Полиоксидоний при папиломо-вирусной инфекции

Хронические воспалительные заболевания внутренних половых органов (ХВЗВПО) занимают одно из первых мест в структуре гинекологических заболеваний. Часто такие заболевания характеризуются вялым рецидивирующим течением и трудно поддаются лечению антимикробными препаратами. Ведущая роль среди возбудителей инфекционной гинекологической патологии принадлежит Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus, Human papillomavirus. Перенесенные воспалительные заболевания, вызванные этими агентами, в последующем могут приводить к нарушению менструальной функции, бесплодию, внематочной беременности, самопроизвольным выкидышам, невынашиванию беременности, неразвивающейся беременности, нарушению внутриутробного развития плода, мертворождению.

Одной из главных причин роста числа заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, является снижение функциональной активности иммунологической системы организма, приводящее к проявлению патогенных свойств маловирулентных возбудителей. Следовательно, лечение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний должно быть комплексным и состоять из химиотерапевтических средств, направленных на элиминацию возбудителя, и иммуномодулирующих средств, основной точкой приложения которых является повышение резистентности организма к инфекционным агентам.

Одним из широкоиспользуемых средств с иммуномодулирующей активностью является Полиоксидоний, применяемый для лечения заболеваний различной этиологии с сопутствующими нарушениями иммунитета.

Полиоксидоний является лекарственным средством с широким спектром фармакологических свойств: иммуномодулирующим, детоксицирующим, антиоксидантным и противовоспалительным.

Иммуномодулирующие свойства Полиоксидония связаны со способностью существенно повышать поглощение и разрушение бактерий фагоцитами прежде всего за счет активации кислороднезависимых механизмов киллинга. Это способствует более быстрому снижению количества бактерий в воспалительном очаге и их элиминации из организма. При развитии воспаления и избыточной продукции фагоцитарными клетками свободных радикалов (супероксид-анион радикала, перекисных и гидроперекисных радикалов) Полиоксидоний понижает их уровень. Основой механизма иммуномодулирующего действия Полиоксидония являются прямое воздействие на фагоцитирующие клетки и естественные киллеры, а также стимуляция антителообразования.

Усиливая функциональную активность тканевых макрофагов и дендритных клеток, расположенных под эпителием слизистых оболочек, препарат активирует развитие адаптивного иммунитета, осуществляющего завершение процесса борьбы организма с инфекцией. Полиоксидоний является также активатором синтеза антител к инфекционным агентам. Стимуляция иммунитета с помощью Полиоксидония не истощает резервных возможностей кроветворной системы.

Антиоксидантные свойства Полиоксидония обусловлены его способностью уменьшать концентрацию каталитически активного двухвалентного железа в клетках в воспалительном очаге, что ведет к ингибиции перекисного окисления липидов и образования активных форм кислорода.

Проведена комплексная терапия 86 пациенток с обострением ХВЗВПО (Л. Е. Смирнова и соавт.). В основную группу вошли 39 больных, которым на фоне антимикробной терапии был назначен Полиоксидоний. Контрольная группа представлена 47 пациентками, которым проводилась только антимикробная терапия.

Пациенткам основной группы назначались суппозитории с Полиоксидонием (12 мг/сут) per vaginum ежедневно в течение 3 дней, после чего еще 7 суппозиториев вводились 1 раз в 3 дня. Местные симптомы и признаки интоксикации после проведенной комплексной терапии у пациенток основной группы исчезли практически полностью, тогда как в контрольной группе у 1/3 пациенток сохранялись боли и патологические выделения из половых путей, у 10,6% — зуд, у 2,1% — чувство жжения наружных половых органов, у 4,2% — дизурические расстройства, у 4,2% — диспареуния. После проведенной антибактериальной терапии у 23,4% больных в контрольной группе оставалось снижение физической активности; на слабость и головные боли продолжали жаловаться соответственно 25,5 и 8,1% больных.

Положительная динамика в клиническом анализе крови у всех больных основной группы отмечена уже на 5–7‑й день комплексной терапии (исчезновение лейкоцитоза, палочкоядерного сдвига лейкоцитарной формулы, нормализации скорости оседания эритроцитов — СОЭ). У пациенток контрольной группы в эти же сроки лечения положительная динамика со стороны всех показателей гемограммы отмечалась только у 29 (61,7%) больных.

На 5–7-е сутки от начала лечения были отмечены положительные изменения ультразвуковой (УЗ) картины у 80,2% больных основной группы: отсутствие свободной жидкости в позадиматочном пространстве и нормализация звукопроводимости тканей яичников. У 79% пациенток контрольной группы положительные изменения УЗ-картины наблюдались позже — на 10–14-е сутки от начала проводимой терапии, т. е. разрешение воспалительного процесса происходило в 2 раза медленнее.

Проведенное исследование показало, что в 92% случаев у пациенток основной группы была достигнута элиминация специфических возбудителей из шеечной слизи, тогда как у пациенток контрольной группы элиминация возбудителей достигнута лишь в 32% случаев.

После проведения комплексного лечения обострения ХВЗВПО с включением Полиоксидония (суппозитории 12 мг) у пациенток основной группы уровень иммуноглобулинов (Ig) в слизи цервикального канала достиг значений нормы: IgG — 0,56 ± 0,06 г/л (p

М. И. Варфоломеева, кандидат медицинских наук
Б. В. Пинегин, доктор медицинских наук, профессор
ГНЦ Института иммунологии, Москва

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: предрак шейки матки, папиллома, дисплазия, Полиоксидоний

Онкологические заболевания женской половой сферы остаются одной из актуальных проблем современного здравоохранения. Постоянное увеличение количества заболевших репродуктивного возраста требует усовершенствования диагностических и лечебных методик.

Наиболее распространенной формой рака гинекологической локализации и одной из основных причин смертности женщин в возрасте 35–40 лет считается рак шейки матки. Последние десять лет заболеваемость им возросла более чем в 1,5 раза. Так, в 2014 г. выявлено 16 130 новых случаев. Средний возраст больных составил 52,2 года [1]. По данным Международного агентства по изучению рака, к 2020 г. число впервые выявленных случаев рака шейки матки в мире возрастет приблизительно на 40% [1–3]. В связи с этим крайне актуально своевременное выявление фоновых, особенно предраковых поражений шейки матки.

Дисплазия шейки матки (изменение нормального клеточного состава эпителия) подразделяется на легкую, умеренную и тяжелую. Последняя классифицируется как истинный предрак шейки матки [2, 3].

В качестве скрининга предраковых заболеваний и рака шейки матки используется цитологическое исследование мазков с влагалищной порции шейки матки и цервикального канала, признанное экономически доступным и информативным методом обследования женщин разных возрастных групп. Чувствительность метода достигает 80%, специфичность – 86–100%, что доказывает его эффективность при диагностике заболеваний шейки матки [4, 5].

В настоящее время для классификации цитологических изменений мазков шейки матки используется Бетесдская система (см. врезку NB ) [6].

Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения, скрининговое обследование пациенток на выявление предраковых заболеваний и рака шейки матки следует проводить в возрасте 25–65 лет с интервалом один год в течение двух лет, далее при отрицательных результатах один раз в три года [2, 3].

Прекращение скрининга возможно у женщин 70 лет и старше с интактной шейкой матки, которым проведено три и более зарегистрированных последовательных отрицательных цитологических исследования на протяжении последних десяти лет. В программу скрининга не включаются пациентки, не живущие половой жизнью и перенесшие в анамнезе тотальную гистерэктомию. Однако ни в одной стране мира на текущий момент в полном объеме не реализованы программы скрининга заболеваний шейки матки по ряду экономических и социальных причин [2].

Накопленные данные об эпидемиологии дисплазии и рака шейки матки позволяют утверждать, что эти заболевания напрямую связаны с воздействием на эпителий шейки матки вирусной инфекции [5, 7]. В структуре патогенеза дисплазии эпителия одним из основных факторов является инфицирование вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска (16-й и 18-й типы). ДНК данного вируса выявляется в 50–80% гистологических образцов умеренной и тяжелой дисплазии шейки матки. В течение жизни большинство женщин инфицируются ВПЧ. Между тем носительство не является пожизненным: в 30% случаев происходит естественная элиминация ВПЧ из организма [8]. В Европе ВПЧ выявляется у 60–80% сексуально активных молодых женщин до 30 лет. Инфицированность популяции увеличивается с возрастом: пик приходится на 20–29 лет (40%). К 50 годам инфицированность снижается и впоследствии не превышает 5% [9].

Носительство ВПЧ не является обязательным условием злокачественного процесса, но риск диспластической трансформации эпителия шейки матки возрастает в несколько раз. Воздействие ВПЧ на базальный клеточный эпителий заключается во встраивании ДНК вируса в геном клеток, в результате чего формируются койлоциты, остроконечные кондиломы. В дальнейшем может наблюдаться длительная персистенция ВПЧ-ДНК в клетках с регрессией или развитием злокачественной трансформации элементов эпителия [1, 2, 5].

В арсенале современного врача отсутствуют лекарственные препараты, избирательно воздействующие на ВПЧ-инфекцию [7]. Лечение направлено на устранение последствий носительства ВПЧ – удаление фоновых и предраковых новообразований шейки матки. Применение противовирусной и иммунокорригирующей терапии позволяет снизить риск рецидива диспластических процессов после оперативного лечения, поскольку вероятность элиминации вируса ВПЧ из организма увеличивается [7].

Одним из широко применяемых иммуномодуляторов признан препарат Полиоксидоний®. Благодаря прямому воздействию на фагоцитирующие клетки и естественные киллеры, активации лимфоидных клеток, находящихся в регионарных лимфатических узлах, а именно В-клеток, продуцирующих секреторный иммуноглобулин (Ig) A, Полиоксидоний® повышает резистентность организма к локальной и генерализованной инфекции. Кроме иммуномодулирующего воздействия Полиоксидоний® характеризуется выраженной детоксикационной и антиоксидантной активностью.

Таким образом, важны раннее выявление дисплазии шейки матки, выбор адекватного лечения, проведение противорецидивной терапии и дальнейшее наблюдение с целью минимизации риска трансформации в рак шейки матки.

В ходе исследования оценивали эффективность препарата Полиоксидоний при тяжелой дисплазии эпителия шейки матки на фоне инфицирования ВПЧ 16-го и 18-го типов в сочетании с конизацией шейки матки.

Материал и методы

Основную группу составили 24 пациентки с реализованной репродуктивной функцией и дисплазией эпителия шейки матки тяжелой степени на фоне носительства ВПЧ 16-го и 18-го типов, проходивших лечение в ГКБ № 40 г. Москвы в 2014 г. Средний возраст – 29,6 ± 5,2 года. В контрольную группу вошли 15 гинекологически и соматически здоровых женщин (средний возраст – 31,6 ± 3,1 года), прошедших скрининг на заболевания шейки матки.

У пациенток обеих групп методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяли носительство ВПЧ 16-го и 18-го типов. Кроме того, обследование включало анализ мазка с влагалищной порции шейки матки и цервикального канала на онкоцитологию, а также проведение кольпоскопии.

Для верификации диагноза пациенткам основной группы были выполнены конизация шейки матки с выскабливанием слизистой оболочки цервикального канала с последующим гистологическим исследованием полученного материала. После морфологического подтверждения диагноза тяжелой дисплазии шейки матки пациентки получали иммуномодулирующую терапию. В послеоперационном периоде в качестве иммуномодулирующей терапии им назначали препарат Полиоксидоний® 12 мг в свечах ректально ежедневно в течение пяти дней, далее – через день. Общий курс – 15 свечей.

Эффективность лечения оценивали на основании результатов ПЦР-диагностики на выявление ДНК вируса ВПЧ 16-го и 18-го типов, бактериологического и цитологического исследования мазка, кольпоскопического контроля до начала лечения, через три, шесть, девять и 12 месяцев после его завершения. Для оценки состояния иммунной системы всем пациенткам выполняли клинический анализ крови (оценивали показатели лейкоцитов, гранулоцитов, лимфоцитов, моноцитов), а также иммунограмму (CD3, CD4, CD8, интерферон (ИФН) гамма, интерлейкины (ИЛ) 2 и 4, фактор некроза опухоли (ФНО) гамма, IgG, IgМ).

Персистенция в организме вирусной инфекции приводит к изменениям в иммунной системе. Подтверждение тому – показатели клинического анализа крови у пациенток основной группы.

Как видно из табл. 1, в группе пациенток с ВПЧ-носительством достоверно чаще наблюдались такие изменения клинического анализа крови, как лейкопения, моноцитопения, лимфопения, характерные для иммунного ответа на воздействие вирусной инфекции.

Через шесть месяцев после лечения в объеме хирургического вмешательства с последующим курсом препарата Полиоксидоний® наблюдалось полное восстановление основных показателей клинического анализа крови, что свидетельствовало об эффективном угнетении воздействия ВПЧ-инфекции на организм на фоне проведенной терапии.

Для более детальной оценки состояния иммунной системы в условиях ВПЧ-носительства и оценки эффективности проведенного лечения всем пациенткам основной группы была выполнена иммунограмма (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8, ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНО-гамма, IgG, IgМ). В таблице 2 приведены результаты иммунограммы до и через шесть месяцев после комплексного лечения тяжелой дисплазии шейки матки. До начала лечения наблюдалось статистически достоверное снижение уровней CD3, CD4, CD8, CD4/CD8, IgG, IgМ, ФНО-гамма. Через шесть месяцев после комплексного лечения зафиксирована нормализация показателей Т-клеточного иммунитета, что свидетельствовало о выраженном иммуномодулирующем эффекте препарата Полиоксидоний®.

Всем пациенткам основной группы проводили контроль мазков на онкоцитологию с целью выявления рецидива тяжелой дисплазии шейки матки через три и шесть месяцев после лечения. Не зарегистрировано ни одного случая рецидива.

Лечение истинного предрака шейки матки не только включает хирургическое вмешательство, но и требует коррекции иммунного статуса с целью повышения вероятности элиминации ВПЧ-инфекции из организма как одного из главных факторов диспластических процессов эпителия шейки матки. Нормализация иммунного ответа способствует снижению вероятности рецидива и злокачественной трансформации на фоне ВПЧ-носительства.

Как охотники готовятся к охоте — изучают следы, устанавливают кормушки, размещают загонщиков, ставят стрелков на линию огня, выпускают собак — так же и иммунологи, чтобы избавить организм от вируса, поэтапно готовят и направляют процесс активации иммунной системы. Первое действие — определить мишень.

Вирус папилломы, попав в клетки кожи, проявляет себя как двуликий Янус. Его геном может находиться в двух формах: или встроиться в хромосому клетки, или существовать в виде свободной молекулы — ДНК-эписомы. Если он встроился в клеточную хромосому, то при наличии предрасполагающих факторов происходит реализация программы его генома и вирус начинает размножаться. Пораженный участок превращается в папиллому, или бородавку. Причем порой это случается не на руке или ноге, а на слизистой оболочке в самых интимных местах человеческого тела. И если вирус принадлежит к особому подтипу, то лет через десять пораженные клетки, возможно, трансформируются в раковую опухоль.

Для своей успешной жизни вирус должен заставить клетку синтезировать несколько полезных ему белков. В частности, вирусу папилломы нужен белок L1, который идет на строительство оболочки новых вирусных частиц, а также белки Е6 и Е7 — они делают зараженную клетку бессмертной, это онкогенные белки.

Бороться с вирусом можно несколькими принципиально разными способами. Первый — запретить ему связываться с клетками-мишенями, второй — не дать ему в них размножаться, третий — уничтожать больные клетки вместе с вирусом. Поскольку в случае с вирусом папилломы больные клетки не содержат его в традиционном понимании — ведь после попадания в клетку от него остается одна ДНК, которая и задает синтез тех самых опасных белков, — запретить размножение нельзя. Поэтому в руках медиков остаются первый и третий способы, то есть профилактическая вакцина и терапевтическая. Недавно появился еще один — применение коротких, так называемых молчащих РНК, которые принуждают замолкнуть вирусные гены. Но движение по этому пути еще в самом начале.

Ситуация осложняется тем, что у каждого вида млекопитающих имеются свои вирусы папилломы, которые не живут в тканях других видов, а в культуре клеток вирус человека размножается чрезвычайно неохотно. В результате поиск вакцины приходится вести на мышах, а потом надеяться, что эти результаты удастся воспроизвести при испытаниях с участием добровольцев.

Большим успехом в борьбе с вирусом папилломы оказалось открытие в 1991 году интересного феномена, сделанное Чжоу Цзянем и Яном Фрэйзером, работавшими в брисбенском госпитале им. принцессы Александры, Австралия (Яна Фрэйзера в ноябре 2008 года наградили за эту работу итало-швейцарской премией фонда Бальцана в размере 1 млн швейцарских франков. — Примеч. ред.). Они обнаружили, что белки L1 самопроизвольно собираются в вирусоподобные частицы (ВПЧ) даже если внутри них нет никакого генетического материала. Такие белки очень просто и в больших количествах можно синтезировать с помощью дрожжей, встроив в них нужный ген. Из дрожжей они выходят уже в виде готовых частиц, причем их иммунногенные свойства такие же, как и у настоящего вируса. Если ВПЧ ввести в организм, то в нем начнут вырабатываться защитные антитела. Во многих экспериментах такая защита доказала свою надежность, и спустя одиннадцать лет после открытия большой эксперимент с участием 1533 добровольцев показал, что подобная вакцина от вируса папилломы человека подтипа 16 (HPV16), во-первых, вполне безопасна, а во-вторых, обеспечивает полную защиту организма. Этот результат важен еще потому, что именно на подтипы 16 вместе с 18, 31 и 45 приходится 80% всех случаев опухолевого перерождения пораженной вирусом ткани, прежде всего рака шейки матки. За оставшиеся 20% ответственны еще 13 разновидностей этого вируса. За шесть лет, прошедшие с начала эксперимента с участием добровольцев, действие вакцины не ослабло — ни одного случая заражения вирусом среди них зафиксировано не было.

Однако это все — профилактические вакцины, причем пока неизвестно, сколь быстро иммунная система забудет о той информации, которую она получила в момент прививки. Поэтому огромный интерес вызывает терапевтическая вакцина, которая уничтожает уже зараженные клетки.

Для ее создания иммунологи надеются использовать столь яркий след вируса, как те самые два белка, Е6 и Е7. Они обязательно должны быть на поверхности заболевших клеток, и, стало быть, задача состоит в том, чтобы научить клетки-киллеры находить эти следы.

Многие лаборатории в мире соревнуются на этом поприще, ведь цена победы очень велика. Для возбуждения иммунного ответа применяют и сами Е-белки, и их пептидные фрагменты (Т-эпитопы), и химерные конструкции из Е- и L-белков. (Напомним, что вещества, которые возбуждают иммунный ответ, называются антигенами.) Для усиления ответа в вакцину добавляют цитокины, белки теплового шока и другие стимулирующие элементы.

Непременный компонент вакцины — вектор, который обеспечивают доставку антигенов — Е-белков или их пептидных фрагментов — в специальные клетки иммунной системы (макрофаги, дендритные клетки), после чего те начинают вырабатывать особые белки цитокины и давать инструкции клеткам-киллерам, что им, собственно, надо уничтожать. Векторами для антигенов папилломавируса в разных опытах служили вирус осповакцины, аденовирус, альфавирус, бактерии. Надо отметить, что дендритные клетки — самые активные партнеры для возбуждения сильного иммунного ответа, поэтому желательно, чтобы антигены попадали именно в них.

Вот почему большое внимание уделяют химерным конструкциям на основе белков теплового шока, то есть содержащим и Е-белок, и белок-усилитель иммунного ответа. Белок теплового шока имеет сродство к дендритным клеткам. Именно таким методом в модельных экспериментах удалось уже при однократной иммунизации зафиксировать уменьшение размера опухоли. Сейчас несколько кандидатов в терапевтические вакцины находятся на различных проверочных стадиях, но в отличие от профилактических вакцин пока ни одна из них не дала приемлемой эффективности. Возникает мысль, что успеха можно достичь, совершенствуя все части вакцины: пептидные фрагменты, которые наиболее правильно повторяют Т-эпитопы Е-белка, вектор для направленной доставки вакцины в дендритную клетку, стимулятор иммунного ответа, а также носитель вакцины, на котором все это держится.

Параллельно в ГОСНИИГенетики был налажен синтез в дрожжах белков L1 трех типов (с одним из них была проблема), который собирался в правильные вирусоподобные частицы и правильно реагировал с антипептидными антителами и референс-моноклональными антителами.

Ответы на разные пептиды сильно отличались, и эти эксперименты позволили выявить наиболее эффективные фрагменты как белка L1, так и Е7. Окончательная проверка показала, что если в качестве носителя-адъюванта к этим пептидам использовать гемоцианин улитки или специальный иммуностимулятор ПМ, то реакция иммунной системы будет наиболее сильной. Самое главное, что при этом вырабатывается сильный иммунный ответ к L1, а также активируются популяции специфических клеток-киллеров, так называемые цитотоксические Т-клетки CD8 + . Именно они должны уничтожать зараженные клетки. Фактически, полученные данные дают основание считать, что нам удалось создать отдельные компоненты прототипа комбинированной вакцины, профилактической и терапевтической. Пока это еще не вакцина, препарат надо испытывать на приемлемой биологической модели, например на мышах с перевиваемой опухолью, вызываемой онкогенным белком Е7. Причем полученные вакцинные препараты скорее ориентированы на профилактику, поскольку уже доказано, что белок L1 генерирует сильный защитный ответ даже в отсутствие адъюванта.

Пептиды — слабые иммуногены, в этом мы убедились, сделав конъюгат одного пептида из белка Е7 со стандартным адъювантом Фрейнда. Активировать Т-клетки таким путем непросто, и, вероятно, нужно менять тактику. Прежде всего для этого требуется обеспечить целевую доставку пептидных антигенов из Е-белка в дендритные клетки, чтобы достичь специфической и сильной активации киллерных CD8 + лимфоцитов.

И тогда мы решили применить новый подход: использовать как усилитель доставки фуллерены, высокая клеточно-проникающая способность которых хорошо известна, и добавить вектор, который бы направлял их в дендритные клетки. Для этого пришлось заняться работой, не имеющей прямого отношения к созданию вакцины: определить иммуногенность фуллерена и их производных с аминокислотами и пептидами, а также их способность проникать внутрь клеток. И здесь мы получили очень интересные результаты.

Проблема токсичности фуллеренов и прочих наночастиц давно уже стала весьма актуальной. Сразу же за открытием фуллеренов среди ученых распространилась идея, что эти молекулы могут пригодиться в качестве средства для транспортировки лекарственных препаратов. Сейчас синтезированы сотни соединений фуллеренов, многие из них проявляют биологическую активность, однако до создания коммерческих препаратов дело не дошло. Возможно, потому, что у них нет особых преимуществ по сравнению с нефуллереновыми аналогами, а возможно — из-за недостаточно глубокого понимания механизмов метаболизма фуллеренов и их взаимодействия с живыми клетками.

Однако из-за развития нанотехнологий практически неизбежно возникают условия для загрязнения окружающей среды этими весьма стойкими соединениями, масштаб производства которых возрастает. Пора решать вопрос об опасности или безопасности фуллеренов в том числе и об иммунологической безопасности. Прежде всего речь идет о способности фуллеренов вызывать иммунный ответ, например аллергию.

В своих опытах мы использовали кристаллический фуллерен, называемый фуллеритом, наносуспензию гидратированого фуллерена Андриевского, а также соединения фуллерена со всевозможными аминокислотами, пептидами и белками. При этом аминокислоты присоединялись непосредственно к шарику фуллерена. Способ получения таких производных разработали еще в 1994 году в ИНЭОС РАН им. А. Н. Несмеянова. Там же в содружестве с Институтом проблем химической физики РАН был создан еще один функциональный фуллерен, который очень быстро пришивается к пептидам и белкам, содержащим аминокислоту цистеин. Для чего нужно было получать столь сложные соединения?

Дело в том, что еще 12 лет назад мы уже пытались вызвать у мышей специфический иммунный ответ на чистые фуллерены и их аминокислотные производные и нисколько не преуспели в этом деле. Однако в 1998 году появились сведения, что одной американской группе удалось-таки добиться иммунного ответа на фуллерен в присутствии сильного иммуностимулятора. В своих опытах мы как раз и хотели проверить этот результат, а в качестве иммуностимуляторов взяли известные аллергены вроде яичного и сывороточного альбумина. Однако результат оказался тем же: никакого специфического ответа на собственно фуллерен замечено не было. Зато мы обнаружили хорошо выраженную реакцию на аминокислоты, пришитые к фуллерену. (На чистые аминокислоты ответ вообще не развивается, организм к ним толерантен.)

Отсутствие иммунной реакции на фуллерен можно объяснить следующим образом. Теоретически в водной среде молекулы гидрофобного фуллерена не могут существовать в одиночном состоянии, а собираются в кластеры из десятков, а то и сотен молекул. Попав в живой организм, эти кластеры должны взаимодействовать с гидрофобными компонентами среды и электронодонорными молекулами — белками, жирами или аминами. В результате углеродная сфера может быть полностью закрыта этими молекулами, и тогда она не способна связываться с рецептором В-лимфоцита, который дает сигнал на развитие иммунного ответа. Впрочем, само по себе наличие у В-клеток специфического рецептора на фуллерен вызывает серьезные сомнения. Фуллерены как искусственные молекулы получены совсем недавно, в 1991 году, и в процессе эволюции организмы с ним не могли контактировать, следовательно, вряд ли существуют клеточные клоны, распознающие такие молекулы. Как показали работы по созданию углеродных эндопротезов еще в 1979 году, антитела к другим формам углерода — графиту и алмазу получить невозможно. Хотя известен такой фермент, как протеаза ВИЧ, чей активный центр имеет гидрофобную полость: фуллерен (с гидрофильной подвеской) хорошо ее заполняет и тем самым блокирует активность вируса. Но рецепторы на В-лимфоците для улавливания чужеземцев располагаются снаружи, то есть обращены в водную среду, имеют гидрофильную природу и вряд ли будут захватывать фуллерен.

Если фуллерен не вызывает иммунного ответа, то может ли он как-то повредить клетку? Ответ на этот вопрос дает серия опытов, проведенная нами с эритроцитами, тромбоцитами человека и симбиосомами — продуктами симбиоза бобовых растений с азотфиксирующими бактериями рода Rhizobium. О том, что фуллерен проник внутрь симбиосомы можно судить по заряду ее мембраны. В присутствии АТФ и ионов магния она способны генерировать на внутренней стороне своей мембраны положительный заряд. Фуллерены с пришитыми аминокислотами пролином или аминокапоновой кислотой — отрицательно заряжены. Попав внутрь симбиосомы, они нейтрализуют заряд на мембране, что можно зафиксировать спектральными методами, используя специальные зонды. Как оказалось, процесс этот весьма быстрый: при добавлении раствора с производными фуллерена, мембрана клетки моментально теряла накопленный ею потенциал.

Фуллерен с другой кислотой, аргинином, наоборот, приобретает положительный заряд, и поэтому его влияние на симбиосому заметить не удалось. Зато оно проявилось на эритроцитах, мембрану которых заряжали отрицательно с помощью валиномицина (из клетки при этом выходит K + ): при добавлении C₆₀-Arg происходила быстрая разрядка потенциала.

Изменение потенциала мембраны оказалось не единственным эффектом. Есть такой флуоресцентный краситель — акридин оранжевый. Он меняет свое свечение при изменении кислотности среды. С его помощью удалось дополнительно подтвердить, что аминокислотные производные фуллеренов в самом деле легко проникают внутрь клеток и меняют кислотность среды.

Мы подтвердили также, что фуллерены легко проникают в разные типы клеток. Например, в тромбоцитах много кальция, поэтому изучать транспорт фуллерена можно с помощью другого красителя, хлортетрациклина, свечение которого зависит от концентрации ионов кальция: если фуллерен с ним взаимодействует, то гасит это свечение. Так оно и вышло: при добавлении к тромбоцитам, нагруженным хлортетрациклином, фуллеренов, в том числе и фуллерена Андриевского, наблюдалось тушение флуоресценции. Правда, оказалось, что фуллерен Андриевского входит в клетку в сто раз медленнее, чем с аминокислотными производными.

Итак, установлено, что фуллерен благодаря своей гидрофобности достаточно свободно проходит сквозь липидную мембрану клетки. Отсюда появляется идея, которая уже у многих на слуху: фуллерен с закрепленным пептидом может протащить его внутрь клетки. А это значит: он может служить отличным средством доставки пептидов в дендритные клетки иммунной системы.

Чтобы проверить этот предположение, мы, во-первых, присоединили к фуллерену найденные на предыдущем этапе пептиды белка Е7, вызывающие наибольший иммунный ответ. Во-вторых, синтезировали носитель для вакцины на основе сополимера винилпирролидона и малеинового ангидрида, к которому были присоединены цепочки жирных кислот. К этим гидрофобным хвостам за счет ван-дер-ваальсовых связей и цеплялись молекулы фуллеренов с пептидами. Результат оказался очень неплохим уже в первом эксперименте. Препарат действительно вел себя, как и положено терапевтической вакцине, генерировал специфические Т-клетки и антитела. Но пока что нам не удалось детально проследить механизм его действия. К сожалению, из-за прекращения финансирования эту работу пришлось прервать. Хотя мы и не теряем надежды на продолжение, но время упущено, а зарубежные исследователи не стоят на месте.

Работа начата по инициативе
академика РАН Р. В. Петрова

Читайте также: