Транспортная среда для кишечной инфекции

Тампон из вискозы на пластиковом стержне,
стерильный, индивидуальная упаковка

Тампон из вискозы на алюминиевом стержне,
стерильный, индивидуальная упаковка

Пробки с тупферами

Тампон из вискозы на пластиковом
стержне в ПП пробирке с этикеткой, стерильный

Тампон из вискозы на пластиковом стержне
в ПП пробирке с этикеткой, стерильный, индивидуальная упаковка

Тампон из вискозы на алюминиевом
стержне в ПП пробирке с этикеткой, стерильный

Тампон из вискозы на алюминиевом стержне
в ПП пробирке с этикеткой, стерильный, индивидуальная упаковка

Среда Стюарта в ПП пробирке. Тампон из вискозы
на пластиковом стержне. Стерильно, индивидуальная упаковка

Среда Стюарта с активированным углем в ПП пробирке.
Тампон из вискозы на пластиковом стержне.
Стерильно, индивидуальная упаковка

Среда Стюарта в ПП пробирке.
Тампон из вискозы на алюминиевом стержне.
Стерильно, индивидуальная упаковка

Среда Стюарта с активированным углем в ПП пробирке.
Тампон из вискозы на алюминиевом стержне.
Стерильно, индивидуальная упаковка

Среда Эймса в ПП пробирке. Тампон из вискозы
на пластиковом стержне. Стерильно, индивидуальная упаковка

Среда Эймса с активированным углем в ПП пробирке.
Тампон из вискозы на пластиковом стержне.
Стерильно, индивидуальная упаковка

Среда Эймса в ПП пробирке.
Тампон из вискозы на алюминиевом стержне.
Стерильно, индивидуальная упаковка

Среда Эймса с активированным углем в ПП пробирке.
Тампон из вискозы на алюминиевом стержне.
Стерильно, индивидуальная упаковка

Среда Кэри-Блэйра в ПП пробирке.
Тампон из вискозы на пластиковом стержне.
Стерильно, индивидуальная упаковка

Транспортные среды для безопасного и гарантированного отбора микробиологических образцов и надежной транспортировки их в лаборатори.

Стерильных пробирок с транспортной средой;
Тампонов на пластмассовых или алюминиевых стержнях.

Гарантируют жизнеспособность микроорганизмов в течение 48–72 часов – пока они не будут доставлены в лабораторию.

Транспортная среда Кэри-Блэйра

Способствует росту энтеропатогенных бактерий, в частности, Salmonella spp. и Vibrio parahaemoliticus и подавляет избыточный рост Escherichia coli, Citrobacter freundi и Klebsiella aerogenes.

Транспортная среда Эймса с активированным углем и без него

Эта полужидкая среда поддерживает жизнеспособность, но не рост. Забуференный физиологический раствор в среде (вместо глицерофосфата, содержащегося, в среде Стюарта) препятствует избыточному росту посторонней микрофлоры и способствует лучшему выделению патогенных микроорганизмов.

Данная среда обеспечивает жизнеспособность:

Стрептококков, кишечных патогенов и стафилококков - Не менее 48-72 часов.
Neisseria gonorrhoeae - не менее 48 часов.
Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Gardenerella vaginalis - не менее 12-24 часов.

Активированный уголь способствует лучшему сохранению Neisseria gonorrhoeae и кишечных патогенов (Salmonella и Shigella).

Транспортная среда Стюарта

Основной функцией содержащейся в пробирке транспортной среды является поддержание жизнедеятельности микроорганизмов на время, достаточное для транспортировки проб от места их взятия до лаборатории, в которой будет выполняться культивирование.

Состав среды делает возможным сохранение как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов (хотя при этом время жизни для последних неизбежно оказывается короче, чем для других бактерий).

Данная полужидкая среда не является питательной и служит лишь для сохранения бактерий без их избыточного роста.

Присутствие активированного угля способствует лучшему сохранению Neisseria gonorrhoeae и кишечных патогенов (Salmonella и Shigella).

Данная среда обеспечивает жизнеспособность:

Стрептококков, кишечных патогенов и стафилококков - Не менее 48-72 часов.
Neisseria gonorrhoeae - не менее 48 часов.
Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Gardenerella vaginalis - не менее 12-24 часов.

При 4–20°C до окончания срока годности, указанного на каждой индивидуальной упаковке.

В нашем организме живут миллионы бактерий — их общий вес составляет около двух килограммов. Кишечная палочка занимает среди них далеко не последнее место. Эта бактерия может долгое время помогать человеку в формировании микрофлоры и пищеварении, а может в один момент превратиться в серьезную медицинскую проблему. В нашей статье мы расскажем о способах выявления кишечной палочки.

Кишечная палочка, или Escherichia coli (Эшерихия коли) — это палочковидная бактерия, которая обитает в кишечнике человека и некоторых животных. Существует более сотни разновидностей этой палочки. Большинство из них совершенно безвредны, но некоторые могут вызвать серьезные заболевания.

У здорового человека Escherichia coli живет в толстом кишечнике. Ее количество обычно составляет 104–1010 КОЕ в 1 мл содержимого. В кишечнике эта бактерия участвует в переваривании пищи, синтезирует нужные нам витамины, а также производит органические кислоты. Эти кислоты создают благоприятную среду для развития лакто- и бифидобактерий.

Чаще всего кишечная палочка попадает в другие органы при нарушении гигиены или при снижении иммунитета. Попадая в женскую половую систему, она вызывает кольпит, аднексит, другие воспалительные заболевания. Особенно опасно заражение при беременности и после родов. Это может вызвать внутриутробную инфекцию у ребенка и стать причиной послеродового эндометрита у матери. Мужчин эта опасность тоже не обходит стороной. Кишечная палочка, попавшая в уретру, может вызвать уретрит, простатит, воспаление придатков и яичек.

Кроме этого, нормальная кишечная палочка может мутировать и становиться действительно опасной. Некоторые виды этой бактерии, например O157:H7, O104:H4, O121 и O104:H21, выделяют сильные токсины. Они могут вызвать гемолитико-уремический синдром, перитонит, пневмонию, пищевые отравления.

Чаще всего мутировавшая кишечная палочка попадает в организм вместе с продуктами питания, такими как немытые овощи, плохо обработанное мясо, молоко. Но в некоторых случаях такие штаммы могут образоваться внутри организма в результате мутаций и обмена генами.

Патогенная кишечная палочка нередко вызывает диарею. Обычно эшерихиозом страдают дети младшего возраста и люди, путешествующие в страны с низким уровнем гигиены (так называемая диарея путешественников). Вовремя проведенный анализ позволит выявить кишечную палочку и начать лечение.

Некоторые опасные штаммы кишечной палочки могут вызвать гемолитико-уремический синдром (ГУС). Это тяжелое состояние, при котором в мелких сосудах образуется большое количество тромбов, собственные эритроциты разрушаются и возникает полиорганная недостаточность — тяжелая стресс-реакция организма. При любом подозрении на ГУС обязательно проводят анализ на энтеропатогенные (опасные) эшерихии.

Обычный бактериологический анализ, который проводят при воспалительных заболеваниях органов половой системы, послеродовых эндометритах и других, — также может показать наличие кишечной палочки.

Еще одним показанием к проведению исследования является дисбактериоз. Изменение состава микрофлоры кишечника может привести к проблемам с пищеварением, к урчанию и болям в животе. Нарушение образования витаминов и повышенное всасывание токсинов приводит к слабости, утомляемости и другим неспецифическим симптомам.

Кишечную палочку можно обнаружить в кале, в моче, в мазках с поверхности половых органов или из ран, при посеве промывных вод. Также во время исследований она может быть обнаружена в ране, в легких.

Основным методом анализа для обнаружения кишечной палочки является бактериологический посев. Для этого небольшое количество материала помещают в питательную среду, на которой бактерии очень хорошо размножаются. Результат подсчитывают через несколько дней по количеству образовавшихся колоний. Единица измерения — КОЕ/мл, то есть количество бактерий, из которых при исследовании выросли колонии, в миллилитре материала.

Также существует метод ПЦР-диагностики. Он позволяет сказать, присутствует ли в материале патогенная кишечная палочка. Но ни количество бактерий, ни их чувствительность к лекарственным препаратам этот метод не покажет.

Другие методы, которые не подразумевают выделение чистой культуры кишечной палочки, могут сказать о заражении только косвенно. Например, в общем анализе мочи могут обнаружить бактерии в виде палочек. Но для того чтобы определить их вид придется сдавать дополнительно бактериологический посев. Похожая ситуация и с копрограммой. Анализ может дать представление о состоянии желудка и кишечника, но не позволяет выявить конкретные бактерии.

Общий анализ крови позволяет выявить характерные для воспалительных заболеваний сдвиги. Но они могут быть вызваны не только эшерихиозом, но и дизентерией, пневмонией или любым другим воспалительным заболеванием.

Любое бактериологическое исследование нужно проводить до начала лечения антибиотиками. В противном случае можно получить ложноотрицательный результат.

Анализ кала на кишечную палочку собирается в стерильную пробирку с транспортной средой. Для этого нужно заранее подготовить судно или другую емкость, тщательно вымыть ее и ополоснуть кипятком. В эту емкость собирается кал после естественной дефекации. Из специальной пробирки с транспортной средой нужно достать аппликатор, погрузить его в несколько участков собранного биоматериала и снова убрать в пробирку, плотно закрыв крышку. Если в собранном материале присутствуют кишечные палочки, бактериологический анализ это покажет.

Анализ мочи на бактериологическое исследование тоже собирают в специальную стерильную емкость. Собрать материал можно в любое время суток. Перед этим обязательно нужно принять душ, чтобы в емкость не попали бактерии с поверхности кожи. Чем скорее получится доставить материал в лабораторию, тем лучше.

Мазки и соскобы урогенитального тракта при подозрении на уретрит, вагинит и любые другие мочеполовые заболевания, вызванные кишечной палочкой, забирают сразу в лаборатории или на приеме врача. Специальной щеточкой делается соскоб из уретры, со стенок влагалища или с шейки матки. Это не очень приятная процедура, но без нее не обойтись.

Быстрый анализ, который позволяет выявить в материале ДНК кишечной палочки, проводится за 1–2 рабочих дня. Результат бактериологического анализа на кишечную палочку придется ждать дольше — от 5 до 7 дней. За это время выращивается культура клеток, определяется их вид, проводится анализ на чувствительность к антибиотикам и бактериофагам.

В норме кишечной палочки не должно быть нигде, кроме толстого кишечника. То есть если вы сдаете мочу или мазок, то лучший результат — это отрицательное заключение. Если речь идет о содержимом кишечника, то здесь не должно обнаруживаться энтеропатогенных кишечных палочек, таких как O157:H7. В некоторых лабораториях проводят быстрый ПЦР-тест на целую группу таких бактерий.

При определении чувствительности к антибиотикам или бактериофагам выдается бланк, на котором напротив каждого наименования написана степень влияния препарата на рост бактерии. По такому бланку врач за несколько минут подберет наиболее эффективный для конкретного случая антибиотик.

Анализ на эшерихиоз можно сдать как в обычной поликлинике, так и в частной лаборатории. Желательно заранее уточнить, какой метод исследования при этом используется.

Бактериологические исследования лучше проводить в клиниках и лабораториях, оснащенных автоматическими и полуавтоматическими анализаторами. Это исключает человеческий фактор, позволяет проводить исследование с широким перечнем антибиотиков и бактериофагов. Такие оснащенные лаборатории имеют как современные государственные больницы, занимающиеся лечением инфекционных болезней, так и частные медицинские центры.

Также стоит обратить внимание на время проведения исследования. Для бактериологического исследования это не менее пяти дней. Раньше бактерия просто не успеет вырасти в достаточном для анализа количестве. Время больше 7–10 дней говорит о том, что исследование будет проводиться в сторонней лаборатории. Это существенный недостаток, поскольку речь идет о транспортировке биоматериала, что нежелательно: чем раньше был доставлен материал, тем более достоверным будет результат.

Кишечная палочка — неотъемлемая часть микрофлоры кишечника. Пока она находится под контролем организма, ее клетки помогают синтезировать витамины, переваривать пищу, создавать благоприятную среду для жизни других полезных микробов. Но любое нарушение этого равновесия грозит патологиями вплоть до серьезных воспалительных заболеваний. К счастью, медицина помогает нам вовремя выявить отклонения от нормы и приять соответствующие меры.

1.1. В методических рекомендациях представлена доступная для практических бактериологических лабораторий методика бактериологического исследования на кампилобактериоз больных острыми кишечными инфекциями с учетом современных возможностей лабораторной техники по созданию условий для культивирования и идентификации кампилобактерий.

1.2. Методические рекомендации предназначены для врачей бактериологов, инфекционистов, эпидемиологов и врачей других специальностей.

В настоящее время по данным ВОЗ, во многих зарубежных странах кампилобактериоз является наиболее распространенной этиологической формой в структуре ОКИ и в зависимости от региона на его долю приходится от 3 до 73 % всех расшифрованных острых кишечных инфекций [1, 11].

Изучение кампилобактериоза в Российской Федерации начато с большим опозданием, что сопряжено с рядом причин, в основном со сложностью и высокой стоимостью лабораторной диагностики, обусловленными особенностями культивирования кампилобактеров. Так в 2005 - 2007 гг. по всей России официально зарегистрировано всего 394 - 398 случаев этой инфекции (показатель на 100 тыс. населения - 0,27 - 0,28 соответственно). Показатель заболеваемости на 100 тыс. населения по сальмонеллезу за тот же период составил 29,33, 31,96 и 35,5, соответственно. При этом кампилобактериоз выявлен только в 14-ти из 85-ти административных территорий России. Таким образом, кампилобактериозная инфекция, столь широко распространенная во всем мире, и по частоте выявления сопоставимая с сальмонеллезом, в России диагностируется очень мало [11].

Для лабораторной диагностики кампилобактериозного энтероколита кроме основного бактериологического метода с выделением чистой культуры возбудителя могут быть использованы и другие методы.

Серодиагностика при кампилобактериозе имеет вспомогательное значение и может быть проведена для ретроспективной диагностики при отсутствии выделения возбудителя, при эпидемиологических исследованиях и изучении патогенеза. Исследование парных сывороток при кампилобактериозной инфекции не имеет такого большого диагностического значения как при многих других кишечных заболеваниях, поскольку отчетливое увеличение титров антител наблюдается только у одной трети больных [14].

Для ускоренной индикации кампилобактеров в разное время предлагали использовать иммунологические реакции, такие как реакция коагглютинации, иммуноферментный анализ [3, 12]. Однако они не могут широко использоваться в практических лабораториях из-за ограниченного производства тест-систем.

Одним из наиболее распространенных альтернативных методов индикации кампилобактерий являются методики, основанные на амплификационных технологиях и в частности - методе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В связи с высокой частотой циркуляции в популяции здоровых лиц сапрофитных видов кампилобактерий для диагностики кишечных форм кампилобактериоза применяются тест-системы, позволяющие выявлять только термофильную группу этих микроорганизмов и разрешенные к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке. Предпочтение при этом должно отдаваться тест-системам, обеспечивающим более высокий уровень контаминационной защищенности при проведении исследований.

Апробация разработанной методики в условиях микробиологической лаборатории инфекционной больницы г. Липецка при обследовании 11607 больных ОКИ подтвердила эффективность ее использования для диагностики кампилобактериозной инфекции. Так, высеваемость кампилобактеров за 2002 - 2005 гг. в г. Липецке в среднем составила 1,8 ± 0,12 %, что более чем в 2 раза выше уровня высеваемости шигелл за анализируемый период (0,8 %), но ниже высеваемости сальмонелл (3,2 %)

3.1 Формула метода

Способ бактериологической диагностики кампилобактериоза, включающий выделение чистой культуры возбудителя, с использованием специальных питательных сред и капнофильных условий культивирования, и последующей ее идентификацией.

3.2. Показания и противопоказания к применению метода:

Показанием к проведению бактериологического исследования биологического материала на кампилобактериоз является необходимость обследования

- больных острыми кишечными инфекциями (ОКИ) - с диагностической целью;

- лиц, контактных с больными ОКИ - по эпидемическим показаниям;

- реконвалесцентов кампилобактериоза - для контроля лечения и выявления бактерионосительства.

Противопоказания к использованию метода отсутствуют.

3.3. Материально-техническое обеспечение метода

3.3.1. Стандартное испытательное и вспомогательное оборудование, средства измерения для микробиологических лабораторий.

3.3.2. Питательные среды, химические реагенты, оборудование для культивирования, выделения, идентификации кампилобактерий, в том числе:

- Трековые мембраны с диаметром пор 0,46 и 0,55 мкм (типа изготовляемых лабораторией ядерных реакций им. Г.Н. Флерова ОИЯИ, г. Дубна и др.).

- Термостат с регулируемой газовой средой или микроанаэростат или системы для инкубации микроаэрофильных и анаэробных микроорганизмов (типа CampyPack Plus jar, Campy Pack (Becton Dickinson), Genbag, Genbox anaer (bio Merieux, Hi Media и др.).

3.3.3. Для лабораторной диагностики кампилобактериоза должны использоваться питательные среды и реагенты, разрешенные к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

Возбудители кампилобактериоза первоначально были отнесены к роду Vibrio семейства Vibrionaceae, а выделенный для них вид был назван V. fetus []. В 1963 году по предложению Sebald M. и Veron M., доказавших различия между микроаэрофильной группой V. fetus и истинными вибрионами при изучении состава оснований ДНК, род Campylobacter, как новый таксон, был введен в семейство Spirillaceae. В настоящее время микроаэрофильные подвижные, хемоорганотрофные, не образующие спор и капсул грамотрицательные бактерии спиралевидной, S-образной или изогнутой формы объединены в семейство Campylobacteriaceae, а род Campylobacter насчитывает, по последним данным, около 20 видов и подвидов, и это число постоянно растет, уточняются потенциальные возможности данных микроорганизмов в этиологии и патогенезе заболевания у человека. Наибольшее значение для патологии человека на сегодня имеют C. jejuni, C. coli, C. lari, C. fetus. Последний вид чаще поражает ослабленных интеркуррентными заболеваниями людей с развитием гематогенно-диссеминированных форм заболевания [9].

Длина клеток кампилобактеров 0,5 - 5 мкм, толщина - 0,2 - 0,8 мкм, имеют один или два полярно расположенных жгутика, могут обладать плазмидами. В старых культурах бактерии часто принимают сферические или кокковые формы.

Кампилобактерам присущ дыхательный тип метаболизма. В качестве источника энергии они, в основном, используют аминокислоты, но не могут утилизировать углеводы. Кампилобактеры - микроаэрофилы. Кислород необходим для их роста, но становится токсичным для микроорганизмов в избыточном количестве. Для большинства штаммов оптимальной является концентрация кислорода 3 - 6 %. Кампилобактерии являются капнофилами, то есть нуждаются в высоких концентрациях CO₂ (до 10 %). Большинство этиологически значимых кампилобактеров обладают каталазой, оксидазой и супероксиддисмутазой.

В зависимости от температурного диапазона роста кампилобактеры делят на 2 группы: 1) нетермофильные (O. faecalis, Chyointestinalis, C. fetus, O. consicus) - температурный оптимум +37 °С; 2) термофильные (C. jejuni, C. coli, C. lari) - температурный оптимум +42 - 43 °С.

На жидких питательных средах через 48 часов инкубации кампилобактер образует равномерное помутнение с выраженным осадком, на полужидких пробирочных питательных средах - зону роста в виде диска, расположенного на глубине 1 - 2 мм от поверхности питательной среды.

C. jejuni на плотных питательных средах с добавлением крови образуют колонии без гемолиза 2-х типов:

На полужидких средах C. jejuni растут в виде диска, 3 - 5 мм от поверхности среды. C. coli на плотных питательных средах с добавлением крови образуют колонии диаметром 1 - 2 мм без гемолиза, гладкие, выпуклые, блестящие с рыжевато-коричневым оттенком.

4.1. Принцип бактериологического метода основан на выявлении живых микроорганизмов в исследуемом субстрате при посеве на специальные питательные среды с последующей инкубацией в термостате при заданной температуре в микроаэрофильных условиях. Изучение культуральных и ферментативных свойств полученных микроорганизмов позволяет идентифицировать бактерии рода Campylobacter.

4.2. При кампилобактериозе бактериологическое исследование обеспечивает постановку этиологического диагноза и контроль освобождения организма от возбудителя. При дифференциальной диагностике кампилобактериоза от других острых кишечных инфекций бактериологическое исследование с выделением возбудителя является единственным методом, так как клиническое течение инфекционного процесса не всегда позволяет различить эти нозологические формы.

4.3 Схема бактериологической диагностики кампилобактерий

Проводить бактериологическое исследование с диагностической целью необходимо в наиболее ранние сроки от начала заболевания, до начала антибиотикотерапии.

4.4 Сбор материала для исследования

Материалом для исследования являются испражнения. Техника взятия исследуемого материала не отличается от техники, применяемой при других ОКИ.

Отбор нативного материала

Испражнения не менее 1 грамма собирают сразу после естественного акта дефекации из судна, горшка (тщательно вымытого и не содержащего следов дезинфектантов) или с пеленки с помощью стерильной стеклянной палочки, проволочной петли или деревянного шпателя и помещают в стерильную посуду (стеклянную пробирку, вакуумный пробоотборник, контейнер транспортировочный со средой для анаэробов или специальными средами с активированным углем и без него для выделения Campylobacter spp.). При наличии в испражнениях патологических примесей (слизь, хлопья, эпителий, гной), за исключением крови, их включают в отбираемую пробу.

Отбор с использованием ректальных петель (тампонов).

Стерильную ректальную петлю (тампон) вводят в прямую кишку на глубину 56 см. Взятый материал переносят в стерильную пробирку с физиологическим раствором или в транспортную среду. Попадание транспортных сред на слизистую оболочку прямой кишки недопустимо!

Условия и сроки хранения и транспортировки проб.

При возможности доставки нативных фекалий в лабораторию в течение 1 часа, транспортные среды можно не использовать.

При необходимости продолжительной транспортировки используют транспортные среды: 0,1 % пептонная вода, среда контроля стерильности, среда Amies, среда Саrу-Blair (см. Приложение 1). Соотношение материал/среда должно быть 1:3 - 1:5. Применение транспортных сред обязательно при отборе проб ректальными петлями [3].

Сроки хранения материала в транспортных средах при температуре 4 °С в зависимости от вида среды:

- в изотоническом растворе натрия хлорида в течение 24 часов,

- в 0,1 % пептонной воде - 72 часа,

- в среде для контроля стерильности, среде Amies, среде Cary-Blair - 5 - 7 суток.

4.5. Этапы бактериологического исследования

Задачей первого этапа бактериологического исследования является выделение чистой культуры кампилобактеров. С этой целью возможны 2 варианта посева исследуемого материала:

1 - посев на селективные питательные среды;

2 - посев с использованием ядерных фильтров.

Первый вариант предусматривает посев испражнений непосредственно на питательные среды (кровяной эритрит агар, угольный эритрит агар, кампилобакагар) с использованием добавок: аэротолерантных (железа II сульфата, натрия пирувата, натрия метабисульфита в концентрации 0,025 % каждой из солей, (см. Приложение 1) и селективных (смеси антибиотиков для подавления сопутствующей микрофлоры, (см. Приложение 2). Перед посевом фекальные пробы суспензируют в изотоническом растворе NaCl или в 0,1 % пептонной воде в соотношении 1:10.

Применение метода ядерных фильтров позволяет производить посев материала на неселективные питательные среды. Использование ядерных фильтров с диаметром пор 0,46 и 0,55 мкм и отказ от внесения в среду селективных добавок способствует: сокращению времени выделения кампилобактерий до 24 часов инкубации; возможности обнаружения разных видов кампилобактерий; росту возбудителя в чистой культуре, что значительно упрощает учет результатов посева; снижению стоимости анализа.

Ядерные фильтры размером 3×3 см, стерилизованные автоклавированием при +121 °С в течение 30 минут, переносятся пинцетом на подсушенную питательную среду. Затем на поверхность фильтров пипеткой наносят 0,1 мл суспензии фекалий в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида или консерванте. Через 30 минут экспозиции фильтры удаляют. Допускается повторное использование ядерных фильтров после: обеззараживания кипячением в дистиллированной воде в течение 5 минут (без интенсивного кипения воды), промывания в проточной воде, просушивания, визуальной проверки целостности, стерилизации автоклавированием при +121 °С в течение 30 минут [4].

Инкубация всех посевов проводится при температуре +42,5 - 43 °С в микроаэрофильных и капнофильных условиях. Оптимальные условия для культивирования кампилобактеров создает атмосфера, содержащая 5 % кислорода, 10 % углекислого газа, 85 % азота. Длительность инкубации составляет 48 часов с обязательным просмотром посевов через 24 часа.

Необходимые устройства для культивирования кампилобактерий:

термостат с регулируемой газовой средой, или микроанаэростаты, или эксикаторы, или сборник для твердых радиоактивных отходов, или системы для инкубации Genbox и др.

Способы создания газовой смеси: использование газовой смеси из баллонов; химические газогенерирующие пакеты.

4.6. Идентификация выделенной культуры

На следующем этапе исследования проводится идентификация выделенной культуры.

При обнаружении подозрительных колоний из них готовят мазки с последующей окраской кристалл-виолетом или 1 % раствором фуксина. При выявлении микроорганизмов с характерной морфологией (изогнутые палочки S-образные или в виде крыльев чайки) проводят традиционные тесты: определение цитохромоксидазы (с использованием стандартных наборов и реактивов для определения цитохромоксидазы), продукция каталазы со свежеприготовленным 3 % раствором перекиси водорода, КОН-тест с 3 % раствором КОН.

В настоящее время возможна первичная идентификация колоний,

подозрительных на кампилобактериозные, с помощью латексного агглютинационного набора (типа Campylobacter test kit фирмы ОХOID), который состоит из: карт с сухим кампилобактер-реагентом, имеющими тестовую и контрольную поверхность, экстрагирующего реагента 1 (раствора уксусной кислоты), экстрагирующего нейтрализующего реагента 2 (трис буфера, содержащего 0,09 % азида натрия в качестве консерванта), положительного контрольного реагента.

Методика основана на взаимодействии латексных частиц тестовой поверхности, сенсибилизированных кроличьими антителами, с поверхностными антигенами отобранных клеток кампилобактера.

Подозрительную колонию сначала смешивают с каплей реагента 1 в экстракционной пробирке, оставляют на 3 минуты. Затем добавляют 2 капли экстрагирующего нейтрализующего реагента 2, тщательно перемешивают. Используя веслообразную пастеровскую пипетку, помещают 1 каплю (50 мкл) нейтрализующего экстракта на тестовой круг и 1 каплю на контрольный круг. Веслообразным концом пастеровской пипетки сначала перемешивают экстракт и сухой контрольный реагент, затем эта процедура повторяется и для тестового реагента.

Учет реакции в течение трех минут покачивания карты без использования увеличительного стекла. Результат является положительным, если агглютинация латексных частиц происходит через три минуты, что указывает на присутствие Campylobacter spp. Реакция считается отрицательной, если агглютинация в тестовом окне отсутствует. Реакции, наступающие в тестовом окне после 3-х минут, игнорируются. Тест не подлежит интерпретации, если происходит агглютинация с контрольным реагентом, что указывает на аутоагглютинацию культуры.

Для определения вида выделенной культуры основным тестом является гидролиз гиппурата, позволяющий дифференцировать С. jejuni от других видов. Кроме того, для идентификации используют также определение устойчивости к налидиксовой кислоте, цефалотину, температурный тест, ТТХ (0,04 % трифенилтетразолий хлорид), продукция нитратредуктазы и др.

Для большинства практических лабораторий Российской Федерации постановка некоторых из этих тестов проблематична, что связано с необходимостью приобретения различных химических ингредиентов для реактивов, сложностью их приготовления, трудностями при тестировании и интерпретации результатов.

Важнейшие фенотипические признаки термофильных кампилобактеров

Читайте также: