Риф при ротавирусной инфекции у

Оглавление диссертации Нди, Кристофер :: 1984 :: Киев

1. КМССЙФИКАЦИЯ РОТАВИРУСОВ

2. ЭПИЗООТОЛОГИЯ РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

3. БИОЛОГИЯ РОТАВИРУСОВ

4. ПАТОГЕННОСТЪ И АНТИГЕННЫЕ ВЗАИГЮДЕЙСТВИЯ

5. ИММУНИТЕТ ПРИ РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

6. ДИАГНОСТИКА РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЩ/М

7. ПРИМЕНЕНИЕ ИММУН(тЮОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ТЕЛЯТ '

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

1.1. Приготовление первично-трипсинизированной культуры клеток почек эмбрионов коров /ПЭК/

1.2. Получение сублиний клеток почек эмбрионов коров /ПЭК/ и изучение изменений морфологии клеток в монослое под воздействием различных факторов

1.3. Отработка методики культивирования лабораторного штамма ротавируса £>А II в монослоях клеточных культур ПЭК и СПЭВ, выращенных на покровных стеклах

1.4. Обнаружение специфического ротавирусного антигена в клеточных культурах ПЭК и СПЭВ на покровных стеклах, инфицированных лабораторным штаммом ротавируса обезьян Ък II

1.5. Гипериммунизация коз

1.6. Гипериммунизация морских свинок

1.7. Гипериммунизация кроликов

1.8. Прямой метод реакции иммуноголюоресценции

1.9. Непрямой метод реакции иммунофлюоресценвди

1.10. Обнаружение ротавирусного антигена при помощи ' РИФ в материалах, отобранных от больных и павших с признаком диареи новорожденных телят

1.11. Приготовление мазков из фекалий в полевых условиях

1.12. Приготовление мазков из фекалий в лаборатории

1.13. Приготовление мазков со слизистой прямой кишки больных диареей телят

1.14. Обнаружение ротавируса в фекалиях больных диареей телят на культурах клеток ПЭК и СПЭВ в РИФ

1.15. Приготовление мазков-отпечатков из слизистой тонкого отдела кишечника павших от диареи новорожденных телят

1.16. Приготовление гистосрезов стенки тонкого отдела кишечника павших от диареи телят для исследования в РИФ

1.17. Выяснение возможности титрования ротавируса в суспензии клеток СПЭВ при помощи РИФ

1.18. Исследование возможности использования РИФ при титровании ротавируса и постановке реакции виру снейтрализации

1.18.1. Титрование в РИФ ротавируса £>А II

1.18.2. Постановка реакции нейтрализации на клетках

ПЭК и СПЭВ по ЦПД и РИФ

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Приготовление первично-трипсинизированной культуры почек эмбрионов коровы /НЭК/

2.2. Получение сублиний ПЭК и изучение изменений морфологии клеток в монослое под воздействием различных Факторов

2.3. Отработка методики культивирования лабораторного штамма ротавируса вА II в монослоях клеточных культур ПЭК и СПЭВ '

2.4. Обнаружение специфического ротавирусного антигена в клеточных культурах ПЭК и СПЭВ на покровных стеклах, инфицированных лабораторным штаммом ротавируса обезьян БА II

Результаты исследований в РИФ материалов от больных и павших с диареей новорожденных телят

Исследование возможности использования реакции иммунофлюоресценции при титровании ротавируса и постановке реакции вируснейтрализации

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Нди, Кристофер, автореферат

В последние годы заметное распространение приняла ротавирусная диарея новорожденных телят, которая наносит наиболее существенный экономический ущерб скотоводству.По мере накопления информации о свойствах ротавирусов стало ясно место этих вирусов в семействе Reov-iridae , что было признано Международным комитетом по таксономии вирусов /72/.К тому же, теперь есть доказательство того, что ротавирусы достаточно отличаются от рео- и орбивирусов, а это оправдывает выделение их в отдельный род. Данное предложение впервые высказано в 1974 году /75 / , когда было предложено название - ротавирус из-за сходства между этими вирионами и колесиками. Некоторые ученые эти вирусы предлагали называть "дуовирусами" /57/ , признавая двуслойный капсид и дуоденальный источник не- 7 которых штаммов вируса у человека.Самые ранние исследования ротавирусной инфекции у животных проводили Light and Hedes /1943/, вызывая диарею у телят при помощи фекальных фильтратов от больного диареей ребенка. В 1976 году было доказано, что данный вирус является ротавЕгрусом /135/. Было доказано также, что возбудителем эпизоотической - 8 диареи мышат /102/ является РШ<-содержащий ротавирус /89; 223/. Обезьяньи вирус / s A-II/ /114/ является ротавирусом, который патогенен для телят и поросят^гнотобиотов /166/. Современные исследования ротавирусов начались с выделения возбудителя от диарейных телят в США, и затем от детей и телят в Великобритании и Австралии, которыми установлено, что возбудитель этой болезни относится к CeMelCTByReovlrxdae С рОДОвыгд названием "ротавирус" /33; 78; 129; 220/.

Заключение диссертационного исследования на тему "Применение реакции иммунофлюоресценции для диагностики ротавирусной диареи новорожденных телят"

1. С целью установления цредварительного диагноза на рота вирусную инфекцию при массовых диареях новорожденных телят мо жет быть эффективно использована реакция иммунофлюоресценции /РИФ/ даш исследования мазков из фекалий или мазков-отпечатков слизистой тонкого отдела кишечника павших животных.2. РИФ позволяет выявлять в 53-54^ случаев специфический антиген в препаратах из фекалий, полученных от больных диареей телят, а также в клетках ПЭК после инфицирования их этими мате- 116 риалами.3 . Частота обнаружения при помощи РИФ ротавирусного анти гена в мазках-отпечатках и гистосрезах тонкого отдела кишечни ка павших от диареи телят зависела от места взятия материала и способа его приготовления. Чаще всего обнаруживался спеодфичес кий антиген в срезах и мазках-отпечатках, изготовленных из пе редней и средней части тощей кишки и 12-перстной кишки, реже из подвздошной и задней части тощей кишки.4. Специфическое свечение в зараженных клетках ПЭК и ШЭВ адаптированным к ним ротав11русом s А II отмечалось через 6-10 часов после инфицирования, максимальное свечение большинства клеток монослоя наблюдалось к 24г-30 часу.5. Опыты по культивированию и титрованию штамма sA I I , а также по обнаружению вируса в суспензии из фекалий больных ди ареей телят показали, что клетки ПЭК обладают более высокой чувствительностью к ротавирусу, чем СПЭВ.

6. Адаптация и культивирование ротавируса в клетках СПЭВ и ПЭК стали возможными лишь после добавления в питательную сре ду 2 мкг/мл трипсина, а также после обработки этим ферментом вируссодержащего материала в дозе 10 мкг/мл.7. Одновременным титрованием ротавируса sA I I и постанов кой реакции вируснейтрализации в клетках СПЭВ и ПЭК по ЦЦЦ и РИФ показана возможность эффективного использования последней для титрования вируса и определения вируснеитрализующих свойств иммунных сывороток. Цитопатические изменения в клетках ПЭК и СПЭВ во всех случаях наступали значительно реже, чем обнаружи вался в этих клетках ротавирусный антиген. 8. С целью получения клеток ПЭК для проведения исследова ния РИФ необходимо брать эмбрионы 2-3 месячного возраста, трип синизацию проводить не позже чем через 3 часа после отбора по чек. Оптимальной посевной концентрацией как для первичной куль туры, так и для субжший клеток ПЭК является концентрация 700-

800 тыс/мл. Эффективной ростовой средой при получении клеток ПЭК является среда, состоящая из 2 частей гидролизата лакталь бумина, I части среды 199 и 10% сыворотки крови крупного рога того скота.П р а к т и ч е с к и е п р е д л о ж е н и я Рекомендовать в комплексе с другими методами использовать реакцию иммунофлюоресценции для диагностики ротавирусной диа реи новорожденных телят, а также для изучения взаимодействия вирус-клетка и определения инфекционности вируссодержащих ма териалов, особенно при отсутствии цитопатических свойств штагл мов ротавируса,

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 1984 года, Нди, Кристофер

1. Дроздов Г., Покровокий В.И., Ротавйрусный гастроэнтерит. МапмловВ. «•= "Медавдна". 1962, 0.92-94.

2. Завьялова Г.Н. Экспериментальное обоснование промышленной технологии первичных культур клеток. Автореферат кандидатской диссертации, Владимир, 1970.

3. Зыкина Н.А. Внутриутробное развитие крупного рогатого скота черно-пестрой породы. В кн. : "Профилактика и лечение болезней сельскохозяйственных животных". Труды Кировского сельскохозяйственного института. 1975, 12, 24-27. - 119 -

4. Краснобаев Е.А, Вирусная диарея крупного рогатого скота. В кн.: Лабораторная диагностика вирусных болезней животных. М., ^ 'Колос", 1972, 414 с.

5. Ласковый В.Н. II. Никольский В,В. О выделении вирусных агентов при гастроэнтеритах поросят методом иммунофлюоресценции. Тр. Саратов. Н.-й. Вет. ст., 1980., 14, 34-36. Инфекционный вирусный гастроэнтерит свиней. К.: ^'Урожай", 1964,

6. Осидзе Д.Ф. Получение культур клеток из тканей животных и их использование в вирусологии. М.: "ВНИИТЭИСК", 1975, 103 с.

7. Самойлов П.П., Пантелеев Ю.В., Сюрин В.И. Изоляция цитопатогеиного ротави-руса телят. Вопросы Ветеринарии, 1982, I, 61-64.

8. Сергеев В.А. 15, Сергеев В.А. Выделение двух линий перевиваемых клеток почек и сердца крупного рогатого скота. Цитология, 1963, 5,1, 104-107. Размножение вирусов животных в культуре ткани. М., "Колос", 1966, 289 с.

9. Смирнова Г.А., Гаври- Особенности роста почечного эпите- лов В.И. ля овцы в культуре ткани. Вопросы Вирусологии, I96I, 2, 227-231.

10. Собко А.И., Купчинский А.Г. Ультраструкт '^рные особенности - Балштрин Ю А CTaTitrevo А П ротавируса обнаруженного у ьарштеин IU.A., отарчеус д.п. о^л^ ^^ щ. гастроэнтеритом свиней. Микробиологический Журнал, I98I, 43, 2 , 499-500.

12. Сюрин В.Н. Аденовирусная инфекизя крупного рогатого скота, В кн. : Лабораторная диагностика вирусных болезней 2ШВ0ТНЫХ. М., "Колос", 1972, 414с.

13. ADAI^ S U.R., KRAFT L.M. Epizootic, diarrhea of infant mice: identification of the etiologic agent. Science., 1963, 141, 359 - 360,

14. ALBREY M.B., MURPHY A.M. Rotavirus gro;-rth in bovine monolayers. lancet., 1976, 1, 753.

15. AD'IEIDA J. Multiple viruses present in the faeces of a. scouring calf. Voter. Rec. 1978, 102, 170 -171.

16. BABIUK L.A., MOHAMffiD K., Rotavirus isolaton and cultivation in the pre- SPENCE L., FAUVEL M., sence of trypsin. J. Clin, Microbiol., 1977, PETRO R. 6, 610 - 617.

17. BAWATVALA J.E., TOTTERDELL., In-vitro detection of human rotaviruses. BARBARil., CHRYSTIE L., lancet.,'1975, 11, 821. UOODE G.N.

18. BARNETT B.B., SPENDLOVE R.S., ImTiunofluorescent cell assay of neonatal PETERSON M.H., HSU L.Y., calf diarrhea virus. Can. J. Сотр. Med.,

19. ASALLE V.A., EGBERT L.N. 1975, 39, 4-62.

20. BARNETT B.B., SPENDLOVE R.S., Effect of enzymes on rotavirus infectivi- CLARK M.L. ty. J. Clin, bucrobiol., 1979, Ю , 111.

21. BERGELAiro M.E., McADARAGH J.P., Proceedings of 26 western poultry STOTZ I. disease conference and 11 poxjltry health symposium. J. south Dakota state Univ., 1977, 129 - 130.

22. BISHOP R.F., DAVIDSON G.P., Virus particles in epithelial cells of du«- HOLtiES I.H., RUCK B.J. denal mucosa from children with acute nonbacterial gastroenteritis. Lancet., 1973, 11, 1281 1283. - 122 -

23. BOHL E.H., SAIF L.J., Porcine pararotavirus: Detection, differentia- THEIL K.W., AGUES A.G., tion from rotavirus, and pathogenesis in gno-CROSS R.F. tobiotic pigs. J. Clin. Microbiol., 1982, 15, 312.

24. BORDEN E.C., SHOPE R.E., Physico-chemical and morphological relation- MURPHY F.A. ships of some arthropod-borne viruses to blue-tongue virus- a medical taxonomic group. Electron microscopic studies. J. Gen. Virol., 1971, 13, 261 - 271.

25. DAVIDSON G.P., BISHOP R.F., TOIJNLEY R.R.¥., HOU-fflS I.H., RUCK B.J. Importance of a new virus in acute sporadic enteritis in children. lancet., 1975, 1, 242 - 246. 124 -

29. ELLENS D.J., DE LEEUl-J P.U., STRJIVER P.J., VAN BALMN J.A.

32. ESPEJO R.T., CALDERON E., GONZALEZ. ESPEJO R., MilRTINEZ E.,

33. OPEZ S., MUNOZ 0. Distinct reovirus-like agents associated г^/ith acute infantile gastroenteritis.. J. Clin. Microbiol,, 1977, 6, 502 - 5o6. Different polypeptide composition of two human rotavirus types. Infect. Immun., 1980, 28, 1, 230 - 237. - 125 -

34. ESTES M.K., GRAHAM D.Y., GERBA СР., SMITH E.M.

35. FAUVEL M., SPENCE L., BABIUK L.A., PETRO R., BLOCK S.

36. FERNELIUS A.L., RITCHIE A.E, CLASSICK L.G., NORI'IAN J.O., MEBUS СA.

37. FLEVJETT Т.Н., BRYDEN A.S., DAVIES H.A.

38. FLEIJETT Т.Н., BRYDEN A.S., DAVIES H.A., UOODE G.N., BRIDGER J.C, DERRICK J.

39. FLEIJETT Т.Н., DAVIES H.A., BRYDEN A.S., ROBERTSON M.J.

40. FLEl'JETT Т.Н., BRYDEN A.S., DAVIES H.A.

42. FOSTER L.G., PETERSON M.V., SPENDLOVE R.S.

43. HOBES I.H., RUCK-B.J., BISHOP R.F., DAVIDSON G.P.

44. INABA Y., SATO K., TAMH/iSHI E . , SATODA K. 9 2 . JOHNSON R.H.

45. I^LICA A.R., GARON C.F. FfATT R.G., 1-IEBUS C.A., VAN KIRK D.H., CHANOCK R.M. IL\PIKIAM A.Z.

46. I^LTER S.S., HEBERLING R.L. RODRIGUEZ A.R., LESTER T.L.

47. KAPIKIAN A.Z., KIMH.W., IJYATT R.G.,RODRIGUEZ IJ.J., ROSS S., CLINE U.L., PARROT R.H., CHANOCK R.M.

48. IvAPIKIAN A.Z., VJIATT R.G., GREEI^ERG H.B., KALICA A.R. KIM H.W., BRilNDT CD.

49. KAUSHIRK A.K., SRIVASTAVA PRASAD S. 101 . котаз В.

53. LEEUT-J P.D.DE. Rotavirus infecties bij kalveren. Tijdschr. Diergeneesk., 1976, 23, 1298. - 1 2 8 -

54. ЬЕЕШЛ P.D. DE. 109. шиши J . , МЬй-ЕШСК М., STROBBE R.

59. MiATSUNO S., INOUYE S., KONO R. An antigenic subunit present in rotavirus infected faeces. J. Virol,, 1977, 34, 325 - 329. Plaque assay of neonatal calf diarrhea virus and the neutralizing antibody in human sera. J. 61in. Microbiol., 1977a, 5, 1.

60. MAYR A. Control of acute virus diseases of calves in the Federal Republic of Germany. Veter. Sc. Communic, 1979, 3, 3 - 19. - 129 -

62. McMLTY M.S., ALLAN G.M., Isolation of cytopathic calf rotavirus. KcFERRilN J.B. Res. Vet. Sci., 1976a, 21, 114 - 115.

63. McNULTI M.S., ALLAN G.M., Comparison of methods for diagnosis of CURRIN IJ.L., McFElffiAN J.B. rotavirus infection of calves. Vet. Rec, 1976, 98, 4-63 - 46Л.

64. MciraLTY M.S., McFERRAN J.B., Studies on rotavirus infection and BRYSON D.G., LOGAN E.F., diarrhea in young calves. Vet. Rec, 1976, CURRAN W.L. 99, 229 - 230.

65. McMLTY M.S., CURRAN ¥.L., The morphogenesis of a cytopathic bovine McFERRAN J.B., rotavirus in I^ ladin-Darby bovine kidney cells. J. Gen. Virol., 1976c, 33, 503 -508.

66. McNTJLTY M.S., ALUN G.M., Cell culture studies xath a cytopathic McFERRjiN J.B. bovine rotavirus. Arch. Virol., 1977, 54, 201 - 209.

67. McNULTY M.S., ALLflN G.M., Synthesis of coreless, probably defective McFERRilN J.B. virus particles in cell cultures infected with rotaviruses. Arch. Virol., 1978, 58, 193.

68. MEBUS СA. Reovirus-like calf enteritis. Amer. J. Dig. Dis., 1976, 21, 592 - 598.

69. MEBUS C.A. Viral calf enteritis. Symposium : Biological agents causing infections in dairy cattle. J. Dairy Sci., 1976, 59, 1175 -1178.

70. MEBUS C.A., UNDERDAHL N.R., Calf diarrhea (scours) reproduced T^jith a RHODES M.B., TT;JIEHAUS H.J. virus from a field outbreak. Bull. Neb. Agric. Exp. Statn., 1969, 233, 1 - I6.

73. MORIи M., blRIVIERE S . , 1.i\LLIER R.

74. MORIN M., L/iRIVIERE S . , 1.ilLLIER R.

76. MURPHY A.M., ALBREI M.B., CREl-JE E.B.

79. OBIJESKI J . F . , PALMER E .L . , MiilRTIN M.L.

82. OXENDER U.D., NEirrilN L .E . , MORROIJ D.A.

83. PALMER E . L . , lilRTIN M.L., MTJRFHY F.A

87. PAB-SNT P . , I'LuRSOLAIS G., ЕАШ/ЕЕ H. , LAMONTAGNE L . , A3SAF R., i-iAROIS P.

89. SGHMFER D.H., SCOTT F.U. 174-. SCHMGL R.D., K0LMS3 I.H.

90. Sli-ihOIJ A., xlLi'^iTO S., KERMANDEZ F., YOLICEN R.K., MATA L.

91. SN0DGRAS3 D.R., ЗЖТН TJ., GRAY E.U., HEIffiliJG J.A.

92. SHODGiUSS D.R., HERRIrlD J.A. GFJiY E.O.

93. SPENCE L., FAUYEL M., PETRO R., BLOGFx S.

94. STAIR E.L., MEBUS C.A., TN^IEHAUS M.J., UilDERDAHL N.R.

98. THE 1-JrIO/FAO PROGxRAtl-'IE ON COi-ffARATIVE VIROLOGY.

99. TliEODORIDIS L . , PR0ZE3KY., ELS H.J .

100. THOULESS Ы.Е., BRYDEN A.S., FLEl-JETT Т.Н. Serotypes of human rotavirus. 1.ancet., 1978, 1, 39.

101. THURBER E.T., BASS E.P., BECiffibniiUJER H.H. Field trial evaluation of a reo-coronavirus calf diarhea vaccine. Canad. J. Сотр. Hed., 1977, Л1, 131 - 136.

103. TODD D., McMLTY M.S. Biochemical studies on a reovirus- like agent (rotavirus) from lambs. J. Virol., 1977, 21, 1215 - 1218.

104. TORRES M.A., WIATT R.G., MSBUS СA., miDERDAHL N.R., KAPIKIAN A.Z. Diarrhea caused in gnotobiotic piglets by the reovirus-like agent of human infantile gastroenteritis. J. Inf. Dis., 1976, 133, 22 - 27.

105. TRUSZGZYNSKI M., LIS H. Bydta rola rota -i coronawirusov; w schorzeniach. Med. Veter., 1980, 36, 321 - 323.

106. TUFTOSSON В., JOHNSON T. Immunoelectroosmophoresis for detection of reo-like virus methodology and comparison with electron microscopy. Experentia., 1976, 36, 498.

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

240 руб. | 75 грн. | 3,75 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Нди, Кристофер. Применение реакции иммунофлюоресценции для диагностики ротавирусной диареи новорожденных телят : Дис. . канд. ветеринарные науки : 16.00.03.- Москва 2006

Содержание к диссертации

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6

КЛАССИФИКАЦИЯ РОТАВИРУСОВ 6

ЭПИЗООТОЛОГИЯ РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 8

БИОЛОГИЯ РОТАВИРУСОВ 24

НАТОГЕННОСТЬ И АНТИГЕННЫЕ ВЗАШДОДЕИСТВИЯ

МЕВДҐ РОТАВИРУСАМИ . 28

ИММУНИТЕТ БРИ РОТАВИРУСЯО/І ИНФЕКЦИЙ 36

ДИАГНОСТИКА РОТАВИРУСНО/І ИНФЕКЩ/Ш 39

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНВДИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ТЕЛЯТ ' 45

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ 51

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 51

I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 51

Приготовление первично-трипсинизированной культуры клеток почек эмбрионов коров /ПЭК/ 51

Получение сублинии клеток почек эмбрионов коров /ПЭК/ и изучение изменений морфологии клеток в монослое под воздействием различных факторов 54

Отработка методики культивирования лабораторного штамма ротавируса >А II в монослоях клеточных культур ПЭК и СПЭВ, выращенных на покровных стеклах . 55

Обнаружение специфического ротавирусного антигена в клеточных культурах ПЭК и СПЭВ на покровных стеклах, инфицированных лабораторным штаммом ротавируса обезьян SA II 57

Гипериммунизация коз 58

Гипериммунизация морских свинок 58

Гипериммунизация кроликов 59

Прямой метод реакции иммунофлюоресценции 60

Непрямой метод реакции иммунофлюоресценции 60

1.10. Обнаружение ротавирусного антигена при помощи

* ' РИФ в материалах, отобранных от больных и пав-

ших с признаком диареи новорожденных телят 61

Приготовление мазков из фекалий в полевых условиях 63

Приготовление мазков из фекалий в лаборатории 63

Приготовление мазков со слизистой прямой кишки больных диареей телят 64

Обнаружение ротавируса в фекалиях больных диареей телят на культурах клеток ПЭК и СПЭВ в РИФ 64

Приготовление мазков-отпечатков из слизистой тонкого отдела кишечника павших от диареи новорожденных телят 65

Приготовление гистосрезов стенки тонкого отдела кишечника павших от диареи телят для исследования в РИФ 66

Выяснение возможности титрования ротавируса в суспензии клеток СПЭВ при помощи РИФ 67

Исследование возможности использования РИФ при

* ' титровании ротавируса и постановке реакции ви-

I.X8.I. Титрование в РИФ ротавируса >А II 68

I.I8.2. Постановка реакции нейтрализации на клетках

ПЭК и СПЭВ по ЦПД и РИФ 69

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 72

2.1. Приготовление первично-трипсинизированной

' культуры почек эмбрионов коровы /ПЭК/ 72

Получение сублиний ПЭК и изучение изменений морфологии клеток в монослое под воздействием различных факторов 78

Отработка методики культивирования лабораторного штамма ротавируса SA II в монослоях клеточных культур ПЭК и СПЭВ " 84

Обнаружение спевдфического ротавируоного антигена в клеточных культурах ПЭК и СПЭВ на покровных стеклах, инфицированных лабораторным штаммом ротавируса обезьян SA II 86

Результаты исследований в РИФ материалов от

больных и павших с диареей новорожденных телят 90

Исследование возможности использования реакции

иммунофлюоресценции при титровании ротавируса

и постановке реакции вируснейтрализации 102

ОБСУЖДЕНИЕ МАТЕРИАЛОВ 106

Практические предложения 117

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 118

Введение к работе

Продовольственная программа СССР, принятая Майским Пленумом ЦК КПСС /1982/, имеет огромное значение не только для Советского Союза, но и для развития животноводства в развивающихся странах, в том числе и в республике Камерун. Для успешного решения программы необходимо проводить последовательную интенсификацию животноводства и комплекс мероприятий, направленных на оздоровление животных, на разработку мер против инфекционных заболеваний. Среди этих болезней особое место занимают заболевания желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота, которые представляют наибольшую опасность для крупных животноводческих комплексов и специализированных хозяйств. Возбудителями этих заболеваний очень часто являются различные вирусы* рота-, корона-, адено-, парвовирусы и другие, которые могут вызывать инфекции как самостоятельно, так и в различных сочетаниях /В.В.Никольский, 1964; В.Н.Сюрин и др., 1972; Е.А.Краснобаев, 1972; А.И.Собко, 1981; et ai., , 1974;

Orstavik ot al. , 1976/.

В последние годы заметное распространение приняла ротавя-русная диарея новорожденных телят, которая наносит наиболее существенный экономический ущерб скотоводству.

Большое количество различных заболеваний новорожденных животных, сопровождающихся диареей, обусловливают необходимость быстрой и точной постановки диагноза, что является одним из первоочередных и важных звеньев в комплексе лечебно-профилактических мер при ротавирусной диареи новорожденных телят. Су-

ществующие методы лабораторной диагностики этого заболевания трудоемки, требуют значительных затрат и современное вирусологическое оборудование, в связи с чем используются, в основном, в оснащенных научных лабораториях, а практические специалисты диагностируют эти заболевания на основе клинике-эпизо-отологических данных. Пока ветеринарная практика не располагает простыми и доступными методами лабораторной диагностики ротавирусной инфекции.

Все это послузшло для нас основанием к разработке экспресс-метода лабораторной диагностики ротавирусной диареи новорожденных телят с использованием реакции иммунофлюоресцен-ции. Результаты проведенных исследований изложены в предлогае-мой диссертации.

I. Статистические данные по ротавирусной инфекции

Ротавирусная инфекция это инфекция , вызываемая ротавирусом, которая протекает с поражением желудочно-кишечного тракта. Для этой болезни характерно острое начало и крайне редко встречаются хронические формы этого заболевания.

Ротавирусная инфекция чаще всего поражает детей младшего возраста. Так, в первые 4 года жизни данная патология выявляется у 80,4 процентов пациентов. В возрастной группе 5 – 9 лет заболевание определяется только в 19,6 процентов случаев.

По данным итальянских ученых ротавирус представляет собой главную причину всех инфекционных заболеваний, которые протекают с водянистой диареей, и составляет от 27 до 30 процентов.

Основным носителем ротавирусной инфекции являются дети, посещающие детский сад или другие детские коллективы. Среди детей дошкольного возраста носителем данного вируса являются от 1,5 до 9 процентов малышей.

Основные симптомы ротавируса – это диарея (наблюдается у всех больных детей) и рвота (присутствует в 92,7 процентов случаев). В 28,5 процентах заболеваний рвотные позывы являются многократными. Часто ротавирус сопровождают такие симптомы как слабость и апатия – 92,3 процента, плохой аппетит или его отсутствие – 81,3 процента. Плач и беспокойство отмечено у 93,7 процентов пациентов.

II. Механизм передачи

Возбудитель болезни - вирус, похожий своей формой на колесо, отличается высокой выживаемостью. Вне человеческого организма ротавирус не гибнет в водопроводной воде в течение 2 месяцев. На овощах и фруктах вирус сохраняет свою жизнеспособность на протяжении месяца, а на различных предметах – от 1 до 7 недель.

Здоровый человек заражается ротавирусом от больного или от носителя алиментарным путем (фекально-оральным). Это значит, что заражение вирусом происходит через систему пищеварения. Этот путь передачи инфекции характерен для большинства кишечных инфекций. Чаще всего заражение происходит через зараженную воду или пищу (водный или алиментарный путь передачи). При употреблении зараженной еды или воды здоровый человек переносит в свой организм этот вирус. Вирус попадает в пищу посредством немытых рук, при неправильной технологии приготовления пищи или ее хранения. Водный путь встречается не так часто как пищевой, но имеет важное эпидемиологическое значение. При употреблении зараженной воды заболевает большое количество людей.

Также вирус может передаваться и контактно-бытовым путем, через предметы обихода или грязные руки от больного человека. Учитывая такой путь передачи инфекции, следует придавать огромное значение правилам личной гигиены при уходе за больным.

Инкубационный период (время с момента попадания вируса в организм до появления первых симптомов заболевания) при ротавирусной инфекции составляет 2 суток. Это время необходимо для того, чтобы вирус развился и размножился в организме.

III. Клиника

Дети дошкольного возраста по-разному переносят ротавирусную инфекцию в зависимости от возраста и состояния организма в целом.

Возрастная группа детей от одного до трех лет, также как и груднички, является наиболее уязвимой перед ротавирусом. Заболевание в этой возрастной группе протекает в средней или тяжелой форме.

Дошкольная группа в возрасте от трех до семи лет переносит ротавирусную инфекцию в более легкой форме.

Таб.1 Основные различия в течении ротавирусной инфецииу детей разных возрастных групп

от года до трех лет

от трех до семи лет

степень выраженности кишечного синдрома может варьировать от сильно выраженной до умеренной. Длительность кишечных проявлений составляет три – пять дней.

выражен умеренно или слабо. Обычно длительность его составляет не более трех дней.

интоксикация организма сильно выражена. Она может сохраняться от двух до четырех суток.

синдром интоксикации проявляется в легкой или умеренной форме. Длительность его составляет в среднем полтора – два дня.

полное выздоровление наступает через 6 – 7 дней

период выздоровления приходится на 4 – 5 сутки.

У детей младшего дошкольного возраста (до трех лет) ротавироз имеет острое начало. В первый день болезни повышается температура тела до 38 – 39 градусов Цельсия, реже до 39 – 40 градусов Цельсия. Высокие цифры ртутного столбика сохраняются от двух до четырех дней. Затем температура понижается до субфебрильной (37,1 – 38,0 градусов Цельсия).

Ротавирус у детей старшей группы также имеет острое начало, однако цифры температуры тела не поднимаются выше 38,0 – 38,5 градусов Цельсия. Повышенная температура может сохраняться до двух суток.

Ротавирусная инфекция в большей степени поражает слизистую оболочку пищеварительного тракта, вызывая гастроэнтерит, поэтому кишечные симптомы являются самыми выраженными.

В группу кишечных симптомов ротавируса у детей дошкольного возраста входят:

• рвота;
• диарея;
• боль в области живота;
• метеоризм

Таб.2 Характеристика кишечных симптомов ротавируса у детей от одного до семи лет

дети от 1 до 2 лет

дети от 2 до 7 лет

рвота появляется в первые часы после повышения температуры. Она многократна. Частота колеблется от 3 – 4 раз в сутки до 5 – 7 раз. Рвота обычно прекращается на второй день, но рвотные позывы сохраняются еще пару дней.

появляется в первый день болезни, вместе с повышением температуры. Чаще всего рвота однократна, предшествует диарее. Зачастую сопровождается тошнотой, которая может сохраниться до трех дней.

диарея начинается в первый же день болезни. Дефекация носит внезапный, непроизвольный характер.

Стул от жидкого до водянистого. Он обильный, с неприятным резким запахом, пенится.

Частота испражнений в среднем 10 – 15 раз в сутки. При тяжелых формах ротавирусной инфекции частота достигает более 25 раз в сутки.

Диарея стихает через три – четыре дня.

диарея начинается в первый же день болезни. Дефекация носит внезапный, непроизвольный характер.

Стул светло коричневый или желтоватый, кашицеобразный. Он обильный, с неприятным резким запахом, немного пенится.

Частота испражнений в среднем 2 – 3 раза в сутки (не более 5 раз в день).

Диарея стихает через два – три дня.

боли в области живота

обычно дети до двух лет не умеют говорить и не могут выразить словами боль. Во время болевых ощущений ребенок хватается за живот, часто приседает или сгибается.

ребенок может жаловаться на боли в животе, слабые или умеренные по интенсивности. У маленьких детей боль чаще всего будет локализована возле пупка, у детей постарше боль будет носить разлитой характер. Чаща всего боль носит схваткообразный характер.

отмечается вздутие живота с частым урчанием.

отмечается умеренное вздутие живота с периодическим урчанием.

По причине частых диарей и рвоты при ротавирусе организм ребенка теряет большое количество воды, что приводит к дегидратации (обезвоживанию). Появляется сухость кожных покровов, губ и языка. Ребенок становится апатичным, отказывается от еды. Учащается дыхание и сердцебиение. Наиболее подвержены обезвоживанию дети младшей группы (до двух – трех лет), а также дети с малой массой тела.

IV. Диагностика

Одним из основных методов диагностики ротавирусной инфекции является иммуноферментный анализ (ИФА) , который помогает обнаружить антигены ротавируса в исследуемых материалах. Он является довольно простым и высокочувствительным методом ранней диагностики ротавирусной инфекции.

Забор биоматериала:биоматериалом для иммуноферментного анализа ротавирусной инфекции выступают фекальные пробы (кал) пациента. Существует несколько правил по забору кала больного, для получения точных и достоверных результатов ИФА.

Основными пунктами по забору фекальных проб пациента являются:

• забор биоматериала следует произвести в течение 72 часов от начала заболевания.
• для детей старшего возраста используются горшки или судна.
• после естественной дефекации больного с помощью стерильной деревянной или стеклянной палочки фекалии помещают в стерильный контейнер (пробирку или баночку с завинчивающимся колпачком).
• количество биоматериала составляет один – два грамма испражнений.
• хранение и транспортировка анализа кала производится при низкой температуре (2 – 8 градусов Цельсия).
• забор биоматериала производится до начала приема антибиотиков или других терапевтических препаратов.

Основной целью исследования методом ИФА является лабораторная диагностика инфекции, вызванной ротавирусом. При помощи ИФА-метода можно определить заражение организма больного ротавирусом в период его инкубации или в острую фазу болезни. Также ИФА-методом можно выявить бессимптомных носителей ротавируса.

Вариантами результатов ИФА являются:

• положительные образцы;
• отрицательные образцы;
• неопределенные образцы.

Положительные образцы указывают на наличие большой концентрации антигена ротавируса в исследуемом образце кала.

Отрицательный результат говорит об отсутствие антигенов ротавируса в фекальных пробах пациента.

Часть образцов могут быть неопределенными или сомнительными. В них обнаруживается антиген к ротавирусу в небольшом количестве. В таком случае ИФА стоит повторить с новым фекальным образцом.

• интерпретацию результатов ИФА на ротавирусную инфекцию следует проводить только в совокупности клинических данных.
• положительный результат указывает на острую фазу заболевания ротавирусной инфекцией.
• отрицательный результат обычно подразумевает отсутствие ротавируса в организме больного, и делается вывод, что болезнь вызвана другим возбудителем. Однако, если клинические признаки болезни и эпидемиологическая ситуация предполагают ротавирусную инфекцию, отрицательный результат вынуждает повторение ИФА.

V. Лечение

Принципы лечения ротавирусной инфекции у взрослых и у детей дошкольного возраста такие же, как и у грудных детей. Основной принцип лечения – это восполнение потерянной жидкости и профилактика обезвоживания. С этой целью также принимаются солевые растворы. Пакетик регидрона разводят в одном литре кипяченной, но охлажденной воды. Принимают раствор по 50 мл (одна пятая стакана) после каждого испражнения. При средней степени обезвоживания рекомендуемый объем раствора составляет 10 мл на 1 кг веса в час. Так, человек массой в 60 кг за час должен выпить 600 мл раствора регидрона. После первых признаков улучшения дозу снижают до 5 мл на 1 кг веса в час, что будет равняться 300 мл раствора. Употреблять раствор следует после каждого жидкого испражнения или рвоты. Объем рекомендуемого раствора снижают по мере улучшения состояния. При наличии жидкого стула 2 – 3 раза в день объем рекомендуемой жидкости составляет один литр.

При легких и средних формах тяжести ротавирусной инфекции восполнение потерянной жидкости можно осуществлять перорально без применения внутривенных инфузий. Однако, в тяжелых случаях, когда лечение ротавирусной инфекции осуществляется в условиях стационара, прибегают к внутривенному введению коллоидных и кристаллоидных растворов. С этой целью назначаются реополиглюкин, рефортан, перфторан. Количество необходимого раствора и скорость его введения является строго индивидуальным и определяется исходя из объема потерянной больным жидкости. К этому методу лечения прибегают тогда, когда потеря организмом жидкости составляет 10 процентов и более.

Выведение токсинов из кишечника:

Для этого назначается активированный уголь, смекта, энтеросгель. Активированный уголь (коммерческое название - карболен) взрослым и детям дошкольного возраста назначается по три таблетки три раза в день.

Детям дошкольного возраста в первые три дня заболевания назначают по 4 пакетика в сутки, затем переходят на 2 пакетика. Длительность лечения составляет от 5 до 17 дней. Содержимое пакетика растворяют в половине стакана (125 миллилитров) кипяченой воды и принимают в течение дня.

Детям дошкольного возраста рекомендуемая доза препарата составляет 1 столовую ложку три раза в день. Препарат принимают за час до еды, запивая его водой. При невозможности проглотить гель его разводят в половине стакана воды и принимают также за час до еды.

Пациентам с ротавирусной инфекцией, особенно в острый период болезни, рекомендуется постельный режим и покой. Из пищи исключаются все молочные продукты, а также газообразующие продукты (кофе, ржаной хлеб, все виды капусты). Полностью исключаются газированные напитки, поскольку они способны раздражать кишечник и усиливать его перистальтику. Питание должно быть щадящее, но, в то же время, полноценное. Рекомендуется употреблять каши, овощные супы, кисель. Пища должна употребляться небольшими порциями.

Крайне редко при тяжелых формах ротавирусной инфекции назначаются противомикробные средства. Врач может назначить группу этих лекарств, если у пациента появилась высокая температура и если есть риск присоединения бактериальной флоры. В таком случае может назначаться энтерофурил, фуразолидон. Однако прием этих лекарств может еще больше навредить кишечной флоре, поэтому должен строго согласовываться с врачом.

При наличии температуры назначаются жаропонижающие средства, такие как парацетамол и ибупрофен. Если присутствует выраженный болевой синдром, то назначаются спазмолитики, такие как но-шпа или папаверин.

Особое внимание при лечении ротавирусной инфекции, а также при ее профилактике заслуживает соблюдение санитарных правил. Больной кишечным гриппом нуждается в изоляции. Комната, где он помещается, должна быть хорошо проветриваемой и чистой. Очень важно мыть руки после каждого посещение уборной, а также следить за чистотой постельного белья.

VI. Список литературы

1. Михайлова, Е. В. Современные подходы к терапии ротавирусной инфекции у детей до 3-х лет жизни / Е. В. Михайлова, Д. Ю. Левин // Вестн. С.-Петерб. гос. мед. академии им. И. И. Мечникова. 2006. - № 4. -С.119-124.
2. Михайлова, Е. В. Ротавирусная инфекция у детей: современные представления о вопросах этиологии, патогенеза и профилактики заболевания / Е. В. Михайлова, Д. Ю. Левин // Инфекционные болезни. -2004.-Т. 4, №2.-С. 24.
3. Новикова, Н. А. в Р.-типы ротавируса группы А человека и их распространение в Нижнем Новгороде и Дзержинске в 1997—2005 г. / Н. А. Новикова [и др.] // Вопросы вирусологии. 2007. - № 3. - С. 19-23.