инфекции – большинство случаев регистрируется в холодное время года, что связано с массовой миграцией грызунов в продуктовые хранилища. Возможны как единичные случаи заражения, так и эпидемические вспышки в коллективах.

Симптомыпсевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза очень схожи, и отличить возбудителей иногда возможно только с помощью лабораторных методов.

Тяжесть заболевания зависит от свойств (вирулентности) возбудителя, количества бактерий, попавших в организм, возраста инфицированного, состояния его иммунной системы и сопутствующих заболеваний, генетических особенностей. Чаще им страдают дети.

Инкубационный период псевдотуберкулеза составляет от 24 часов до 4 недель (в среднем 7-10 дней), при кишечном иерсиниозе он короче – от нескольких часов до 4-5 дней. Обычно все начинается с диареи, боли в животе и лихорадки, интоксикационного синдрома, причем диарея при кишечном иерсиниозе сильнее, а при псевдотуберкулезе слабее или вовсе может отсутствовать. На 1-4-й день болезни у 90 % инфицированных Y. pseudotuberculosis появляется скарлатиноподобная сыпь, отекают кисти и стопы. Заболевания могут как ограничиваться проявлениями острой кишечной инфекции с рвотой, диареей, так и иметь более распространенные формы с поражением мезентериальных лимфатических узлов, терминальным илеитом, мезаденитом или даже сепсисом. В некоторых случаях течение инфекции напоминает острый аппендицит. В патологический процесс нередко вовлекаются почки, печень, поджелудочная железа, сердечно-сосудистая и нервная система. Иногда развивается респираторный синдром с болями в горле, покраснением задней стенки глотки, отечностью неба, кашлем и заложенностью носа. При кишечном иерсиниозе возможен переход инфекции в хроническую форму.

После инфицирования Y. enterocolitica изредка бывают такие осложнения, как реактивный увеит, ирит, конъюнктивит, гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром, узловатая эритема.

Антитела класса IgG вырабатываются в первую неделю заболевания, достигают максимальной концентрации ко второй неделе и снижаются после пятой. После выздоровления пациента они циркулируют в его крови 12 месяцев и дольше.

Рекомендовано определять уровень антител в парных сыворотках, взятых в начале заболевания и через 7-10 дней. Четырехкратное возрастание уровня антител свидетельствует об острой инфекции – кишечном иерсиниозе или псевдотуберкулезе (в зависимости от вида возбудителя).

Для чего используется исследование?

Для диагностики псевдотуберкулеза и/или кишечного иерсиниоза.

Для дифференциальной диагностики острых кишечных инфекций.

Для дифференциальной диагностики острых инфекционных заболеваний с полиорганным поражением и скарлатиноподобной сыпью.

Для выявления ранее перенесенной (за последние 4-6 месяцев) иерсиниозной инфекции.

Для выяснения причин реактивного артрита.

Когда назначается исследование?

При симптомах острой кишечной инфекции (рвоте, диарее, лихорадке), сопровождающихся поражением печени, лимфатических узлов, скарлатиноподобной сыпью, отечностью кистей и стоп, артритами.

При наличии иерсиниозной инфекции в очаге заражения.

При обследовании пациента с реактивным артритом, болезнью Бехчета, синдромом Рейтера, инфекционными артропатиями.

Что означают результаты?

КП (коэффициент позитивности): 0 - 0,89.

текущая иерсиниозная инфекция (псевдотуберкулез / кишечный иерсиниоз),

ранее перенесенная иерсиниозная инфекция (псевдотуберкулез / кишечный иерсиниоз).

ранний период болезни (начало образования антител),

недавно перенесенная инфекция и снижение специфических антител.

При сомнительном результате анализ необходимо повторить через 10-14 дней.

отсутствие инфицирования иерсиниями,

ранний период инфицирования (до образования антител) или длительный период после выздоровления.

Возможна перекрестная реакция с антителами к возбудителям чумы (Yersinia pestis), болезни Лайма (Borrelia Burgdorferi), бруцеллеза и риккетсиоза, а также с тиреоидстимулирующим иммуноглобулином (при Базедовой болезни). В связи с этим при оценке результатов исследования важно учитывать клиническую картину заболевания.
У HLA-B27-положительных лиц более высокий риск развития реактивного артрита и аутоиммунных заболеваний при иерсиниозной инфекции.

Кто назначает исследование?

Литература

Возианова Ж. И. Инфекционные и паразитарные болезни: В 3х т. - К.: Здоровье, 2000 — Т.1.: 458-497.
Кишкун А. А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. - М.:ООО МИА, 2006 — 401-404 с.
Harrison's Principles of Internal Medicine. 16 th ed. NY: McGraw-Hill; 2005: 923-929.

Комплексное исследование для выявления возбудителя иерсиниоза (Yersinia enterocolitica) и псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis), включающее серологические тесты и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Анализы на иерсиниоз и псевдотуберкулез.

Laboratory Diagnostics of Yersiniosis, Enteropathogenic Yersiniae Lab Panel.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь, кал.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исследование рекомендуется проводить до начала приема антибиотиков и других антибактериальных химиотерапевтических препаратов.
Исключить прием слабительных препаратов, введение ректальных свечей, масел, ограничить (по согласованию с врачом) прием медикаментов, влияющих на перистальтику кишечника (белладонна, пилокарпин и др.), и препаратов, влияющих на окраску кала (железо, висмут, сернокислый барий), в течение 72 часов до сбора кала.
Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Иерсинии - это грамотрицательные, факультативно-анаэробные палочки, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae. Известно 11 видов иерсиний, три из которых являются возбудителями заболеваний человека: Yersinia pestis – это возбудитель чумы, Yersinia enterocolitica (Y. enterocolitica) и Yersinia pseudotuberculosis (Y. pseudotuberculosis) – кишечные патогены. Хотя Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis относятся к разным видам, они имеют много общего, особенно в плане клинической картины и диагностики.

Основной "резервуар" иерсиний - дикие и домашние животные (свиньи, грызуны, овцы, козы, коровы, собаки, кошки и птицы). Считается, что человек не участвует в естественном жизненном цикле этих патогенов ни в качестве промежуточного, ни окончательного хозяина и его заражение, таким образом, носит случайный характер. Как правило, заражение кишечными иерсиниями происходит фекально-оральным путем при употреблении контаминированных продуктов питания (молочные продукты, сырое или плохо приготовленное мясо, особенно свинина). Как Y. enterocolitica, так и Y. pseudotuberculosis сохраняют жизнеспособность в условиях пониженных температур. Случаи передачи инфекции от человека к человеку или при переливании инфицированной крови описаны, но очень редки.

Следует отметить, что не все кишечные иерсинии являются патогенами. Так, к развитию заболевания у человека приводят серотипы Y. enterocolitica O:3, O:8, O:9 и O:5,27 и Y. pseudotuberculosis O:1 и O:2. Только указанные серотипы являются истинно энетропатогенными иерсиниями.

Особенностью энтеропатогенных иерсиний является их тропность к лимфатичекой ткани. Проникая через слизистую оболочку кишечника, эти микроорганизмы попадают в мезентериальные лимфатические узлы. Развивающийся воспалительный ответ сопровождается болью в области живота и диареей, а также мезентериальным лимфаденитом. У иммунокомпетентных лиц заражение энтеропатогенными иерсиниями чаще ограничивается гастроэнтеритом и регионарным лимфаденитом. Если возбудителем заболевания является Y. enterocolitica, говорят об иерсиниозе, если Y. pseudotuberculosis – о псевдотуберкулезе. Иерсиниоз встречается чаще, чем псевдотуберкулез. Как при иерсиниозе, так и при псевдотуберкулезе могут наблюдаться иммунопатологические феномены в виде реактивного артрита и узловатой эритемы. У лиц с иммунодефицитом, а также маленьких детей могут наблюдаться тяжелые формы иерсиниоза и псевдотуберкулеза с диссеминацией бактерий и сепсисом.

Диагностика иерсиниоза и псевдотуберкулеза достаточно сложна. Хотя бактериологический посев кала (крови или других биологических материалов) считается "золотым стандартом" диагностики, он трудноосуществим. Это связано с тем, что энтеропатогенные иерсинии сложно отличить от других кишечных микроорганизмов, которые в норме преобладают в кишечной флоре. После выявлении роста иерсиний проводят дополнительные биохимические тесты, устанавливающие их энтеропатогенность. Кроме того, метод бактериологического посева характеризуется достаточно низкой чувствительностью (для получения результата необходимо 10 3 -10 6 КОЕ в грамме образца биоматериала). Учитывая эти особенности, диагностика иерсиниоза и псевдотуберкулеза носит комплексный характер и включает следующие дополнительные тесты:

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – один из методов молекулярной диагностики, в ходе которого определяется генетический материал (ДНК) микроорганизма в образце биоматериала (в кале). Основными преимуществами ПЦР являются быстрота получения результата, высокая чувствительность и специфичность. В данное комплексное исследование входит анализ ПЦР на Y. pseudotuberculosis.
Серологические тесты. Антитела к энтеропатогенным иерсиниям обычно могут быть определены в первые 2-4 недели болезни (IgM-антитела). Следует отметить, что из-за определенного антигенного сходства Yersinia с бактериями других родов (Salmonella, Morganella, Brucella) серологические тесты могут давать ложноположительные результаты. Еще одним недостатком серологических тестов является то, что антитела к иерсиниям (IgG-антитела) сохраняются в течение нескольких лет после инфицирования, что может препятствовать интерпретации результата. Следует помнить, что результат серологических тестов зависит от иммунного статуса организма.

Точность ПЦР и серологических тестов в меньшей степени, чем бактериологического метода, подвержена влиянию антибактериальных препаратов. Однако максимально точный результат теста будет получен при анализе биоматериала, полученного до начала лечения.

Гастроэнтерит, возникающий при инфицировании энтеропатогенными иерсиниями, сложно отличить от сальмонеллеза, кампилобактериоза и других кишечных инфекций. По этой причине часто требуются дополнительные лабораторные анализы.

Для чего используется исследование?

Для диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Когда назначается исследование?

При подозрении на иерсиниоз или псевдотуберкулез: лихорадка, тошнота, боли в животе (боль может локализоваться в правой паховой области), диарея, а также узловатая эритема или реактивный артрит;
в некоторых случаях при подозрении на острый аппендицит.

Что означают результаты?

Для каждого показателя, входящего в состав комплекса:

Кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез – две самостоятельные, имеющие много общих черт зоонозные инфекции с фекально-оральным механизмом передачи. Клинические проявления этих заболеваний полиморфны и включают симптомы поражения ЖКТ в некоторых случаях со склонностью к генерализации инфекции, развитием экзантемы, в отдельных случаях с последующими поражениями опорнодвигательного аппарата.

Возбудители данных заболеваний относятся к роду Yersinia, сем Enterobacteriaceae. Вид Y.enterocolitica в настоящее время насчитывает 6 биоваров и более 50 серогрупп, из которых 5 наиболее часто вызывают заболевания у человека. Вид Y.pseudotuberculosis включает 21 серотип, объединенный в 5 биоваров.

Несмотря на существенное снижение заболеваемости псевдотуберкулезом и кишечным иерсиниозом в последние годы, сохраняются территории с эндемично высокими показателями заболеваемости. Кроме того, эти заболевания продолжают представлять значительную проблему для лиц в отдельных изолированных коллективах (воинские части и др.).

Показания к обследованию

Пациенты с ОКИ при наличии эпидемиологических показаний (проживание на эндемичной территории, принадлежность к группе риска);
пациенты с особенностями клинической симптоматики ОКИ (сочетание ОКИ с катаральной симптоматикой, экзантемой, периферической лимфаденопатией, суставным синдромом) при отрицательных результатах выявления более распространенных патогенов.

Материал для исследований

Образцы фекалий – культуральные исследования, выявление АГ, ДНК;
сыворотка крови – обнаружение АТ.

Этиологическая лабораторная диагностика включает выделение чистой культуры с дальнейшей идентификацией возбудителя; обнаружение НК и АГ патогенов, выявление специфических АТ.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Наиболее информативным методом лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза является культуральный в сочетании с адекватными методами видовой идентификации возбудителя. Обязательным этапом исследования при выявлении Y.enterocolitica является определение вирулентных свойств выделенного изолята. Антигенная характеристика изолята не может служить прямым доказательством наличия у него вирулентных свойств и его этиологической связи с картиной заболевания.

Выявление ДНК патогенов с использованием ПЦР применяется для скрининговой диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза в острой фазе заболевания. Тест наиболее адаптирован для скрининговых исследований, что связано с его оперативностью и возможностью детектировать нежизнеспособные на фоне антибиотикотерапии формы микроорганизмов. Обязательным требованием к диагностическим тестам данной группы является возможность определять не только видовую принадлежность изолята, но и гены ключевых факторов вирулентности (для Y.еnterocolitica), а также отсутствие перекрестных реакций с близким в филогенетическом плане видом (в случае Y.pseudotuberculosis – Y.рestis).

Для выявления АТ применяют наборы реагентов с использованием ИФА (в РФ мало распространены), а также РА и РНГА. Выявление специфических АТ малоинформативно в первую неделю заболевания, но позволяют уточнять его этиологию в более поздние сроки при отрицательных результатах прямых методов выявления возбудителей.

Показания к применению различных лабораторных исследований. Для применения прямых методов выявления Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis следует использовать образцы фекалий, забранные у пациента в первые 3–5 дней заболевания до начала антибактериальной терапии. При проведении исследований в очагах групповой заболеваемости или решении других эпидемиологических задач целесообразно применение культурального исследования для изоляции штамма микроорганизма и возможностью его последующей характеристики по ферментативным и антигенным свойствам. Выявление ДНК возбудителей методом ПЦР оправдано при решении задач диагностики, обследовании пациентов на фоне антибиотикотерапии или в качестве скринингового этапа исследования.

Выявление АТ к указанным возбудителям целесообразно при неинформативности результатов прямых методов выявления патогенов. Рекомендовано выполнение исследования в образцах крови, взятых в динамике (конец первой недели и начало третьей недели заболевания). При интерпретации результатов таких исследований следует учитывать наличие у иерсиний АГ, вызывающих перекрестные реакции (возможность ложноположительных результатов).

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Факт обнаружения Y.enterocolitica или ее ДНК в фекалиях у пациентов с острыми диарейными заболеваниями недостаточен для установления иерсиниозной этиологии заболевания. Лабораторным подтверждением диагноза кишечного иерсиниоза служит выявление штаммов возбудителя, обладающих факторами вирулентности (или их генами). Выявление Y.pseudotuberculosis или ее ДНК методом ПЦР является достаточным для подтверждения диагноза псевдотуберкулеза.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Кокорина, Галина Ивановна. Генотипы штаммов Yersinia pseudotuberculosis и их клиническое и диагностическое значение : диссертация . кандидата медицинских наук : 03.02.03 / Кокорина Галина Ивановна; [Место защиты: ГОУВПО "Военно-медицинская академия"].- Санкт-Петербург, 2013.- 133 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность темы исследования

Псевдотуберкулез остается актуальной проблемой здравоохранения в России и во многих странах мира. Заболевание отличают выраженный полиморфизм клинических проявлений, отсутствие четких патогномоничных симптомов, склонность к затяжному и хроническому течению. Между тем причины, обуславливающие данное многообразие и сложность патогенеза, остаются невыясненными.

Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды. В этой связи чрезвычайно актуально изучение роли детерминант вирулентности Y. pseudotuberculosis, влияния их продуктов на течение инфекционного процесса и территориальное распространение бактерий.

В отдельных работах предприняты попытки объяснить разнообразие клинических форм псевдотуберкулеза за счет наличия у возбудителя тех или иных генетических детерминант вирулентности (Fukushima H. et al., 2001; Carniel E., 2001; Mollaret H., 1990; Чеснокова М.В. и соавт., 2006). Типичный для России симптомокомплекс псевдотуберкулеза получил название – дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. Основные клинические симптомы инфекции, вызванной Y.pseudotuberculosis в России, Японии и Южной Корее разнообразнее и тяжелее, чем на Европейских территориях и характеризуются системными проявлениями болезни.

Открытие способности к синтезу суперантигена и установление его роли в патогенезе инфекции позволили пересмотреть механизм появления некоторых симптомов при псевдотуберкулезе. В настоящее время с продукцией Y. pseudotuberculosis суперантигена YPMa связывают такие иммунопатологические осложнения псевдотуберкулеза, как реактивный артрит, синдром Рейтера, острый увеит и синдром Кавасаки (Sato К. et al., 1983; Treacher D. et al., 1986; Baba K. et al., 1991).

Особый интерес представляет плазмида с молекулярной массой 82 МДа (pVM82), обнаруживаемая до настоящего времени у штаммов Y..pseudotuberculosis серотипа О:1b только в России, и не встречающаяся у других представителей рода Yersinia. Доказано, что наличие плазмиды pVM82 у возбудителя способствует более тяжелому течению инфекции (Шурыгина И.А., 2007).

Учитывая многообразие вариантов течения болезни, обусловленного различиями в патогенных свойствах возбудителя псевдотуберкулеза, для клинической практики актуально, прежде всего, изучение биологических характеристик штаммов Y. pseudotuberculosis циркулирующих на различных территориях. Вместе с тем, для оптимизации мониторинга за возбудителем, а также выбора тактики обследования больных требуются наиболее полные знания о влиянии возбудителя псевдотуберкулеза с различным набором генетических детерминант вирулентности на патогенез и совершенствование специфической диагностики инфекции.

Ограниченные возможности распознавания случаев заболевания иерсиниозами, в частности псевдотуберкулеза, на поздних сроках приводят к гиподиагностике, развитию хронических форм (до 30% случаев) и осложнений. Это обуславливает необходимость поиска новых более чувствительных методов этиологической диагностики заболевания.

В связи с изложенным, представлялось актуальным изучение генетических характеристик штаммов возбудителя псевдотуберкулеза и разработка набора для серологической диагностики иерсиниозов.

Степень разработанности темы исследования

До настоящего времени не определена последовательность нуклеотидов плазмиды Y. pseudotuberculosis pVM82, способствующей более тяжелому течению инфекции, не установлены гены плазмиды, оказывающие влияние на вирулентность бактерии. Методом дот-блот гибридизации не была исследована коллекция штаммов Y..pseudotuberculosis на наличие генов вирулентности icm/dot системы секреции IVB типа и umuDC плазмиды pVM82, выделенных в разных регионах мира.

Ранее изучена коллекция штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на пяти континентах на наличие генетических детерминант вирулентности: генов суперантигена уpmА, уpmB и уpmC; HPI и R-HPI и pVM 46 МДа. При этом исследований на выявление плазмиды pVM82; YAPI и L-YAPI не проводилось. Фрагментарные сведения имеются относительно определения плазмиды pVM82, генов суперантигена и HPI у штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока. Штаммы из Северо-Западного региона, Украины на наличие генетических детерминант вирулентности не изучались.

При генотипировании штаммов Y. pseudotuberculosis по содержанию уpmА, уpmB и уpmC; HPI и R-HPI и pVM 46 МДа, выделенных на пяти континентах, охарактеризовано 6 генетических групп штаммов. Было установлено, что для территорий России (исследованы только дальневосточные штаммы), Японии и Кореи для штаммов Y..pseudotuberculosis характерно содержание уpmА и отсутствие HPI. В то же время для штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на всех остальных территориях мира, главным образом, характерно содержание HPI и отсутствие уpmА, что свидетельствует о взаимосвязи наличия этих детерминант вирулентности с клиническими симптомами псевдотуберкулеза, различными для этих территорий. Описаны клинические проявления псевдотуберкулеза у больных, от которых выделены штаммы 2 (HPI + ), 3 (ypmA + ) и 5 (R-HPI + ypmС + ) генетических групп. В то же время по содержанию генов pVM82, YAPI и L-YAPI генотипирование не проводилось, хотя ранее было доказано, что наличие плазмиды pVM82 оказывает влияние на тяжесть течения псевдотуберкулеза.

Цель исследования

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Y..pseudotuberculosis и совершенствование этиологической диагностики иерсиниозов.

Задачи работы:

Изучить наличие генетических детерминант вирулентности у штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных в различных географических регионах мира.

Охарактеризовать генотипы штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения и их распространенность в разных регионах мира.

Установить особенности клинического течения псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis различных генотипов.

Разработать набор для серологической диагностики иерсиниозов.

Научная новизна:

С использованием метода дот-блот гибридизации у штаммов Y..pseudotuberculosis различного происхождения выявлена плазмида pVM82, несущая гены вирулентности, основные из них - гены icm/dot системы секреции IVB типа, опосредующие внутриклеточное персистирование микроорганизма в эпителиальных клетках, что может обуславливать скарлатиноподобные проявления заболевания.

Впервые изучена распространенность pVM82 у представителей мировой популяции Y. pseudotuberculosis.

На основании содержания основных генетических детерминант вирулентности: pVM82, генов суперантигена, YAPI и HPI выделено 14 генотипов штаммов Y. pseudotuberculosis. Показано распространение штаммов Y..pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран пяти континентов.

Установлено, что псевдотуберкулез с симптомами ДСЛ вызывают все штаммы Y. pseudotuberculosis, обладающие геном ypmA, кодирующим YPMa.

Получены новые знания о тяжести течения псевдотуберкулеза, обусловленного штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 3a, 3b, 3c. Полученные данные могут свидетельствовать о более тяжелом течении инфекции, вызванной штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 3b (ypmA + L-YAPI + ) и 3c (ypmA + L-YAPI + pVM82 + ), по сравнению с инфекцией, обусловленной штаммами Y..pseudotuberculosis генотипа 3a (ypmA + ).

Практическая значимость работы:

Изученные российские штаммы Y. pseudotuberculosis и их характеристики представлены в коллекции лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург.

Для повышения эффективности диагностики псевдотуберкулеза обоснованы показания к обследованию больных с симптомами острого аппендицита, мезентериального лимфаденита и гастроэнтеральными симптомами с целью выявления их инфицированности Y. pseudotuberculosis генотипов 2a и 2b, вызывающих инфекцию с абдоминальными проявлениями.

Для микробиологического мониторинга за возбудителем псевдотуберкулеза предложена методика генотипирования штаммов Y..pseudotuberculosis.

Разработана методика конструирования набора для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, A, и M в крови или плазме человека методом иммуноблота.

На основе результатов работы подготовлены следующие документы:

Методология и методы исследования

В соответствии с целью и задачами исследования был использован следующий материал и применены методы, представленные в таблице 1.

Таблица 1. Объем проведенных исследований различными методами

Для выполнения исследований использовано 309 штаммов Y..pseudotuberculosis: 232 из коллекции Национального Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами и 77 штаммов из Коллекции Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера за период 1989 по 2008 гг. В работе использовано 4 референс-штамма, содержащие различные детерминанты вирулентности Y. pseudotuberculosis из Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера. Плазмида pVM82 выделена из штамма Y. pseudotuberculosis IP31758, изолированного от больного псевдотуберкулезом с типичными симптомами ДСЛ.

Серотипирование культур Y. pseudotuberculosis осуществляли в мультиплексной ПЦР с использованием специфичных праймеров по методике Bogdanovich T. (2003) или с применением набора коммерческих моновалентных сывороток (производства ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) к серотипам Y. pseudotuberculosis О:1 и О:3 с помощью реакции агглютинации на стекле.

Выделение тотальной бактериальной ДНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции (Carniel E., 1989).

Методом дот-блот гибридизации или ПЦР проведена детекция генов ypmB, ypmA/C, irp2, fyuA, pilPQ, api 74, yopM, yscQ, dot O, mucAB.

Для дот-блот гибридизации денатурированную ДНК штаммов наносили по 5 мкл на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Hybond N + ; Amersham, Англия), фиксировали, облучая ультрафиолетовыми лучами в течение 4 минут с использованием прибора GS Gene Linker UV Chamber (Bio Rad) в режиме C3. Зонды получали с помощью ранее известных (Carnoy C., 1999; Schubert S., 1998; Collyn F. 2004; Collyn F. 2005; ., 1996) и сконструированных праймеров, синтезируя их методом ПЦР. Праймеры разработаны с помощью программы OFD Method и BlastN. Продукты амплификации были очищены от агарозы и примесей с помощью набора микроколонок QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Мечение продукта ПЦР пероксидазой и использование его в качестве комплементарного ДНК-зонда для гибридизации с фиксированными на мембране ДНК исследуемых штаммов осуществляли при 42 о С с помощью набора реагентов для мечения ECL (ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems; Amersham, Англия). Для выявления ДНК иерсиний, гибридизованных с зондами, мембрану обрабатывали с помощью набора реагентов ECL и экспонировали в течение 30 минут на светочувствительной пленке Hyperfilm ECL, помещенной в кассету.

ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации на приборе PTC-100 (MJ Pesearch, Inc). Финальный объем реакционной смеси составил 50 мкл и содержал 1,25 U Taq ДНК полимеразы (Roche/Cetus) с прилагаемым буфером, MgCl₂ в концентрации 2 мМ и по 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозид- трифосфатов. Все праймеры использовали в финальной концентрации 0,3 мкМ. ПЦР проводили по программе: 1 цикл 94 0 С -3 мин; 30 циклов амплификации 94 0 С - 30 сек, 55 0 С – 1 мин, 72 0 С – 2 мин; 72 0 С – 10 мин. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием этидий бромидом и последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете.

Для секвенирования генов ypmA и ypmC проводили ПЦР со штаммами Y. pseudotuberculosis с использованием праймеров к гену ypmA. Продукт ПЦР очищали, применяя набор микроколонок QIAquick PCR purufication Kit (Qiagen). Секвенирование проводили, используя Big Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit (Perkin-Elmer) и ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin-Elmer).

Электрофорез белков проводили по Laemmli (1970), с использованием камеры для вертикального электрофореза Mini-Protean Tetra Cell; Bio-Rad, США. Для переноса белков на НЦМ по Towbin H (1992) полусухим методом применяли аппарат Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell; Bio-Rad, США.

Для выявления антител к иерсиниям методом иммуноблота использован диагностический набор Иммуноблот (А), разработанный в ходе настоящего исследования.

Применяли РНГА с коммерческими эритроцитарными диагностикумами: псевдотуберкулезным и кишечноиерсиниозными О:3 и О:9 (НИИВС, Санкт-Петербург).

Для постановки РА использовали иерсиниозные корпускулярные антигены серотипов: Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 и О:3, Y. enterocolitica серотипов О:3; О:5,27; О9 (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Для штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территории России и Японии, в сравнении со штаммами, выделенными на территории Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки характерно наличие различных генетических детерминант вирулентности (ypmA, ypmB, ypmС, HPI, R-HPI, YAPI, L-YAPI, pVM82).

У штаммов Y. pseudotuberculosis охарактеризовано 14 генотипов:1a (HPI + ypmA + ), 2a (HPI + ), 2b (HPI + L-YAPI + ), 2c (HPI + YAPI + ), 3a (ypmA + ), 3b (ypmA + L-YAPI + ), 3c (ypmA + L-YAPI + pVM82 + ), 3d (ypmA + pVM82 + ), 4 (ypmB + ), 5a (R-HPI + ypmC + ), 5b (R-HPI + ypmC + L-YAPI + ), 6a (HPI - ypm - YAPI - pVM82 - ), 6b (L-YAPI + ), 6c (pVM82 + ). Установлена особенность распространенности штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран мира пяти континентов.

У больных псевдотуберкулезом, от которых выделены штаммы генотипов 3b и 3c достоверно чаще выявляются поражения печени, что утяжеляет течение болезни, по сравнению с пациентами, заболевание которых обусловлено Y. pseudotuberculosis генотипа 3a.

Применение набора, разработанного для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, A, и M в образцах крови или плазмы человека методом иммуноблота, позволяет проводить этиологическую диагностику иерсиниозов, в том числе с хроническим течением. Чувствительность диагностического набора составляет 90,9±2,7%, специфичность 95,2±3,3%.

Степень достоверности и апробация результатов:

Штаммы Y. pseudotuberculosis, использованные в работе выделены от больных, животных, с продуктов питания в ходе расследования вспышек псевдотуберкулеза, а также спорадических случаев заболевания и при текущем эпидемиологическом надзоре. Больные включены в исследование на основании лабораторного подтверждения диагноза иерсиниозной инфекции при отрицательных результатах обследования на другие инфекции вирусной и/или бактериальной этиологии, за исключением сопутствующих инвазий, а также при отсутствии соматической патологии.

Статистическая обработка данных проведена методами статистического анализа при помощи стандартных пакетов программ STATISTICA 6.0. Для оценки достоверности различий между несколькими группами наблюдений использованы методы дисперсионного анализа. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t) и величины вероятности (p). За достоверность различий принимали значение р Генотипы штаммов Yersinia pseudotuberculosis и их клиническое и диагностическое значение

Читайте также: