Тест-система для диагностики аденовирусной инфекции

УДК: 616.98:(578.823.91+578.826.2]-07
Год издания: 2013

РОТА-АДЕНО-АГ-ИХМ-Конф — тест-система для одновременной экспресс-диагностики ротавирусной и аденовирусной инфекций

Нашей задачей являлась разработка и освоение производства тест-системы для определения обеих указанных ОКИ методом иммунохроматографического анализа с конфирматорным тестом. Отличительной конструктивной особенностью разработанной тест-системы является наличие в ней компонентов, позволяющих выполнять подтверждающий тест методом ИХМ.

Разработанное лекарственное средство предназначено для качественного иммунохроматографического определения и подтверждения выявления антигенов ротавирусов и аденовирусов в биологических субстратах при проведении профессиональной специфической лабораторной диагностики этих инфекций у пациентов с клиникой ОКИ.

Тест-система представляет набор, состоящий из 10 компонентов, и имеет следующую комплектацию:

№ 2. Буферный раствор объемом для приготовления проб.

№ 3. Буферный раствор объемом для растворения иммунобиологических компонентов.

№ 4. Антиген ротавирусный (ПК-РОТА).

№ 5. Антиген аденовирусный (ПК-АДЕНО).

№ 6. Неинфицированная культура клеток (ОК).

№ 7. Сыворотка крови кролика, не содержащая антитела к ротавирусам (КР-РОТА).

№ 8. Асцитическая жидкость мышей, не содержащая антител к аденовирусам (КР-АДЕНО).

№ 9. Сыворотка крови кролика, содержащая антитела к ротавирусам (КфР-РОТА).

№ 10. Иммунная асцитическая жидкость мышей, содержащая антитела к аденовирусам (КфР-АДЕНО).

• Инструкция по применению.

Указанная комплектация лекарственного средства позволяет выполнить диагностическое исследование и подтвердить его специфичность без использования дополнительных реагентов и оборудования. В каждом наборе имеется 20 диагностических тестов, включая контроли и подтверждающие тесты.

Исследование проводится в два этапа: прямой (выявляющий одновременно антигены ротавирусов и аденовирусов) тест и тест, подтверждающий специфичность полученных положительных результатов.

Прямой тест. Иммунологическая реакция по определению антигенов рота- и аденовирусов осуществляется на мембране с предварительно нанесенными ингредиентами. Мембрана помещена в кассету (тест-кассета), на которой имеются окна с зонами внесения исследуемой пробы (S) и учета результатов реакции (Р). Содержащийся в пробе рота- или аденовирусный антигены специфически взаимодействует с соответствующими моноклональными антителами, ковалентно связанными с красными или синими микросферами. Микросферы с образовавшимися на них иммунными комплексами под действием капиллярных сил мигрирует по мембране и пересекают поперечные полоски ковалентно связанных с мембраной противоротавирусных и противоаденовирусных иммуноглобулинов в зоне Р. Мигрирующие на красных и синих микросферах иммунные комплексы специфически взаимодействуют с антителами и останавливаются на уровне этих полосок. О наличии антигенов ротавирусов в пробе свидетельствует появление красной полоски в зоне Р, о наличии аденовирусных антигенов - появление синей полоски в зоне Р. Зеленая полоска служит внутренним контролем каждой тест-кассеты.

Подтверждающий тест. Добавление в положительную на содержание ротавирусного антигена пробу противоротавирусных антител в специально подобранной концентрации (КфР-РОТА) приводит к образованию иммунных комплексов и специфическому блокированию антигена. При постановке прямого иммунохроматографического теста ротавируссодержащая проба с добавленным конфирматорным реагентом не должна образовывать красной полоски в зоне Р. Добавление в положительную на содержание аденовирусного антигена пробу противоаденовирусных антител в специально подобранной концентрации (КфР-АДЕНО) приводит к образованию иммунных комплексов и специфическому блокированию антигена. При постановке прямого иммунохроматографического теста аденовируссодержащая проба с добавленным конфирматорным реагентом не должна образовывать синей полоски в зоне Р.

Лекарственное средство зарегистрировано в Министерстве здравоохранения Республики Беларусь, регистрационное удостоверение № ИМ-7.99763.

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Амосова Ирина Викторовна, Соминина А. А., Смирнова Т. Д., Суховецкая В. Ф., Бузицкая Ж. В.

New monoclonal kits for the diagnosis of the adenoviral infection

Diagnostic properties of new monoclonal antibodies (MAbs) to hexon adenovirus antigen (AB) monoclonal ELISA kit for early diagnosis of adenoviral infection were tested. Developed ELISA kit and FITC-conjugate of new monoclonal antibodies for immunofluorescent analysis were used for detection of different types of adenoviruses in clinical materials. The availability of their use in clinical and epidemiological practice was validated.

• эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависит от пола, вида и степени насыщенности зараженного клеща;

• метод ИФА менее чувствительный, чем ПЦР-РВ;

• отмечена зависимость чувствительности ИФА от субтипа ВКЭ;

Исследования, представленные в работе, поддержаны грантом РФФИ № 14-04-31716-мол_а.

2. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398: 262-72.

3. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation. Virology. 2007; 362: 75-84.

4. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially en-

gorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks Tick Borne Dis. 2012; 3(4): 240-6.

5. Белова О.А., Козловская Л.И., Романова Л.Ю., Шевцова А.С., Буренкова Л.А. Сравнительный анализ эффективности различных методов заражения иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита. В кн.: Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. М.; 2008; т. 25: 47-52.

2. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398: 262-72.

4. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks Tick Borne Dis. 2012; 3: 240-6.

5. Belova O.A., Kozlovskaya L.I., Romanova L.Yu., Shevtsova A.S., Burenkova L.A. Comparative analysis of the effectiveness of different ixodid ticks' infection methods with TBEV. In: Meditsinskaya virusologiya: Trudy IPVE imeni M.P. Chumakova. Moscow; 2008; vol. 25: 47-52. (in Russian)

В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ

АмосоваИ.В., Соминина А.А., Смирнова Т.Д., СуховецкаяВ.Ф., БузицкаяЖ.В., Войцеховская Е.М.,

Новые моноклональные тест-системы для диагностики

Ключевые слова: аденовирус; моноклональные антитела; диагностические тест-системы.

New monoclonal kits for the diagnosis of the adenoviral infection

Amosova I. V., Sominina A. A., Smirnova T. D., Sukhovetskaya V. F., Buzitskaya Zh. V., Voitsehovskaya E. M.,| Sirotkin A. K. |

Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation, 197376, St. Petersburg, Russia

Diagnostic properties of new monoclonal antibodies (MAbs) to hexon adenovirus antigen (AB) monoclonal ELisA kit for early diagnosis of adenoviral infection were tested. developed ELIsA kit and FiTc-conjugate of new monoclonal antibodies for immunofluorescent analysis were used for detection of different types of adenoviruses in clinical materials. The availability of their use in clinical and epidemiological practice was validated.

Key words: adenovirus; monoclonal antibodies; diagnostic kits.

Аденовирусы (АВ) представляют собой обширное семейство вирусов (Adenoviridae), патогенных для человека, млекопитающих и птиц. По своей распространенности они занимают третье место после гриппа и респираторно-синцитиальной инфекции. В отличие от эпидемий гриппа, имеющих выраженную сезонность, АВ-инфекции регистрируются на протяжении всего года, вызывая подъем уровня заболеваемости в основном среди детских групп населения [1, 2]. АВ провоцируют тяжелые поражения не только верхних, но и нижних отделов дыхательного тракта в виде пневмоний, бронхитов и бронхиолитов, являются причиной вспышек кератоконъюнктивитов и нозокомиальных заболеваний. Они являются также причиной лимфоаденопатий, острых и хронических тонзиллитов, отитов, фарингитов, протекающих с явлениями интоксикации и гипертермии, поражений печени и миокарда. Отдельные серотипы (31, 40, 41) АВ вызывают вспышки гастроэнтеритов [3]. Тяжелое генерализованное течение АВ-инфекций нередко развивается у пациентов с иммуносупрессией, которым осуществляется трансплантация органов или костного мозга [4]. Создание современных средств химиотерапии определяет необходимость разработки эффективных средств ранней диагностики АВ-инфекции. При создании высокоспецифичных иммунологических тестов, как правило, используют антивирусные моноклональные антитела (МКА), способные обеспечить необходимый уровень стандартизации полученных препаратов [5].

Материалы и методы

Клеточные культуры и вирусы. В работе использовали АВ серотипов 3, 4, 6, 7, 14, 19 и 21. Для контроля специфичности реагирования полученных МКА использовали вирусы гриппа А и В, парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), а также лизаты клеток HeLa. Накопление биомассы вирусов, очистку и концентрацию вирусов проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы согласно [6].

Гексонный антиген (ГА) АВ. АВ 6-го типа осаждали из осветленной вируссодержащей жидкости одновременным добавлением 10% раствора сернокислой меди и 10% раствора бикарбоната натрия. Очистку от солей производили с помощью гель-фильтрации с использованием сефадекса G-25 (Sigma, США). Полученный раствор антигена диализовали против 0,5 моль/л ацетатного буфера (рН 4,6), после чего переносили в колбу и оставляли при температуре 4°С на 2 нед до образования кристаллов ГА в форме тетраэдров, отчетливо видимых при малом увеличении микроскопа (х100).

Выделение аденовирусов в культуре клеток. Для изоляции АВ использовали культуры клеток Hep2 и Vero, которые на 1-2-е сутки роста в среде Игла с добавлением 5% фетальной сыворотки инфицировали материалами от больных ОРВИ, взятыми не позднее 4 сут от начала заболевания. Зараженные клеточные культуры инкубировали при 36±1°С. Образцы ежедневно просматривали в течение 2 нед для выявления цитопатического эффекта с еженедельной заменой поддерживающей среды. Серотип изолята определяли в реакции нейтрализации с использованием типоспецифических сывороток к АВ.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения специфической активности МКА и их пероксидазных конъ-югатов (МКА-ПХ) планшеты сенсибилизировали очищенными вирусными концентратами АВ 3, 6 и 21-го типов, а также ГА в концентрации 2,5-5 мкг/мл. Для контроля специфичности взаимодействия использовали лизат нормальных,

не инфицированных клеток HeLa и гетерологичные вирусы (грипп, парагрипп, РСВ). Исследуемые МКА (или МКА-ПХ) разводили в 0,01 М ФСБ-Т (рН 7,2) с 10"1 до 10"7 и вносили по 100 мкл в планшеты, трижды отмытые от несвязавшегося антигена с помощью ФСБ-Т, содержащего 5% желатина. По завершении инкубации (2 ч для МКА и 45 мин для МКА-ПХ при 37°С) и отмывания ФСБ-Т в лунки вносили по 100 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в концентрации 0,1 мг/мл на ацетат-цитратном буфере (рН 5,5), содержащем 0,005 % Н2О2. Реакцию останавливали через 10-15 мин добавлением 50 мкл 1М H2SO4. Результаты ИФА учитывали на иммуно-ферментном анализаторе фирмы Anthos (Австрия) при длине волны 450 нм. Титром антител считали последнее разведение, при котором сигнал ОП 450 МКА в 2,5 раза превышал ОП 450 контрольных образцов (ФСБ-Т).

Для индикации вирусных антигенов и определения лимита чувствительности иммуноферментных тест-систем (ИФТС) планшеты сенсибилизировали МКА, разведенными на 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5) до концентрации (2,5-5 мкг/мл). После инкубации 18 ч при 4°С в отмытые планшеты вносили разведения исследуемых вирусов, контрольные образцы или материалы от больных. После инкубации в течение ночи при 4°С и 4-кратного отмывания ФСБ-Т связанные вирусные антигены выявляли с помощью МКА-ПХ.

Электронно-микроскопический (ЭМ) анализ. В работе использовали метод просвечивающей электронной микроскопии (микроскоп JEM-10-11, Япония).

Подготовка клинических образцов. Взятие носоглоточных мазков и подготовку препаратов для МИФ проводили согласно [10], образцы фекалий подготавливали, как описано [11].

Определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Оценку показателей качества разработанных препаратов проводили в сравнении с методами выделения вируса в культуре клеток, МИФ, ПЦР, а также определяли прирост специфических антител в сыворотках переболевших с помощью ИФА. Расчет показателей чувствительности и специфичности проводили, как описано [12].

Характеристика МКА к гексонному антигену АВ. С учетом имеющихся литературных данных о высоком консерватизме ГА АВ, общего для разных подродов АВ [13], этот антиген избрали в качестве иммуногена при получении МКА. В работе использовали гибридных мышей линии SJL/J, у которых отмечают ослабленный контроль экспансии В-лимфоцитов, что предполагает синтез более широкого репертуара антител, чем у животных других инбредных линий [14].

Для иммунизации мышей в целях получения гибридом использовали кристаллический ГА АВ 6-го типа, который содержал антигенные детерминанты, общие для разных серо-типов аденовирусов. В результате слияния клеток миеломы мышей Рх8Ag.653 с иммунными спленоцитами и их последующего клонирования отобрали семь стабильных клонов гибридом (№ 2, 3, 6, 9, 10, 11, 14), секретирующих антитела к ГА. По показателям специфической активности, оцененной в ИФА и МИФ, из панели МКА для последующих работ по

результатами других методов)

Группа обследованных с симптомами ОРВИ Кол-во обследованных больных Частота выявления, % Диагностические параметры ИФТС "Аденовир" в сравнении с результатами комплекса методов, %*

ИФТС "Аденовир" МИФ чувствительность | специфичность

Госпитализированные взрослые Госпитализированные дети Вспышка ОРВИ

Примечание. * - МИФ, выделение вирусов в культуре клеток, ИФТС-IgG-АД.

конструированию диагностических тест-систем выбрали МКА 6, которые выгодно отличались от других МКА более широким спектром реагирования в отношении различных серотипов АВ (типы 3, 6, 14, 19, 21), а также высоким уровнем специфической активности в ИФА (титр -10-6) и МИФ (титр в непрямом МИФ 10-3).

Специфическую направленность МКА 6 и МКА 7F1 оценивали в конкурентном ИФА. При исследовании систем МКА 6 - конъюгат ПХ-МКА 7F1 и МКА 7F1 - конъюгат ПХ-МКА 6 показано, что немеченые МКА 6 не влияли на связывание с антигеном конъюгатов ПХ-МКА 7F1, а реакцию конъюгатов ПХ-МКА 6 не подавляли МКА 7F1, т.е. они имели разную эпитопную направленность. Показано, что МКА 6 не обладали перекрестной реактивностью с другими возбудителями ОРВИ (вирусами гриппа А и В, РС-вирусом, парагриппа) и антигенами клеток хозяина, хорошо выдерживали процедуры конъюгации с пероксидазой хрена и ФИТЦ, а также лио-филизации.

Характеристика спектра реагирования препарата ФИТЦ-МКА 6. Опытные серии ФИТЦ-конъюгатов МКА 6 исследовали на модели клеточных культур, зараженных АВ 6, 3 и 21-го серотипов, а также клеточных культур, инфицированных материалами от больных, среди которых выявлены современные штаммы АВ 2 типа и эпидемически значимых 3, 4 и 7-го типов, принадлежащих, как известно, к различным группам АВ (В, С, Е). Все перечисленные се-ротипы АВ выявляли при окраске ФИТЦ-МКА 6 в виде яркой флюоресценции в ядрах и цитоплазме инфицированных клеток. Клинико-лабораторную апробацию ФИТЦ-МКА 6 провели в сравнении с поликлональным препаратом ИДФАГ (ООО ППДП, Санкт-Петербург) с использованием клинических материалов от 120 детей, госпитализированных по поводу ОРВИ. Чувствительность и специфичность МИФ при использовании ФИТЦ-МКА 6 в сравнении с препаратом ИДФАГ составили 96,7 и 90% соответственно, общее совпадение результатов 95%.

Актуальность простых и быстрых тестов лабораторной диагностики АВ-заболеваний определяется необходимостью назначения ранней этиотропной противовирусной терапии и профилактики АВ-инфекций. Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материале от больных. К перспективным иммунологическим тестам относятся ИФА и МИФ, базирующиеся на использовании высокоспецифичной и стандартизованной реагентики моноклонально-го типа [3].

Разработаны моноклональные тест-системы для диагностики АВ-инфекций, базирующиеся на использовании им-мунофлюоресцентного анализа и ИФА, которые обладали достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, сопоставимой с зарубежными аналогами.

Достоинством разработанных МКА и тест-систем на их основе оказалась возможность выявления АВ, принадлежащих к различным подгруппам семейства Adenoviridae.

1. Амосова И.В. Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. СПб; 2009.

2. Соминина А.А., Киселев О.И., Маринич И.Г., Карпова Л.С., Смородинцева Е.А., Коновалова Н.И. и др. Этиологический мониторинг за гриппом и другими ОРЗ в России в сезон 2003-2004 годов. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004; 6: 5-11.

3. Киселев О.И., Жилинская И.Н., ред. Вопросы общей вирусологии: учебное пособие. СПб: СПбГМА им. И.И. Мечникова; 2007.

4. Zheng X. Identification of adenoviruses in specimens from high-risk pediatric stem cell transplant recipients and controls. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 317-20.

5. Qijek C., Gulen F. Comparison of the assay with the combination of shell vial cell culture and immunofluorescence antibody test for the detection of respiratory viruses. J. Virol. Methods. 2007; 143: 161-8.

6. Монаенков А.О., Сологуб В.К., Соминина А.А., Амосова И.В., Липина Н.В., Милькинт К.К. и др. Получение и характеристика моноклональных антител к аденовирусу в иммуноферментных и иммунофлуоресцентных реакциях. Вопросы вирусологии. 2000; 5: 30-3.

7. Фридляндская И.И. Получение моноклональных антител (гибри-домная клеточная технология): сборник научных трудов. Л.; 1988.

8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22: 1084-91.

9. Mc Kinney P.M. Fluorecein diacetate as a reference color standard fluorescent antibody stadies. Anal. Biochem. 1964; 9 (4): 474-6.

10. Соминина А.А., Милькинт К.К., Амосова И.В. Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом: методические рекомендации. СПб: ГУ НИИ гриппа РАМН; 2006.

11. Doane F.W. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses. In: Kapikian A.Z., ed. Viral infections of the gastrointestinal tract. 2nd ed New York: Marcel Dekker; 1994: 101-30.

12. Chomel J.J., Remilleux M.F., Marchand P., Aymard M. Rapid diagnosis of influenza A. Comparison with ELISA immunocapture and culture. J. Virol. Methods. 1992; 37: 337-44.

13. Echavarria M. Adenoviruses in immunocompromised hosts. Clin. Microbiol. 2008; 21: 704-15.

14. Климович В.Б. Моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека: Автореф. дисс. . д-ра мед. наук. СПб; 1996.

1. Amosova I.V. Development andimprovement of means andmethods of immunoassay adenovirusinfection [Razrabotka i usovershenstvovanie sredstv i metodov immunodiagnostiki adenovirusnoy infektsii]. Diss. boil. sci. St Petersburg; 2009. (in Russian)

2. Sominina A.A., Kiselev O.I., Marinich I.G., Karpova L.S., Smorodintseva E.A., Konovalova N.I. et al. Etiological monitoring of influenza and other acute respiratory infections in Russia in 20032004 season. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2004; 6: 5-11. (in Russian)

3. Kiselev O.I., Zhilinskaya I.N., ed. Questions of general virology: a training manual (Voprosy obshchey virusologii: uchebnoe posobie). St Petersburg: SPbGMA im. I.I. Mechnikova; 2007. (in Russian)

4. Zheng X. Identification of adenoviruses in specimens from high-risk pediatric stem cell transplant recipients and controls. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 317-20.

6. Monaenkov A.O., Sologub V.K., Sominina A.A., Amosova I.V., Lipina N.V., Mil'kint K.K. et al. Preparation and characterization of monoclonal antibodies to adenovirus in immunoassays and immunofluorescence reactions. Voprosy virusologii. 2000; 5: 30-3. (in Russian)

7. Fridlyandskaya I.I. Preparation of monoclonal antibody (hybridoma cell technology) [Polychenie monoklonal'nykh antitel (gibridomnaya kletochnaya tekhnologiya]. Leningrad; 1988. (in Russian)

8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22: 1084-91.

9. Mc Kinney P.M. Fluorecein diacetate as a reference color standard fluorescent antibody stadies. Anal. Biochem. 1964; 9 (4): 474-6.

10. Sominina A.A., Mil'kint K.K., Amosova I.V. Rapid diagnosis of influenza and other acute respiratory viral infection by immunofluo-rescence: methodological recommendations [Bystraya diagnostika grippa i drugikh ORVI immynofluorectsentnym metodom: metodi-cheskie rekomendatsii]. St Petersburg: GU NII grippa RAMN; 2006. (in Russian)

11. Doane F.W. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses. In: Kapikian A.Z. ed Viral infections of the gastrointestinal tract. 2nd ed New York: Marcel Dekker; 1994: 101-30.

12. Chomel J.J., Remilleux M.F., Marchand P., Aymard M. Rapid diagnosis of influenza A. Comparison with ELISA immunocapture and culture. J. Virol. Methods. 1992; 37: 337-44.

13. Echavarria M. Adenoviruses in immunocompromised hosts. Clin. Microbiol. 2008; 21: 704-15.

14. Klimovich V.B. Monoclonal antibodies against human immunoglobulins [Monoklonal'nye antitela protiv immunoglobulinov]. Diss. St Petersburg; 1996. (in Russian)

Подписные индексы на журнал "Вопросы вирусологии"

Индекс 71416 Индекс 27875

для индивидуальных подписчиков, для индивидуальных подписчиков,

предприятий и организаций предприятий и организаций

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Тест-кассета iCHECK–Rotavirus/Adenovirus - это одностадийный иммунохроматографический экспресс тест для качественного определения ротавируса и /или аденовируса в фекалиях человека.

КРАТКАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Ротавирус и аденовирус являются главной причиной, вызывающей инфекционные гастроэнтериты у новорожденных и детей младшего возраста, кроме того они встречаются и у взрослых. Способ передачи инфекции фекально-оральный. Главными симптомами вирусного гастроэнтерита являются водянистая диарея и рвота. Заболевший также может жаловаться на головную боль, жар и абдоминальные спазмы (боль в желудке). Чаще всего, симптомы появляются в 1-2 день инфицирования и могут длиться от 1 до 10 дней, в зависимости от вируса (Ротавирус – 3 дня, аденовирус – 5-8 дней).

ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ ТЕСТА
Тест iCHECK – Rotavirus/Adenovirus - это качественный иммунохроматографический тест для выявления ротавируса и аденовируса в фекалиях человека. В зоне появления тестовой линии мембрана покрыта моноклональными антителами мыши против вирусных антигенов.
Во время проведения тестирования образец реагирует с окрашенным коньюгатом (анти – ротавирус моноклональные мышиные антитела, коньюгированые с красными микросферами, анти-аденовирус моноклонольные антитела мыши, коньюгированные с голубыми микросферами) предварительно высушенным на тест-полоске. Затем смесь под действием капиллярных сил продвигается вдоль по мембране. Поскольку образец продвигается по мембране, окрашенные частицы тоже мигрируют. В случае положительного результата специфические антитела, находящиеся на мембране, захватят коньюгат. В результате тестирования будут видны тестовые линии разного цвета, в зависимости от того, какой вирус присутствует в образце. Данные линии позволяю интерпретировать результат тестирования.
Смесь продолжит свое движение до зоны иммобилизации антител, расположенной в месте появления контрольной полосы, зеленая контрольная линия появляется всегда. Наличие этой зеленой линии расценивается как то, что 1) был добавлен правильный объем образца 2) получен хороший ток 3) данная линия является внутренним контролем реагентов.

ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
Хранить в запечатанном виде при температуре 2-300С. Тест стабилен до истечения срока годности, указанного на запечатанном пакетике. Тест должен оставаться в запечатанной упаковке до момента использования. НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Только для профессионального использования в целях диагностики in vitro
Не использовать по истечении срока годности
Все образцы, взятые на анализ, должны расцениваться, как потенциально опасные и храниться как инфекционные агенты
После проведения тестирования тест должен быть помещен в специальный контейнер для биологически опасных материалов

СБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Образцы фекалий должны быть собраны в чистый контейнер, а исследование должно проводиться сразу после сбора образцов. Перед проведением тестирования образцы могут храниться в холодильнике при температуре 2-40С в течение 1-2 дней. Для длительного хранения, максимум 1 год, образцы должны замораживаться при температуре –200С. В этом случае образцы должны быть полностью разморожены и перед тестированием их температура должна быть доведена до комнатной.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА (см. иллюстрацию):

Снимите колпачок с флакона, предназначенного для сбора образцов. Используйте палочку для забора небольшого количества образца. Закройте флакон вместе с образцом фекалий и растворителем.
Встряхните флакон, чтобы добиться хорошего растворения фекалий.

ПРЕДОСТАВЛЕННЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Тест – кассеты
Инструкция по применению
Флаконы для сбора образцов с растворителем.

НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПРЕДОСТАВЛЕННЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Контейнер для сбора образцов
Одноразовые перчатки
Часы

ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ
Перед тестированием необходимо довести температуру тест устройства, образцов фекалий и контролей до комнатной температуры (15-300С). Не вскрывайте упаковку теста, пока не будете полностью готовы к проведению тестирования.

Продолжайте встряхивать флакон для сбора образцов фекалий, чтобы добиться хорошего растворения образца. Отрежьте кончик колпачка.
Извлеките тест-устройство iCHECK–Rotavirus/Adenovirus непосредственно перед началом тестирования.
Используйте отдельный флакон для сбора образцов для каждого нового образца или контроля. Нанесите ровно 5 капель или 150 μl в круглое окошечко S, помеченное стрелкой, избегайте попадания вместе с жидкостью твердых частиц.
Прочитайте результат тестирования через 10 минут (появление окрашенных полос).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ

Отрицательный:
Только одна зеленая полоса появилась в центральном окошке в секторе, отмеченном буквой С (контрольная линия);

Ротавирус-Положительный:
В дополнение к зеленой контрольной линии, другая красная линия (тестовая линия на ротавирус) также появилась в секторе, отмеченном буквой Т (линия результата);

Аденовирус-Положительный:
В дополнение к зеленой контрольной линии, другая голубая линия (тестовая линия на аденовирус) также появилась в секторе, отмеченном буквой Т (линия результата);

Ротавирус-Аденовирус Положительный:
В результате тестирования все вышеописанные линии (зеленая контрольная линия в контрольной зоне, красная тестовая линия и голубая тестовая линия в тестовой зоне) могут появиться одновременно, это говорит об одновременном инфицировании ротавирусом и аденовирусом.

Недействительный:
Отсутствие окрашенной контрольной линии (зеленой) вне зависимости от наличия или отсутствия линий результата (красной/голубой). Неправильный объем пробы, несоблюдение техники проведения процедуры тестирования или порча реагентов – наиболее частые причины отсутствия контрольной линии. Проанализируйте процедуру тестирования и повторите ее с использованием нового теста. Если проблема остается, прекратите тестирование и свяжитесь с вашим местным дистрибьютором.

ЗАМЕЧАНИЯ ПО ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ
Интенсивность окраски красной или голубой тестовых линий будет варьироваться в зависимости от концентрации антигенов в образце. Однако ни количественное содержание антигенов, ни степень возрастания их количества с помощью данного качественного теста не могут быть установлены.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Внутренний процедуральный контроль уже включен в тест-устройство. Зеленая линия, появляющаяся в контрольной зоне (С) является внутренним процедуральным контролем. Она подтверждает, что был добавлен нужный объем образца, и процедура тестирования была проведена правильно.

ОГРАНИЧЕНИЯ

Тестирование должно проводиться в течение двух часов с момента вскрытия запечатанной упаковки.
Превышение количества образца может обуславливать получение неправильного результата тестирования (появляются коричневые линии). Разведите образец с помощью буфера и повторите тестирование.
Через неделю с момента заражения число паразитов в фекалиях снижается, делая образцы менее реактивными. Образцы фекалий для анализа должны быть собраны в течение одной недели с момента появления симптомов.
Данный тест позволяет поставить только предположительный диагноз наличия Рота- и/или Аденовирусной инфекции. Подтвержденный диагноз может быть поставлен врачом только после проведения всего комплекса клинических и лабораторных изысканий.

ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
У здоровых новорожденных, детей младшего возраста, а также у здоровых взрослых результат тестирования отрицателен.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Исследование чувствительности включало сравнение результатов анализов, полученных с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus теста и других коммерчески доступных мембранных исследований на рота- и аденовирус.

Чувствительность
Результаты определения ротавируса с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus в >99% случаев совпадали с другими коммерчески доступными тестами.
Результаты определения аденовируса с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus в 90% случаев совпадали с результатами других коммерчески доступных тестов.

Специфичность
Результаты определения ротавируса с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus в 98% случаев совпадали с другими коммерчески доступными тестами.
Результаты определения аденовируса с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus в >99% случаев совпадали с результатами других коммерчески доступных тестов.

Использование при разработке тест-устройства iCHECK–Rotavirus/Adenovirus моноклональных антител мыши гарантирует высокую степень специфичности при определении этих вирусов.

Москва, Кулакова ул., 20, Телефоны: , 757-99-15, 757-96-96, 8 (800) 600-54-27, e-mail: tender@bioworld.ru

Читайте также: