Диагностический набор листериозных бактериофагов

Цель занятия. Ознакомить студентов с действием бактериофа­гов и их практическим использованием.

Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма L. monocytogenes, набор листериозных бактериофагов, стериль­ный МПБ, содержащий 0,5 % глюкозы, 2%-й МПА в чашках Петри, стерильные пипетки Пастера, лечебно-профилактичес­кий бактериофаг против паратифа и колибактериоза телят, чув­ствительная к фагу культура Е. coli.

Бактериофаги представляют собой вирусы, адаптировавшиеся в процессе эволюции к паразитированию в прокариотических клетках (рис. 47). Репродукция многих бактериофагов в клетке приводит к ее лизису. На специфической адаптации фагов к строго определенным видам (штаммам) бактерий и внешнем проявлении поражения бактериальных клеток (лизис) основано практическое использование бактериофагов: при помощи извес­тного (диагностического) фага можно обнаружить и идентифи­цировать бактерии. Кроме того, биологическая промышленность выпускает лечебно-профилактические бактериофаги.

Определение литической активности бактериофага. У диагнос­тических и лечебно-профилактических фагов должна быть выра­жена литическая активность, которую определяют путем титро­вания фагов, например, в жидкой питательной среде.

В бактериологические пробирки разливают по 4,5 мл стериль­ного МПБ; в первую пробирку вносят 0,5 мл исследуемого фага, затем готовят его десятикратные разведения от 10

' до Ю-'0. К разведениям бактериофага добавляют по капле суточной бульон­ной культуры чувствительного к данному фагу вида бактерий, инкубируют при 37 °С 24 ч. За титр фага принимают его макси­мальное разведение, еще способное вызвать лизис бактерий — среда в пробирке прозрачна. Фаг считают активным при титре 10 -7 , 10 -8

Рис. 47. Схема строения фага Т2 по данным электронной микроскопии: а — с нуклеиновой кислотой в головке: 1 — головка; 2— полая центральная часть; 3 — оболочка (расправленная); 4— базальная пла­стинка; б —без нуклеиновой кислоты в го­ловке: I — головка; 2 — оболочка (сокрашенная); 3 — хвостовые нити

Определение количества бактериофага (по методу Грациа). Го­товят десятикратные разведения исследуемого фага в физиологи­ческом растворе (10 -1 …10 -2 и т.д.), затем из последнего разведе­ния, например 10 -7 или 10 -8 , берут 0,5 мл жидкости, смешивают с равным объемом чувствительной к данному бактериофагу буль­онной культуры бактерий. Полученную смесь добавляют к 4 мл расплавленного 0,7%-го МПА (температура 45 °С), перемешива­ют и выливают на поверхность подсушенного питательного агара в чашку Петри. Аналогичным образом поступают со всеми разведениями бактериофага (10 -5 , 10 -5 и т.д.). Чашки инкубируют в термостате при 37 ºС 24 ч.

Применение фагов для идентификации бактерий. Фаги приме­няют для видовой идентификации бактерий (возбудитель сибир­ской язвы, листериоза и др.) или внутривидовой — установление фаговара конкретного бактериального штамма.

Для идентификации неизвестной культуры бактерий при по­мощи диагностического бактериофага обычно используют плот­ную питательную среду. Например, исследуемую 18-часовую культуру, предположительно листерий, засевают в МПБ с глюко­зой, инкубируют при 37 °С 4 ч до легкой опалесценции среды и затем засевают газоном (0,1мл) на подсушенный 2%-й МПА в чашку Петри. Через 1. 1,5 ч инкубирования посевов при 37 ºС при слегка приоткрытой крышке на одну половину газона нано­сят каплю листериозного бактериофага 2А и на вторую половину помещают каплю фага 4А. Посевы инкубируют при 22. 25 °С 16. 24ч.

Учет результатов: если культура листериозная, то на месте нане­сения хотя бы одного фага можно видеть прозрачную зону лизиса.

Для установления фаговара исследуемую культуру проверяют с набором типовых фагов, охватывающих все фаговарианты дан­ного вида бактерий, определяют, к какому фагу чувствителен данный штамм, что и служит его маркером.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить активность лечебно-профилактического коли-па-ратифозного фага по отношению к исследуемой культуре Е. coli.

2. Провести идентификацию культуры L. monocytogenes при помощи листериозных диагностических фагов.

1.Что такое бактериофаг?

2.Как используют бактериофаги?

3.Какими методами титруют бактериофаги?

Дата добавления: 2014-11-10 ; просмотров: 3015 . Нарушение авторских прав

Представленный способ получения бактериофага включает: засев бактериальной культуры штамма-хозяина в титре 10 8 -10 9 КОЕ/мл в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивирование в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 10 5 -10 6 БОЕ/мл и культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм. Получают фаголизат и отсасывают в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании. Центрифугируют и стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм. Охарактеризованное решение обеспечивает универсальную возможность получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильность титра бактериофагов в фаголизате и возможность его применения для использования в пищевой промышленности 2 з.п. ф-лы, 3 пр.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии получения продукции, содержащей бактериофаги.

Бактериофаги - это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному штамму или антигенно-гомологичным штаммам одного вида или рода с последующим лизисом (после внутриклеточной репликации) клетки-хозяина - вирулентные фаги или интегрированием в бактериальный геном с образованием лизогенов - умеренные фаги (Adams H.M. Bacteriophages. - New York: Interscience Publishers, Inc., London: Interscience Publishers ltd., 1959. - 592 p.). По многочисленным данным литературы, фаги могут быть использованы в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур (Alisky J., Iczkowski К., Rapoport,A., Troitsky N. Bacterio-phages show promise as antimicrobial agents // The Journal of infection. - 1998. - Vol.36, № 1. P.5-15; Brussow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience // Microbiology. - 2005. - Vol.151, Pt.7. - P.2133-2140; Бондаренко В.М. Клинический эффект и пути рационального использования лечебных бактериофагов в медицинской практике // Приложение к Журналу инфектологии. - 2011. - Т.3, № 3. - С.15-19). Ряд авторов допускают возможность практического применения бактериофагов как средств деконтаминации в пищевой промышленности как безопасной для человека и безвредной для окружающей среды альтернативы химическим и физическим методам элиминации бактерий (Greer G.G. Bacteriophage control of foodborne bacteria // Journal of food protection. - 2005. - Vol.68, № 5. - P.1102-1111; Lang L.H. FDA approves use of bacteriophages to be added to meat and poultry products // Gastroenterology. - 2006. - Vol.131, № 5. - P.1370-1372; Алешкин А.В., Зейгарник М.В. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств деконтаминации в области питания // Вопросы диетологии. - 2012. - Т. 2, № 4. - С.24-34).

Одним из приоритетных показателей производства фагосодержащей продукции является получение фаголизатов с исходно высоким титром бактериофагов (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С.17-19).

Известным, предложенным для различных бактериофагов способом получения фаголизатов с высоким титром бактериофагов является культивирование бактерий штамма-хозяина с бактериофагом на плотной питательной среде с последующим получением суспендированного фаголизата с поверхности плотной питательной среды (SU 64612, 30.04.1945; Кузьмин Н.А., Комаров Б.А. Способ быстрого получения сибиреязвенных фагов в высоких концентрациях // Лабораторное дело. - 1967. - № 12. - С.741-743).

Основными недостатками данных аналогов заявляемого изобретения являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и отсутствие или недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении фаголизата с титром бактериофага 10 11 -10 13 БОЕ/мл.

Наиболее близким аналогом - прототипом - является способ получения концентрированных препаратов фага, заключающийся в посеве на чашки с агаром смеси из концентрированной культуры бактерий и фага в количестве, достаточном для получения сплошного лизиса. После инкубации при 37°C в течение 12-18 часов в чашки наливают 3-5 мл бульона и оставляют на 20 минут. Затем бульон сливают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают. Согласно прототипу приготовленный таком образом фаг может содержать 10 11 -10 12 частичек на 1 мл (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С.18).

Основными недостатками прототипа являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 10 11 -10 13 БОЕ/мл.

Главной задачей заявляемого изобретения является обеспечение универсальности способа получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильности титра бактериофагов в фаголизате с его очисткой для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 10 11 -10 13 БОЕ/мл.

Задача решена тем, что бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 10 8 -10 9 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 10 5 -10 6 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования, культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см 2 поверхности плотной питательной среды, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30-45 минут при 5000-6000 об./мин, стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. После центрифугирования можно смешивать надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги, затем стерилизовать смесь надосадочных жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускать полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. В качестве сосуда для культивирования можно использовать стеклянный микробиологический матрац.

В результате впервые проведенных нами исследований была определена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков: установлены универсальные, промышленно применимые условия эффективного культивирования бактериофагов (форма и толщина слоя плотной питательной среды, толщина слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды, герметизация сосуда для культивирования), подобран титр маточного бактериофага, определены варианты и количества суспендирующего раствора, необходимые для обеспечения высокой концентрации бактериофагов в фаголизате и качественной очистки фагов, предложена оптимальная последовательность и продолжительность операций очистки фаголизата.

Из патентно-технической литературы и практики производства фагосодержащей продукции неизвестно о способе получения бактериофага с использованием культивирования бактериофагов на культуре бактерий на плотной питательной среде, который был бы идентичен заявляемому.

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - обеспечения универсальности способа получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильности титра бактериофагов в фаголизате с его очисткой для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 10 11 -10 13 БОЕ/мл.

Заявляемое изобретение апробировано при получении вариантов очищенного фаголизата, содержащего различные бактериофаги. Ниже приводятся результаты этой апробации. При этом приведенные примеры получения бактериофагов показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 10 8 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 10 5 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,04 мл на 1 см 2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 30 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 30 минут при 6000 об./мин, стерилизовали надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученный очищенный фаголизат в виде элюата содержал бактериофаги в титре 10 13 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 единиц эндотоксина на 1 мл очищенного фаголизата (ЕЭ/мл).

Пример 2. Для получения бактериофага, активного в отношении Escherichia coli O104:H4, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Escherichia coli К 12 С600 - в титре 10 9 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,2 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Escherichia coli К12 С600 засевали маточный бактериофаг в титре 10 6 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 14 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,0 в количестве 0,042 мл на 1 см 2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 40 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 40 минут при 5500 об./мин.

Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 10 9 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 10 5 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+22°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,2 в количестве 0,045 мл на 1 см 2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 45 минут при 5000 об./мин.

Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.

Смесь надосадочных жидкостей стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала эшерихиозный бактериофаг в титре 10 1 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 10 11 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.

Пример 3. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 10 8 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 10 5 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,1 в количестве 0,042 мл на 1 см 2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 32 минуты при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 32 минуты при 6000 об./мин.

Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 10 9 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 10 5 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+24°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,2 в количестве 0,045 мл на 1 см 2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 45 минут при 5000 об./мин.

Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.

Смесь надосадочных жидкостей стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала сальмонеллезный бактериофаг в титре 10 12 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 10 11 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения бактериофага с использованием культивирования бактериофагов на культуре бактерий на плотной питательной среде, отличающийся тем, что бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 10 8 -10 9 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 10 5 -10 6 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования, культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см 2 поверхности плотной питательной среды, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30-45 минут при 5000-6000 об./мин, стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после центрифугирования смешивают надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги, затем стерилизуют смесь надосадочных жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сосуда для культивирования используют стеклянный микробиологический матрац.

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

• Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
• Курьерская доставка (7 дней)
• Самовывоз из московского офиса
• Почта РФ

Оглавление

1. Общие положения

2. Применение набора

3. Методика исследования

4. Учет результатов

Классы МПК:	C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их A61K35/76 вирусы
Автор(ы):	Киселева Ирина Анатольевна (RU) , Алешкин Андрей Владимирович (RU) , Верёвкин Владимир Васильевич (RU) , Светоч Эдуард Арсеньевич (RU) , Афанасьев Станислав Степанович (RU) , Рубальский Евгений Олегович (RU) , Рубальская Елена Евгеньевна (RU) , Рубальский Максим Олегович (RU) , Ефимова Ольга Григорьевна (RU) , Васильев Дмитрий Аркадьевич (RU) , Золотухин Сергей Николаевич (RU)
Патентообладатель(и):	Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Приоритеты:

Дата введения	01.02.2020
Добавлен в базу	01.02.2020
Актуализация	01.02.2020

• Раздел Экология
  • Раздел 11 ЗДРАВООХРАНЕНИЕ
    • Раздел 11.220 Ветеринария

Издан

Агропромиздат

1986 г.

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

ИССЛЕДОВАНИЯ В ВЕТШ/1НАРИИ

Под редакцией Б. И. АНТОНОВА

МОСКВА АГРОПРОМИЗДАТ 1986

Временные методические указания по обнаружению возбудителя копытной гнили в патологическом материале от больных овец с помощью непрямого метода иммунофлуоресценции . 59

Наставление по диагностике бруцеллеза животных . 60

Наставление по диагностике паратуберкулезного энтерита

(паратуберкулеза) крупного рогатого скота . 89

Методика обнаружения в патологическом материале возбудителей туберкулеза и паратуберкулеза методом люминесцентной микроскопии. 92

Временное наставление по' постановке реакции связывания комплемента для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота и овец с антигеном Сибирского научно-исследовательского ветеринарного института . 94

Методические указания по лабораторной диагностике сапа 104

Кампилобактериоз (вибриоз). 112

Извлечение из временной инструкции по диагностике, профилактике и ликвидации вибриоза крупного рогатого скота и овец. 112

Наставление по применению кампилобактериозных (вибриозных) люминесцирующих сывороток при лабораторной диагностике кампилобактериоза (вибриоза) животных . 120

Рекомендации Центральной ветеринарной лаборатории по приготовлению и применению сафранино-жел зо-новобиоци-

Наставление по применению вибриозных агглютинирующих моноспецифических сывороток. 116

новой среды (СЖН) при лабораторной диагностике вибриоза 123 Временные рекомендации Центральной ветеринарной лаборатории по приготовлению и применению плотной среды ВИЭВ

для изоляции кампилобактерий. 125

Наставление по применению кампилобактериозного (вибри-озного) антигена для реакции агглютинации с вагинальной

слизью (РАВС). 126

Методические указания по лабораторной диагностике леп-

тоспнроза животных. 128

Методические указания по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток. 146

Методические указания по применению флуоресцирующего

глобулина для диагностики лептоспироза . 148

Наставление по лабораторной диагностике листериоза животных . 151

Методические указания по применению набора лиофилизи-рованных бактериофагов для идентификации возбудителя

Рожа свиней. 170

Методические указания по лабораторным исследованиям на

рожу свиней. 170

Наставление по применению сухих рожистых люминесцирующих сывороток (для прямого метода иммунофлуоресценции) . 173

Наставление по лабораторной диагностике пастереллеза птиц 175

Методические указания по бактериологической диагностике

сальмонеллезов животных. 177

Наставление по применению наборов сывороток сальмонел-лезных О-комплексных и монорецепторных О и Н-агглюти-нирующнх для экспресс-идентификации сальмонелл в РА па

Наставление по применению комплексной и групповых саль-монеллезных флуоресцирующих сывороток (для прямого метода иммунофлуоресценции). 195

Временная методика серологической диагностики сальмонеллеза овец в реакции непрямой (пассивной) гемагглютина-

Наставление по применению серогрупповых антигенов и сывороток В, С| и Di для диагностики сальмонеллеза в пробирочной реакции агглютинации (РА) . 207

Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных. 209

Наставление по применению агглютинирующих О-коли-

Диплококковые заболевания. . . 221

Методические указания по лабораторным исследованиям на пневмококковую (диплококковую) инфекцию животных 221

Стрентококкозы сельскохозяйственных животных. 224

Методические указания по лабораторной диагностике стреп-

тококкоза животных. 224

Методические указания по лабораторной диагностике стрептококковой септицемии птиц. 228

Методические указания по лабораторной диагностике стрептококкового полиартрита ягнят . 230

Методические указания по лабораторной диагностике мыта 233

Временное наставление по применению набора О-агглютини-рующих сывороток для диагностики псевдомоноза . 235

Гемофил езы. 237

Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилезного полисерозита свиней. 237

Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней. 240

Методические указания по лабораторной диагностике контагиозного метрита лошадей. 243

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной агалактии овец и коз. 248

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной плевропневмонии коз. 253

Наставление но диагностике респираторного микоплазмоза

Реакция агглютинации для диагностики респираторного микоплазмоза птиц с цельной кровью (ККРА) и сывороткой крови (СКРА). 264

Наставление по постановке РСК при перипневмоиии крупного рогатого скота. 265

Дизентерия свиней. 268

Методические указания по лабораторным исследованиям на

дизентерию свиней, вызываемую трепонемой. 268

Методические указания по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. 270

Методические указания по применению культур клеток в диагностических исследованиях. 279

Методические рекомендации по получению, культивированию и использованию в научных и производственных ветеринарных лабораториях первичных, перевиваемых и диплоидных культур

клеток животного происхождения. 279

Наставление по применению гидролизата мышечных белков ферментативного сухого (ФГМ-С) для питательных сред тканевых

Рекомендации по профилактике, диагностике контаминнрования культур клеток микроорганизмами и меры по их деконтаминации 299

Методические указания по получению и применению в вирусологической практике перевиваемых линий клеток из лимфоидных

органов крупного рогатого скота и почек теленка. 314

Методические рекомендации по очистке сыворотки крови крупного рогатого скота, используемой для культивирования клеточных

Временное наставление по получению, контролю и использованию сыворотки крови животных для культивирования клеток и

вирусологических исследований. 337

Предметный указатель. 347

ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ:

Составители: Борис Иванович Антонов,

Валерия Валентиновна Борисова, Галина Михайловна Волкова и др.

Заведующий редакцией В. Г. Федотов. Редактор В. Н. Сайта над и. Художник А. И. Бершачевская. Художественный редактор М. Д. Северина. Технический редактор Е. В. Соломович. Корректоры Н. fl. Туманова, Т. Н. Бобрикова, М. В. Писарева

Сдано в набор 13.06.85. Подписано к печати 06-12.85. Т-22156. Формат 84хЮ8‘/«- Бумага тип. №3. Гарнитура литературная. Печать высокая. Уел. псч. л. 18.18. Уел. кр.-отт. 18,48. Уч -изд. л. 27,27.. Изд. № 360 Тираж 2 9000. экз. Заказ Л 1 ? 419 . Цена 1 р. 4 0 к.

Отпечатано с матриц во Владимирской типографии СоюЗполиграфпрома при Государственном комитете СССР по долам издательств, полиграфии и книжной торговли, 600000, г. Владимир, Октябрьский проспект, д. 7.

Лабораторные исследования в ветеринарии. Бакте-Л12 риальные инфекции: Справочник/Сост. Б. И. Антонов, В. В. Борисова, П. М. Волкова и др.; Под ред. Б. И. Антонова.— М.: Агропромиздат, 1986.— 352 с.

В книге даны методы лабораторных исследований патологического материала с целью определения возбудителя нпфекционноЛ болезни. Они изложены по единой схеме: бактериологические и бактериоскопнческие исследования, биопроба, идентификация и дифференциация возбудителей. Методы унифицированы и стандартизированы

Для ветврачей и фельдшеров, лаборантов ветеринарных лабораторий.

3805020000-079 035 (01)-86

ПРЕДИСЛОВИЕ

В деле выполнения решении партии и правительства по дальнейшему развитию животноводства, а также задач, поставленных Продовольственной программой страны, ветеринарной службе большую помощь оказывают ветеринарные лаборатории.

Ветеринарные лаборатории осуществляют диагностику инфекционных и паразитарных болезней животных, выявляют нарушения обмена веществ в их организме, проводят исследования, направленные на предупреждение отравлений, помогая тем самым специалистам совхозов, колхозов и других хозяйств успешно осуществлять лечебнопрофилактические мероприятия. От того, насколько своевременно ставится диагноз, разработаны и рекомендованы профилактические и лечебные меры, зависит успех ликвидации болезней, сохранность поголовья животных и повышение их продуктивности.

Последнее время в лабораториях появилось много приборов и приспособлений, облегчающих труд специалистов и позволяющих проводить исследования на более современном и качественном уровне, с большой достоверностью. В связи с этим многие ранее действовавшие методические указания переработаны.

Кроме того, ежегодно для лабораторной практики предлагаются новые методы диагностики. В отечественной и зарубежной литературе постоянно публикуется большое количество материалов о новых методах исследований, предлагаются различные модификации существующих методик, вводятся дополнительные диагностические тесты.

Ветеринарные лаборатории в своей работе не могут использовать всего многообразия имеющихся в литературе методов исследования или из-за того, что они недостаточно апробированы, или из-за сложности применяемого оборудования. Иногда методы, предлагаемые различными авторами, при определении одних и тех же показателей дают несовпадающие результаты.

В связи с этим в справочник включены методы лабораторных исследований патологического материала, получаемого от больных, убитых или павших сельскохозяйственных животных, апробированные Центральной ветеринарной лабораторией и утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР. Книга содержит методические указания по диагностике инфекционных болезней бактериальной этиологии, а также методические указания по применению культур клеток в диагностических исследованиях.

Методики изложены по единой схеме,- взятие и пересылка патологического материала, методы его обработки и обогащения; бактериоско-пические исследования, включая световую и люминесцентную микроскопию; выделение культур возбудителей инфекционных болезней на питательных средах; заражение лабораторных животных как с целью выделения чистой культуры возбудителя, так и определения степени ее патогенности; гистологические исследования; идентификация и дифференциация возбудителей с использованием различных методов; серологические исследования для определения вида возбудителя.

Приведенные в справочнике методы лабораторных исследований унифицированы и стандартизированы. В широком смысле слова унификация и стандартизация подразумевают применение для различных исследований одних и тех же аппаратов, приборов, инструментов, посуды, реактивов, исключая, конечно, специальные методы исследования; применение стандартных (унифицированных) питательных сред и диагностикумов; разработку методических указаний по единой форме. Все это позволяет лабораторным работникам с меньшей затратой сил и средств, на высоком методическом и техническом уровне, качественно и в срок проводить диагностические исследования. Таким образом, стандартизация методов исследования явится способом наведения строгого порядка в работе ветеринарных лабораторий.

Книга предназначена для ветеринарных врачей, фельдшеров, а также лаборантов ветеринарных диагностических лабораторий.

В справочник не вошли материалы по диагностике туберкулеза, так как они пересматриваются и дополняются, поэтому их публикация будет осуществлена в последующих изданиях.

(Рекомендованы Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 25 мая 1978 г.)

1. Общие положения.

1.1. Диагностический набор лиофилизированных листериозных бактериофагов включает два монофага — L2A и L4A.

1.2 Лиофилйзированные листериозные бактериофаги имеют вид гомогенной таблетки беловатого или слегка желтоватого цвета. После растворения они имеют вид прозрачной желтой жидкости (цвет питательной среды).

1.3. Титр препаратов не должен быть ниже чем 1X10°.

1.4. Диагностический набор выпускается в коробке, содержащей по две ампулы каждого фага. На этикетке коробки указывается наименование учреждения, выпустившего препарат, название и состав набора, условия его хранения и срок годности. На ампулах должны быть обозначены название фага, его титр, дата изготовления и номер серии препарата.

1.5. Лиофилизнрованные бактериофаги могут быть использованы в течение 18 мес со дня выпуска.

1.6. Набор бактериофагов позволяет идентифицировать свыше 85% листериозных культур, так как могут быть выделены штаммы ли-стерий, которые не лизируются данными фагами.

2. Применение набора.

2.1. Перед применением содержимое ампул растворяют бульоном Мартена или МПБ в объеме, указанном на этикетке ампулы, и переносят в пробирки с соблюдением правил асептики. Растворенные бактериофаги непригодны к использованию при наличии осадка, хлопьев или помутнения.

2.2. Неиспользованные в день исследования растворенные бактериофаги могут* быть применены в дальнейшей работе на протяжении 5—10 сут при хранении в условиях холодильника (2—6°С) после пред-верительной проверки на отсутствие бактериального загрязнения.

Ампулы, пробирки и пипетки из-под бактериофага, а также выбракованный бактериофаг обезвреживают кипячением (не менее 30 мин).

3. Методика исследования.

3.1. Исследование проводят в бактериологических чашках, содержащих 2%-ный агар Мартена или МПА с глюкозой (0,5%), разлитый накануне или в день исследования. Перед нанесением испытуемой культуры поверхность агара необходимо подсушить. При подсушивании чашки открывают и переворачивают вверх дном. Агар, разлитый накануне, подсушивают 20—30 мин при комнатной температуре, а разлитый в день исследования — 1—1,5 ч при 37°С.

3.2. Для идентификации используют 16—18-часовую агаровую культуру. Старые музейные штаммы перед использованием лучше освежить.

Посев листерий для освежения культур, а также для получения 16—

18-часовой агаровой культуры можно проводить в чашках Петри или в пробирках на скошенном агаре. Выращенную при 22—28°С 16—18-часовую агаровую культуру засевают в бульон Мартена или МПБ с глюкозой (0,5%). Количество посевного материала должно быть таким, чтобы после встряхивания в пробирке с бульоном образовалась легкая опалесценция. Культуры подращивают в термостате (37°С) 4 ч. После этого бактериальную взвесь наносят газоном на поверхность подсушенного 2%-ного агара в бактериологических чашках.

Каждую культуру подвергают не менее чем 2—3 параллельным исследованиям.

В одной чашке можно одновременно проводить испытания двух культур. Для этого поверхность агара делят пополам и на каждую из половин наносят по 0,1 мл исследуемых культур, которые распределяют равномерно отдельным шпателем по отмеченному участку агаровой пластинки. Чашки с засеянными культурами выдерживают в термостате (37°С) 1—1,5 ч при слегка приоткрытой крышке.

3.3. Для исследования действия бактериофага на культуру листе-рий с целью ее идентификации на газон испытуемой культуры тонко оттянутой пастеровской пипеткой или бактериологической петлей наносят по одной капле бактериофагов и отдельно каплю стерильного бульона (контроль).

Предварительно место нанесения каждой капли отмечают карандашом по стеклу с наружной стороны чашки. Расстояние между наносимыми каплями должно быть не менее 1 см.

Через 15—20 мин после нанесения фага и бульона чашки помещают в термостат (28°С) или оставляют при комнатной температуре (22°С) в затемненном месте.

4. Учет результатов.

4.1. Учет результатов проводят через 16—24 ч. Культуру признают листериозной, если в месте нанесения хотя бы одного из бактериофагов образуется прозрачная зона лизиса или полусливной лизис (в виде губки). Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста вторичной культуры в зоне лизиса при интенсивном бактериальном росте на остальной поверхности агара.

4.2. Если лизис культуры выражен нечетко (едва заметно место нанесения капли бактериофага) или полностью отсутствует литическая реакция, культуры идентифицируют по общепринятому бактериологическому способу.