Что такое рпга с дифтерийным диагностикумом что это
ФСП 42-0010-4099-03 рег. № 002971/01
Диагностикум представляет собой 3 % взвесь формалинезированных, танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных очищенным концентрированным дифтерийным анатоксином.
Имеет вид гомогенной жидкости коричневого цвета. При стоянии разделяется на осадок, легко разбивающийся при встряхивании, и надосадочную жидкость.
Препарат предназначен для определения уровня дифтерийного антитоксина в сыворотке крови человека в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) микрометодом и макрометодом.
Определение содержания дифтерийного анатоксина в сыворотке крови человека осуществляют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) микрометодом и макрометодом.
1).В 12 лунок полистироловой пластины с V -образными лунками микротитратора системы Такачи или отечественного производства вносят по 0,025мл (1 кап) разведенного ФБР с твином.
2).В первую лунку вносят 0,025мл разведенной в 5 раз испытуемой прогретой, адсорбированной сыворотки, тщательно перемешивают, получают разведение 1:10. 3).Переносят по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно.
4).Из 10 лунки 0,25 раствора удаляют.
5).Флаконы с разведенным диагностикумом встряхивают до образования однородной взвеси и в каждую лунку вносят по 0,025 мл (одной капле) диагностикума.
Проведение реакции сопровождают следующими контролями:
1. испытуемой сыворотки на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана:
· В 11 лунку каждого ряда вносят 0,025 мл испытуемой сыворотки, разведенной 1:5,прогретой, адсорбированной.
· 0,025 мл переносят в 12 лунку и добавляют в обе лунки по 0,025 мл разведенной в 8 раз 3% взвеси эритроцитов барана контрольных.
2. контроль на активность диагностикума и отсутствие спонтанной агглютинации. РПГА проводят с сывороткой противодифтерийной контрольной, разведенной в 100раз.
· В 2 ряда по 12 лунок полистироловой пластины наливают по 0,025мл разведенного ФБР с твином.
· В первую лунку каждого ряда добавляют по 0,025 мл разведенной сыворотки, получают разведение 1:200,содержимое лунок тщательно перемешивают и, переносят по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведение до 10 лунки включительно.
· Из 10 лунки 0,025 раствора удаляют.
· Флакон с разведенным диагностикумом тщательно встряхивают до образования взвеси эритроцитов и вносят по 0,025мл (1кап) разведенного диагностикума в каждую лунку до конца ряда. 11 и 12 лунки являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации.
1). В 12 лунок полистироловой пластины наливают по 0,4 мл раствора разведенного ФБР с твином.
2).В первую лунку вносят 0,4мл разведенной в 5 раз испытуемой прогретой, адсорбированной сыворотки.
3).получают разведение 1:10,тщательно перемешивают и переносят по 0,4 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно.
4).Из 10 лунки 0,4 мл раствора выливают.
5)флакон с диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов.
6).Вносят по 0,05 мл 3% взвеси диагностикума в каждую лунку с разведенной сывороткой.
Реакцию сопровождают следующими контролями:
1. испытуемой сыворотки на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана:
· В 11 лунку каждого ряда вносят 0,4 мл разведенной в 5 раз, прогретой, адсорбированной, содержимое лунки перемешивают.
· Переносят по 0,4мл разведенного ФБР с твином.
· В первую лунку каждого ряда добавляют по 0,4 мл разведенной сыворотки, получают разведение 1:200.
· Содержимое лунок тщательно перемешивают и переносят по 0,4 мл раствора из предыдущей лунки в последующую.
· делают двукратные разведения до 10 лунки включительно.
· из 10 лунки 0,4 мл раствора выливают.
· Флакон с диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов.
· Вносят по 0,05мл диагностикума в каждую лунку до конца ряда. 11 и 12 лунки являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации.
Пластины остаются на ровной поверхности в течение 2,5 – 3,5 часов при температуре от 20-22 °С. Допускается учет реакции через 18-22 часов.
++++ - агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме повернутый купол; края купола иногда заворачиваются
+++ - в верхней части агглютината отмечается более широкое плотное кольцо из эритроцитов барана, но меньшее по диаметру.
++ - в верхней части агглютината отмечается более широкое плотное кольцо из эритроцитов барана с признаками агглютинации по краю осадка.
- - на дне лунки образуется плотный диск или плотное широкое кольцо с полностью гладким краем.
Выпускают диагностикум в виде комплектов:
Для микрометода. Рассчитан комплект на 160 анализов. В состав комплекта входят:
1) диагностикум эритроцитарный дифтерийный жидкий–2 флакона по 5,0 мл;
2) эритроциты барана формалинизированные 50% - 2 флакона по 5,0 мл;
3) эритроциты барана контрольные – 1 фл. - 5,0 мл;
4) фосфатно-солевой буферный раствор без твина – 4 фл. по 3,2 мл;
5) фосфатно-солевой буферный раствор с твином – 4 фл. по 6,4 мл;
6) сыворотка противодифтерийная контрольная – 1 фл. - 1 мл.
Для макрометода – на 80 анализов. В комплект входят:
1) диагностикум эритроцитарный дифтерийный жидкий – 5 фл. по 20 мл;
2) эритроциты барана формалинизированные 50 %– 1 фл - 20 мл;
3) эритроциты барана контрольные – 1 фл. - 20 мл;
4) фосфатно-солевой буферный раствор с твином – 4 фл. по 6,4 мл;
5) сыворотка противодифтерийная контрольная – 1 фл. - 1 мл;
Препараты хранят в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С.
Некоторые считают дифтерию проблемой из прошлого, болезнью-рудиментом, с которой повсеместно удалось успешно справиться. Но расслабляться еще рано. До сих пор регистрируются случаи этого заболевания, среди детей и взрослых циркулируют бактерии дифтерии. Поэтому о том, когда и какие анализы нужно сдавать на дифтерию, должен знать каждый.
Характеристика заболевания и особенности диагностики дифтерии
Дифтерия — это инфекционная болезнь, которой можно заразиться только от человека. Однако опасным может быть не только заболевший, но и носитель токсигенного (то есть производящего токсины) штамма. Такое носительство протекает без каких-либо признаков, и его можно обнаружить только с помощью лабораторного обследования.
Бактерии дифтерии — бациллы Леффлера — могут передаваться по воздуху с мельчайшими частичками влаги или пыли. Также бактерии могут передаваться при контакте с зараженными предметами обихода и изредка через зараженную еду.
При контакте с заболевшим или с носителем токсичного штамма вероятность заболеть примерно 15–20% [1] . Первые симптомы появляются через 2–10 дней. Повышается температура до 38–39°С, появляется боль в горле, становится сложно глотать. Признаки дифтерии сходны с ангиной, но при этом возникают и специфические симптомы.
Главная отличительная особенность — это тип поражения миндалин. На них образуется налет в виде плотных пленок. Свежие пленки снимаются достаточно легко, но они быстро утолщаются и становятся плотными. Если такую пленку с силой снять с миндалины, то под ней чаще всего образуется кровоточащая эрозия.
Такая типичная клиническая картина с высокой температурой, выраженной интоксикацией, ознобами, головной болью и бледностью кожи развивается у непривитых и имеющих слабый противодифтерийный иммунитет людей. При более высоком уровне иммунитета вместо пленок может образовываться рыхлый налет, а само заболевание протекает менее остро. Поэтому атипичные формы дифтерии легко можно спутать с обычной ангиной [2] .
Однако дифтерия страшна не только сама по себе, но и своими осложнениями.
Среди них выделяют:
- инфекционно-токсический шок;
- миокардит — поражение сердечной мышцы;
- полинейропатию — поражение периферических нервов;
- нефрозы — дистрофические процессы в почках;
- ДВС-синдром — нарушение свертываемости крови;
- круп — осложненное стенозом гортани воспаление дыхательных путей [3] .
Еще в середине XX века дифтерия была распространенной проблемой, вызывавшей осложнения, связанные с риском для жизни, у каждого пятого взрослого пациента и у каждого десятого заболевшего ребенка [4] .
В 1955 году в СССР было официально зарегистрировано около 321 000 случаев дифтерии [5] . В 2015 году, 60 лет спустя, на всей территории России было зарегистрировано только 2 заболевших [6] . То есть заболеваемость снизилась практически в 160 000 раз.
Так как в России регистрируются только единичные случаи дифтерии, далеко не все молодые врачи за свою практику сталкивались с этим заболеванием. Тем более что она может протекать в стертой или бессимптомной форме, маскируясь под ангину и менее опасные заболевания. Поэтому своевременная лабораторная диагностика играет значительную роль в выявлении этого заболевания.
Кроме обследования пациентов с подозрением на дифтерию проводится регулярный серомониторинг — определение уровня иммунитета среди группы населения. Например, среди детей 3–4 лет, 16–17 лет и взрослых. Это помогает оценить коллективный иммунитет, вероятность возникновения вспышек и распространения заболевания [7] .
Для диагностики дифтерии используются несколько методов — бактериологический, серологический и ПЦР-анализ, а также клинический анализ крови.
Основным методом, который позволяет установить диагноз, является микробиологическая диагностика дифтерии. Ее проводят при ангине с характерным выпотом на миндалинах, при подозрении на инфекционный мононуклеоз, паратонзиллярный абсцесс или ларинготрахеит. Это позволяет на самом раннем этапе исключить дифтерию.
С профилактической целью бактериологическое исследование проводят для поступающих на лечение или на работу в психоневрологические стационары, противотуберкулезные учреждения, дома ребенка. Такое обследование проводится, чтобы предотвратить вспышки инфекции в закрытом учреждении [9] .
Для проведения бактериологического исследования с пораженной поверхности забирают мазок и помещают его в транспортную питательную среду. Примерно через 5–7 дней из лаборатории приходит ответ, есть ли в биоматериале рост дифтерийной палочки и обнаружены ли у нее токсигенные свойства. В норме роста быть не должно. Если в результатах исследования указан нетоксигенный штамм, это тоже в большинстве случаев не страшно. Достаточно провести профилактику по назначенной врачом схеме. А вот если выявлен токсигенный штамм, придется пройти полный курс лечения и обследовать всех контактировавших с пациентом лиц.
Как дополнение к бактериологическому методу могут использовать ПЦР-диагностику . Показания к ее проведению те же, что и для бактериологического метода. Но для установления диагноза она уже не является обязательной. Материал для ПЦР-исследования забирают из очага поражения и помещают в специальную среду. В лаборатории выделяют гены дифтерийной бактерии, в том числе отвечающие за ее токсичность. Интерпретируют результат так же, как и при бактериологическом методе: в лучшем случае следы присутствия бактерии не должны обнаружить. Если же выявлен токсигенный штамм, придется срочно проходить лечение.
Еще один вспомогательный метод — клинический анализ крови. С его помощью нельзя отличить, например, дифтерию от ангины, но можно сказать, что воспаление вызвано бактериальной инфекцией. Для проведения этого анализа также берут кровь из вены. Этот анализ занимает всего 1–2 рабочих дня. При бактериальной инфекции повышается уровень СОЭ, количество лейкоцитов и нейтрофилов.
Анализы на дифтерию можно сдать как в государственных клиниках, так и в частных лабораториях. Анализ крови можно сдать в любой лаборатории и, чаще всего, для этого даже не нужно будет направление врача. А вот специфические анализы на дифтерию проводят уже не все, поэтому лучше заранее уточнить этот момент.
Забор материала лучше сдавать в клинике с собственной лабораторией, особенно это касается бактериологического и ПЦР-исследования. Результаты этих анализов во многом зависят от того, насколько точно соблюдали правила забора мазков, хранения и транспортировки материала. При нарушении на любом из этих этапов можно получить ложный отрицательный результат.
В государственном учреждении по направлению все эти исследования можно пройти бесплатно. В частной лаборатории придется заплатить как за само исследование, так и за взятие биоматериала. Но и уровень сервиса при этом обычно выше. Например, некоторые лаборатории высылают результаты исследований на электронный адрес или публикуют их в личном электронном кабинете пациента, так что возвращаться за бланками уже не нужно. Их можно распечатать самостоятельно в любой момент.
Перетрухина А. Т., Блинова Е. И.,
Возбудители дифтерии, типовой вид Corynebacterium diphtheriae, относятся к роду Corynebacterium и входят в группу 20 (Грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы) по определителю Берджи.
C. diphtheriae - палочки средней величины с булавовидными утолщениями на концах. Спор, капсул не образуют, неподвижны. Грамположительны. Факультативные анаэробы. Требовательны к питательным средам. По культуральным и биохимическим свойствам выделяют три биовара C. diphtheriae: gravis, mitis, intermedius.
Возбудители имеют видовой (О) и вариант-специфический (К) антигены. К факторам вирулентности относятся фимбрии, обеспечивающие адгезию; ферменты агрессии и защиты (гиалуронидаза, нейраминидаза, протеаза), отвечающие за инвазивность возбудителя.
Основной фактор вирулентности дифтерийных бактерий - образование экзотоксина, обладающего гистотоксическим, гемолитическим и дермонекротическим действием. В патогенезе дифтерии ведущую роль играет гистотоксический компонент экзотоксина, который блокирует синтез белка в клетках макроорганизма, что приводит к их гибели и некрозу пораженной ткани.
Дифтерия - антропонозная инфекция, передаваемая воздушно-капельным и контактно-бытовым путями. Клинически - это системное бактериально-токсическое заболевание. Возбудитель остается на месте входных ворот, а все проявления дифтерии связаны с действием токсина. Дифтерия характеризуется локальным фибринозным воспалением с образованием специфической плотной, спаянной с подлежащей тканью пленки, развитием отека и некроза ткани в месте внедрения возбудителя. Наблюдается общая интоксикация с поражением сердечно-сосудистой системы, почек и надпочечников, дыхательной мускулатуры, нервной системы. Чаще встречается дифтерия зева, гортани, носа, реже - половых органов, кожи, ран.
После перенесенного заболевания развивается достаточно напряженный антитоксический иммунитет. Антибактериальный компонент менее выражен. Уровень антитоксического иммунитета можно установить в РПГА.
Микробиологическая диагностика дифтерии основана на бактериологическом исследовании, материал для которого берется из очага поражения. Возможно обнаружение экзотоксина в крови больного с помощью методов иммуноиндикации.
Для лечения дифтерии обязательно применение противодифтерийной антитоксической сыворотки. Антибиотики назначаются по показаниям. Специфическая профилактика дифтерии проводится дифтерийным анатоксином. Он может использоваться в виде отдельного препарата, а также в комбинации со столбнячным анатоксином (АДС-анатоксин), или в форме АКДС-вакцины (ассоциированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина).
Дифтерийный анатоксин
Профилактика дифтерии осуществляется путем создания антитоксического иммунитета, что достигается путем введения дифтерийного анатоксина.
Ранее для этих целей использовался так называемый нативный анатоксин. В настоящее время дифтерийный анатоксин представляет собой очищенный концентрированный препарат, адсорбированный на гидрате окиси алюминия и содержащий в 1 мл 60 антигенных (флоккулирующих) единиц дифтерийного анатоксина и не более 2 мг гидрата окиси алюминия. Сырьем для получения этого препарата служит нативный анатоксин. Для его получения в производственных лабораториях используются следующие штаммы дифтерийной палочки: Парк-Вильямс, Дессау, Вейсензее, Массачусетс.
Готовый препарат разливается в ампулы по 1,0 мл. Он годен в течение трех лет со времени контроля биологических свойств.
Хранить его следует в сухом месте при 4-10 °С.
Очищенный концентрированный анатоксин должен быть гомогенным при встряхивании. Замораживание, даже однократное, делает препарат непригодным, так как в нем образуются неразбивающиеся хлопья.
Дифтерийный анатоксин применяется либо как таковой, либо в комплексе с коклюшной вакциной (КД) и столбнячным анатоксином (ДС), или с обоими этими препаратами (КДС). В настоящее время он используется в качестве компонента АКДС.
Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин
АДС-анатоксин - это адсорбированный препарат, включающий смесь очищенных концентрированных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидрате окиси алюминия. В 1 мл препарата содержится 60 антигенных (флоккулирующих) единиц дифтерийного анатоксина, 20 антигенных (антитоксинсвязывающих) единиц столбнячного анатоксина и не более 2 мг гидрата окиси алюминия.
АДС-анатоксин с уменьшенным содержанием антигенов отличается от обычного состава тем, что в 1 мл этого препарата содержится 10 флоккулирующих единиц дифтерийного анатоксина, 10 антитоксинсвязывающих единиц столбнячного анатоксина и не более 2 мг гидрата окиси алюминия.
Адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина
АКДС-вакцина представляет собой ассоциированный препарат, включающий смесь коклюшной вакцины и очищенных концентрированных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидрате окиси алюминия. В 1 мл препарата содержится 20 млрд. коклюшных микробов, убитых формалином или мертиолятом, 30 антигенных (флоккулирующих) единиц дифтерийного анатоксина, 10 антигенных (антитоксинсвязывающих) единиц столбнячного анатоксина и не более 2 мг гидрата окиси алюминия. Консервантом в препаратах служит мертиолят в концентрации 1:10000.
Готовый препарат имеет вид бесцветной прозрачной жидкости и белым или слегка желтоватым осадком. Перед употреблением препарат необходимо тщательно взбалтывать, чтобы обеспечить равномерное распределение во всем объеме активного начала, которое перед взбалтыванием находится в осадке вместе с адсорбентом. При взбалтывании препарата образуется гомогенная суспензия, медленно оседающая при стоянии.
Препараты выпускаются в ампулах, в которых содержится по 1 мл препарата. Ампулы фасуют в картонные коробки по 10 ампул в каждой.
Вакцина назначается детям в возрасте с 5-6 месяцев до 5 лет, если они не болели коклюшем. Вводится подкожно по 0,5 мл препарата троекратно, с интервалами 30-40 дней. Сокращать интервалы не рекомендуется, удлинение их допустимо до 2,5 месяцев. Если между прививками прошло больше этого срока, нужно их начинать сначала. Однократные ревакцинации проводятся через 9-12 месяцев после законченной вакцинации и через 2 года после первой ревакцинации, при этом вводится также по 0,5 мл вакцины. После введения вакцины у детей могут наблюдаться общие и местные реакции, прекращающиеся без медикаментозного лечения в течение 12-36 часов.
АКДС может выпускаться с паракоклюшным компонентом. Состав ее изменяется только в отношении содержания микробных тел; она содержит помимо указанного выше еще 10 млрд. убитых паракоклюшных микробов.
Срок годности - 1,5 года.
Противодифтерийная сыворотка
Противодифтерийная антитоксическая сыворотка является единственным и чрезвычайно эффективным средством специфической терапии дифтерии.
Противодифтерийную сыворотку получают из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным анатоксином. Сыворотку перед выпуском в практику подвергают очистке и концентрации методом ферментативного гидролиза. Действующим началом препарата является дифтерийный антитоксин, способный нейтрализовать действие дифтерийного токсина.
Препарат представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую жидкость бледно-золотистого или желтоватого цвета, содержащую не более 15 % белка. Активность сыворотки выражают в международных единицах. Препарат выпускают в ампулах, содержащих определенное количество международных единиц активности (10000 и 20000 МЕ), и фасуют в коробки по 5 ампул в каждую. В коробку вместе с противодифтерийной сывороткой вкладывают 5 ампул с лошадиной сывороткой, разведенной 1:100 и предназначенной для определения чувствительности больного к лошадиному белку.
Основным фактором, обеспечивающим эффективность лечения, является максимально раннее от начала заболевания ее применение. Сыворотку вводят подкожно или внутримышечно, в любом случае после определения чувствительности к лошадиному белку при помощи внутрикожной пробы.
Дозировки сыворотки зависят от тяжести заболевания.
Сыворотку необходимо хранить в темном, сухом помещении при температуре 3-10 °С. Сыворотка, подвергшаяся замораживанию и оттаиванию, но не изменившая физических свойств, годна к применению.
Срок годности 2 года. По истечении его сыворотка может быть направлена для переконтроля и продления срока годности в изготовивший ее институт.
Сыворотка может быть выпущена в сухом виде. Количество необходимого растворителя указано на этикетке. Срок годности ее неограничен.
Очищенный дифтерийный токсин для реакции Шика
Дифтерийный токсин Шика применяется для выявления восприимчивости детей к дифтерии. Для постановки реакции Шика применяют разведенный дифтерийный токсин, содержащий в 0,2 мл 1/40 часть одной смертельной для морских свинок дозы (одна Шик-доза). Токсин вводят внутрикожно в количестве 0,2 мл в среднюю часть ладонной поверхности предплечья.
У неиммунных детей на месте введения токсина появляется положительная кожная реакция в виде инфильтрата и гиперемии. Сырьем для изготовления токсина для реакции Шика служит очищенный дифтерийный токсин, который готовят из нативного токсина, выдержанного не менее двух лет, с точно установленной на морских свинках минимальной смертельной дозой.
Стерильный препарат сохраняют под толуолом при 6-7 °С и перед каждым его использованием для изготовления токсина Шика производят тщательное определение его минимальной летальной дозы.
Для приготовления стабилизированного разведенного токсина Шика применяют глицерино-желатиновый раствор, которым разводят исходный токсин с таким расчетом, чтобы в 0,2 мл содержалась 1/40 DLM.
Готовый препарат должен быть прозрачным, не содержать посторонних примесей, стерильным и специфически активным.
Дифтерийный токсин для реакции Шика разливают в ампулы по 1 мл и хранят при температуре 4-8 °С. Срок годности токсина Шика 12 месяцев со дня его разведения.
Дифтерийный эритроцитарный диагностикум
Для обнаружения дифтерийного антитоксина, а также анатоксина и токсина в сыворотке больных, реконвалесцентов и вакцинированных против дифтерии, может быть применен дифтерийный эритроцитарный диагностикум.
Препарат представляет собой взвесь в физиологическом растворе эритроцитов барана, сенсибилизированных очищенным, концентрированным дифтерийным анатоксином. Он применяется в реакции непрямой гемагглютинации и в реакции нейтрализации непрямой гемагглютинации.
Готовый препарат содержит 2,5 % сенсибилизированных эритроцитов, что соответствует 6-8 млн. в 0,05 мл взвеси. Специфическая активность диагностикума проверяется в РНГА со специфической противодифтерийной сывороткой.
Срок годности препарата - 6 месяцев.
Агглютинирующие неадсорбированные политиповые и типовые дифтерийные сыворотки
Для серологической дифференциации дифтерийных палочек от других представителей рода коринебактерий (дифтероидов и ложнодифтерийных), а также для серологического типирования выделенных от больных и носителей дифтерийных бактерий можно применять агглютинирующую неадсорбированную политиповую или типовые дифтерийные сыворотки.
Они представляют собой сыворотки кроликов, иммунизированных формалинизированными (0,5 % формалина) или живыми взвесями дифтерийных бактерий.
Политиповая сыворотка агглютинирует бактерий тех серотипов, в отношении которых она приготовлена, в разведении не ниже 1:800 и на стекле дает четкую агглютинацию дифтерийных бактерий в разведении 1:25 и отрицательную реакцию с дифтероидами и ложнодифтерийными.
Монотиповые сыворотки выпускаются с титром не ниже чем 1:1600, наличие групповых антител допускается не выше чем до 1/4 титра.
Срок годности жидких сывороток - 1 год, сухих - 3 года.
На правах рукописи
ПОКАЗАТЕЛИ ПРОТИВОДИФТЕРИЙНОГО АНТИТОКСИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТАКТИКИ КОНТРОЛЯ ДИФТЕРИИ.
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,
профессор Галина Яковлевна Ценева
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук профессор
Юрий Алексеевич Митин
ОБЩАЯ ХАРАКТРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время дифтерийная инфекция продолжает оставаться серьезной проблемой для здравоохранения. Несмотря на стабилизацию показателей заболеваемости дифтерией в РФ отмечаются случаи заболевания и бактерионосительства среди детского населения в отдельных регионах.
Личный вклад автора. Собраны, изучены и проанализированы аналитические данные о профилактических прививках обследованных детей, и клинический статус.
Основные результаты получены лично автором, отдельные фрагменты выполнены совместно на базе лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИЭМ имени Пастера. Выделение штаммов C. diphtheriae, сбор сывороток от больных и здоровых лиц проведен в микробиологических лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии г. Вологды и Вологодской области, а также лично автором.
Структура и объем диссертации. Основной текст диссертации изложен на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения.
Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 102 источника отечественных авторов и 250 источников зарубежных авторов.
Материалы и методы исследований
В соответствии с целью и задачами исследования использован следующий материал и применены методы, представленные в таблице 1.
Объем проведенных исследований различными методами
1.1. Изучение характеристик циркулирующих штаммов C.diphtheriae.
1.2. Сравнение методов определения токсигенности штаммов C.diphtheriae.
2.1. Сравнительная оценка методов РПГА, ИФА и его вариантов для определения защищенности от дифтерии.
2.2. Оценка уровней АТ-АТ по международным стандартам.
2.4. Оценка эффективности теста определения авидности антитоксических антител.
2.5. Изучение динамики показателей защищенности от дифтерии
3. Молекулярно-генетический: ПЦР и риботипирование
Методы культивирования штаммов.
Исследованы штаммы C.diphtheriae, выделенные автором и полученные из практических лабораторий г. Вологды и Вологодской областей за период гг. Всего изучено 170 штаммов[1].
В работе использованы референс-штаммы C. diphtheriae № 000 (tox-), № 000 (tox+) и № 000 (tox+/-) из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK).
Для определения токсигенности C. diphtheriae использованы 4 теста: полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммунохроматографический тест (ICS), иммунопреципитация в агаре (Elek-тест), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).
Для постановки ICS-теста использовали диагностический набор, полученный из Diphtheriae Reference Laboratory (CPHL), London, UK.
Для постановки РНГА использовали диагностический набор с эритроцитарным диагностикумом (производства НИИЭМ им. Пастера, С-Петербург).
Определение чувствительности C.diphtheriae к антибиотикам проводили методом серийных разведений и диско-диффузионным методом согласно МУК 4.12.1890-04 (Москва, 2004), “Basic laboratory procedures in clinical bacteriology” (WHO, Geneva, 1991, раздел “Определение чувствительности к антимикробным препаратам”) и руководства ВОЗ "Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии" (1994). В качестве среды для постановки теста использовали бульон и агар Мюллера-Хинтона с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Для контроля качества сред использовали стандартные штаммы: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). В качестве контрольных штаммов для оценки чувствительности использовали Corynebacterium diphtheriae var. gravis (tox+) (NCTC 10648) и Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
РН (реакция нейтрализации) в культуре клеток Vero
В РН использовали токсин 0,0002 Lf/мл и антитоксин 0,032 МЕ/мл, полученные из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK). При постановке реакций применяли культуру клеток Vero, полученную из лаборатории детских вирусных инфекций НИИЭМ им. Пастера, в концентрации 2,5·105 клеток/мл. Содержание антитоксических антител определяли от 0,000125 МЕ/мл и выше.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Тест-система для ИФА предназначенна для определения суммарных антитоксических антител на основе конъюгата - иммуноглобулинов (F(ab')2-фрагментов) диагностических против IgG человека, аффинноочищенных, меченных пероксидазой (производства НПО «Биомед, г. Пермь). С помощью специальной компьютерной программы, прилагаемой к набору, производили перерасчет показателей оптической плотности в показатели антитоксических международных единиц.
Для определения авидности антител использовали модифицированную тест-систему путем введения дополнительных 2-х контролей: положительный образец (К+) – сыворотка крови человека с индексом авидности 95% и отрицательный образец (К-) - сыворотка крови человека с индексом авидности 5%, а также других ингредиентов и разработанных условий проведения реакции.
Анализ заболеваемости населения г. Вологды и Вологодской области проводили за период с 2000 по 2011 гг. по статистическим данным и историям болезни. Сопоставление данных о заболеваемости, привитости детей от дифтерии, а также о циркуляции выделенных штаммов C. diphtheriae предоставлены филиалами Центров гигиены и эпидемиологии на изучаемых территориях.
Методы статистической обработки данных.
Для анализа и оценки явлений использованы относительные и средние величины. В работе приведены интенсивные, экстенсивные показатели и показатели наглядности. Экстенсивные показатели выражали в процентах.
Представленные результаты исследований имели критерий достоверноcти t > 3 и уровень статистический значимости p МЕ/мл, которые по международным критериям защищенности рассматриваются как обеспечивающие стойкую длительную невосприимчивость к дифтерии. Наименьшее число лиц имеющих защитный титр выявлено в группе 9-13 лет, что составило 33 (+0,1) %.
Рис.3. Результаты определения суммарных противодифтерийных АТ-АТ у детей в разных возрастных группах (по данным ИФА)
Учитывая, что количество суммарных противодифтерийных антител не позволяет объективно оценить степень защиты от дифтерии, нами в параллельных исследованиях определены уровни высокоавидных антител и оценена их протективная значимость.
Рис.4. Результаты определения высоавидных противодифтерийных АТ-АТ у детей в разных возрастных группах (n=249).
Примечание: ИА> 30% обеспечивает высокий уровень защиты от дифтерии (с вероятностью 95%); ИА, равный 11-30%, обеспечивает некоторую степень защиты от дифтерии; ИА МЕ/мл - стойкая длительная невосприимчивость к дифтерии.
Читайте также:
