Пцр диагностика инфекций алматы

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций и заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
термостабильная ДНК-полимераза;
дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК – рибонуклеиновая кислота - биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев - нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды - основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) - гуанин, цитозиновый (C) - цитозин, тиминовый (Т) - тимин, урациловый (U) - урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов - A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа - A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК - рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

В конце декабря 2019 года в китайском городе Ухань провинции Хубэй произошла вспышка пневмонии, вызванная новым видом коронавируса. Вирусная инфекция начала быстро распространяться в приграничных странах, а позже и в СНГ, и в Европе. Многие государства закрыли транспортное сообщение с Китаем, в том числе и Казахстан. Эвакуированных из Китая граждан помещают на 14-дневный карантин.

Корреспондент Informburo.kz поговорил с эвакуированной из Пекина казахстанкой, обратился в поликлинику с просьбой пройти тест на коронавирус, а также побывал в аэропорту и на вокзалах столицы.

Эвакуированные из Китая: "Нас не выпускают даже из комнаты"

Казахстанская студентка из Китая, которая на момент интервью находилась на карантине в больнице в 7 км от Нур-Султана, анонимно рассказала Informburo.kz об эвакуации.

10 февраля её с другими казахстанцами эвакуировали из Пекина. Всего на борту было 217 человек из 32 городов КНР. Это не только студенты, но и те, кто работал в Китае.

"Когда мы прилетели, нас не выпускали из самолёта час-полтора. В нём нам дезинфицировали руки. Потом мы заполнили анкету, сдали паспорта. За нами приехали несколько автобусов, машины скорой помощи, полиции. Перед тем как разместить по автобусам, нас покормили. В автобусах мы тоже долго ждали, потом ехали долго. Больница эта далеко от столицы, полностью изолирована", – рассказала девушка.

Эвакуированные должны были находиться на карантине три дня.

Эвакуированные сдали всю одежду, взамен им выдали новую пижаму. Всех расселили по три человека в палатах с железными двойными дверями. Выходить из комнаты было запрещено, как и открывать двери и окна. Каждому выдали пятилитровую бутылку воды, гигиенические принадлежности, тапочки, постельное бельё. В каждой комнате есть санузел и душевая.

"Комнаты белые, ощущение будто находишься в психушке, устрашают железные двери, но да ладно. Здесь постоянно дезинфицируют, чисто. Сначала температуру проверили, брали кровь, мазок из рта и носа. Люди, которые здесь работают, не ели со вчерашнего дня, потому что эвакуированных очень много. И они всех проверяют постоянно, уставшие ходят", – продолжает казахстанка.

По её словам, кормили на карантине хорошо.

"Студенты очень благодарны, что эвакуировали, ещё и бесплатно за счёт государства. Многие страны не согласились эвакуировать своих граждан. Им пришлось самим добираться домой. А нам все процедуры делают и кормят хорошо", – заключила она.

Сдать тест на коронавирус по желанию не получится

Диагностику тестов на коронавирус проводят только в референс-лаборатории Национального научного центра особо опасных инфекций в Алматы.

"Материалом для проведения анализов служат отделяемое верхних дыхательных путей, мокроты, при наличии симптомов кашля – отделяемое бронхов, также производится забор сыворотки крови. При лабораторном тестировании эксперты определяют РНК коронавируса, что позволяет подтвердить заболевание коронавирусной инфекцией", – писал в Facebook министр здравоохранения Елжан Биртанов.

Он добавил, что пока эффективных экспресс-тестов нет нигде в мире.

"Есть ПЦР-диагностика, она разработана разными странами в течение последних недель на основе инструкции ВОЗ. Вирус новый, на него практически нет промышленного производства тестов. Но главное – у нас есть теперь свои тесты. Они показаны только при болезни и подозрении на коронавирус. Если вы себя плохо чувствуете, обратитесь к врачу. Если будет подозрение на грипп или коронавирусную инфекцию – у вас возьмут диагностический тест на 10 различных штаммов вирусов, включая коронавирус", – написал он в Facebook.

Жительница Шымкента Айгуль Орынбек, прилетевшая из Китая, сдала тест на коронавирус. Результат был готов почти через неделю, написала она в Facebook .

"У меня не было признаков болезни, но, чтобы никому не навредить, на всякий случай я решила сдать анализ. Врачи говорили, что результат будет готов через день. За это время больной человек может умереть, ожидая результаты", – написала Айгуль Орынбек.

Корреспондент Informburo.kz в качестве эксперимента тоже обратилась в поликлинику по месту прикрепления с жалобой на общее недомогание, температуру и кашель. По телефону записали на приём к врачу почти через неделю.

В назначенный день в кабинете участкового терапевта измерили давление, проверили температуру, послушали дыхание, осмотрели горло. При этом в реальности никаких недомоганий не было, но тем не менее температура оказалась повышенной – 37,6 градуса.

Терапевт, услышав о желании сдать анализ на коронавирус, насторожился и тут же протянул медицинскую маску. Спросил, были ли поездки в Китай, как давно появились симптомы, состою ли на учёте и т.д. После поставил диагноз "острая инфекция верхних дыхательных путей".

Велели сдать анализы. Спустя три дня рекомендовали прийти на повторный приём и получить направление на флюорографию. Выписали лекарства до получения результатов анализов, среди назначенных были антибиотики.

Направление на сдачу теста на коронавирус не выписали, объяснив это тем, что симптомов болезни нет.

В Министерстве здравоохранения позже пояснили, что тест на коронавирус назначают при показаниях. По желанию пациента сдать анализы нельзя. Даже в частных лабораториях, потому что у них нет экспресс-тестов. Диагностика одного человека на коронавирус обходится бюджету в 10-14 тысяч тенге.

Могут ли маски защитить от коронавируса

В Минздраве сообщили, что защитные свойства медицинских масок различаются по видам изделия. Обычно врачи используют защитные маски и респираторы медицинского применения.

"Наиболее простой метод защиты органов дыхания от вирусных инфекций – четырёхслойные марлевые маски. Аналогичной степенью защиты обладают вискозные и нетканые маски, которые также надёжно защищают от вирусных инфекций. Эти маски зарегистрированы и сертифицированы. Их общее условие применения – необходимость смены каждые два-три часа", – рассказала руководитель департамента контроля качества и безопасности товаров и услуг Алматы Айзат Молдагасимова.

Медицинские маски высокой степени защиты (95% и более) – это респираторы, предназначенные для тесного и длительного контакта с больными вирусными инфекциями, в том числе туберкулёзом. В лабораториях при работе с возбудителями особо опасных инфекций используют респираторы со стопроцентной степенью защиты.

На высокий спрос защитных средств отреагировал рынок. В аптеках Алматы появились дезинфицирующие средства, которые советуют носить на шее, как бэйджи.

Многие родители покупают их детям в школу, несмотря на стойкий запах хлорки.

"Эта продукция как медицинское изделие в Казахстане не зарегистрирована и не внесена в реестр зарегистрированных лекарственных средств и медицинских изделий, также отсутствует в перечне зарегистрированных дезинфицирующих средств. Судя по описанию на торговой упаковке, изделие является дезинфицирующим средством с содержанием хлора, используемым в бытовых условиях", – проинформировала Айзат Молдагасимова.

Путаница с информацией о финансировании

На борьбу с коронавирусом из резерва Правительства выделили несколько миллиардов тенге.

"Глава Правительства дал поручение приобрести дополнительные средства защиты – маски и нужные предметы. Подписал постановление. Дополнительно 1,5 млрд тенге из резерва Правительства выделено. Если населению в случае заболевания потребуется медпомощь, у нас все возможности есть – и средства, и деньги", – сообщил 30 января тогда вице-премьер и глава междведомственной комиссии по борьбе с коронавирусом Бердыбек Сапарбаев (сейчас он возглавляет Жамбылскую область).

5 февраля в кулуарах Мажилиса министр финансов Алихан Смаилов сообщил , что на борьбу с коронавирусом выделили 3,5 млрд тенге.

Но цифра оказалась неверной. Как уточнили в Минздраве корреспонденту Informburo.kz, на мероприятия по борьбе с проникновением коронавируса выделили в общем 2 млрд тенге.

Однако на что именно потратят эти деньги в Минздраве говорить отказались. Ведомство отнесло это к информации с ограниченным доступом для служебного пользования.

"В соответствии с подпунктом 3 пункта 2 статьи 18-1 Закона Республики Казахстан от 23 июля 1999 года № 451-I "О средствах массовой информации" запрашиваемая Вами информация относится к информации с ограниченным доступом". В связи с этим, предоставить ответы на Ваши вопросы не представляется возможным", – написали в ответе Минздрава.

В этом подпункте статьи закона говорится о том, что в предоставлении информации по запросу отказывается, если "запрашиваемая информация относится к информации с ограниченным доступом".

Как встречают пассажиров международных рейсов в аэропорту Нурсултан Назарбаев

Со вспышкой коронавируса во всех аэропортах Казахстана ввели усиленный контроль. Проверяют всех пассажиров, которые прилетели из других стран.

В Международном аэропорту Нурсултан Назарбаев измеряют температуру прибывших ручными тепловизорами, проводят опрос и анкетирование прямо на борту. В здании дополнительно установлены стационарные тепловизоры – специальные камеры, которые передают информацию о температуре тела проходящего человека на компьютер.

В обычные дни используют только стационарные тепловизоры. Но во время вспышки коронавируса аэропорт увеличил количество сотрудников, которые обслуживают авиарейсы и проверяют пассажиров ручными тепловизорами.

"Мы поднимаемся на борт, каждого пассажира анкетируем и замеряем температуру. Если условия не позволяют, тогда мы стоим у выхода самолёта и каждого ручным тепловизором просматриваем. Анкетирование проводим для установления паспортных данных и адреса дальнейшего пребывания пассажира", – рассказал руководитель департамента контроля качества безопасности товаров и услуг на транспорте Ермек Токбергенов.

Если на борту пассажир с температурой, его направляют в медпункт аэропорта.

Мы поговорили с пассажирами, которые прилетели из Омска. Они подтвердили, что на борту их проверяли медики.

"То, что вы спрашиваете у людей, это правильно. Потому что многие блогеры считают, что у нас никто ничего не проверяет и ничего не делает. Такие проверки мы проводим на международных рейсах, на внутренних рейсах в этом необходимости нет", – сказал Ермек Токбергенов.

На прибывшем борту из Омска оказался мужчина с температурой 38,4. Его поместили в изолятор и вызвали дежурного врача аэропорта.

"Пассажир транзитом летит в Баку. У него в течение месяца высокая температура, хроническое заболевание почек. Сейчас приедет скорая помощь, потом решится вопрос. Без осмотра врача мы не можем его отпустить. Если у него будет подозрение на инфекционное заболевание, невзирая на то, что у него транзитный билет, скорая заберёт его в больницу", – пояснила главный специалист департамента контроля качества и безопасности товаров и услуг на транспорте Айжан Муслимова.

Бывает, что на борту встречаются два-три пассажира с температурой, иногда – ни одного. Если врачи решают госпитализировать больного, в больнице проводят экспресс-тест на коронавирус.

Когда прибывали рейсы из Китая, инфекционисты проводили экспресс-тесты в аэропорту. ПЦР-лаборатория в течение нескольких часов выдавала результат. Сейчас воздушное сообщение с КНР закрыто. В январе, когда ещё не было запрета, на рейсах из Китая выявили более 20 температурящих, всех госпитализировали. Коронавирус не подтвердился ни у одного из них.

"Причиной температуры могут быть симптомы гриппа, простуды. Инфекционисты ставят предварительный диагноз. Сотрудники аэропорта при анкетировании собирают данные пассажиров с недомоганиями и передают их в управления здравоохранения. Те в течение 14 дней должны наблюдать за ними, узнавать о самочувствии", – добавляет руководитель санитарно-карантинного контроля Дария Азимбаева.

Сотрудникам аэропорта, обслуживающим международные рейсы, рекомендуют носить медицинские маски.

Как встречают пассажиров на вокзалах

На вокзале "Нурлы жол" в Нур-Султане тоже усилили санитарно-карантинный контроль.

Между Казахстаном и Китаем курсировало два поезда из Урумчи. Один следовал на алматинский вокзал, второй – на столичный "Нурлы жол". С 1 февраля приостановили движение этих поездов.

"Для недопущения вируса на территорию страны пассажиров и работников поездов по прибытии на станции "Достык" и "Алтынколь" (граничащие с Китаем. – Авт.) проверяют работники санитарно-эпидемиологических служб. Они проводят замеры температуры и опрос их самочувствия. После проверки проводится пограничный и таможенный досмотр", – сообщили в нацкомпании "Казахстан темир жолы".

Круглосуточно на вокзале работает медпункт. Дежурный фельдшер вокзала "Нурлы жол" Римма Сапарагали рассказала, что в медпункт в среднем обращаются 5-7 человек в сутки. В основном люди жалуются на проблемы с давлением, простуду, гайморит, механические травмы.

"По респираторным заболеваниям обращений почти нет. Симптомов коронавируса ни у кого не было", – сказала медик.

В сутки на вокзал "Нурлы жол" приезжают около 14 тысяч человек.

На старом вокзале Нур-Султана аналогичная ситуация.

"Работники вокзала обеспечены марлевыми повязками. До всех доведена информация о симптомах коронавируса: о том, что нельзя заниматься самолечением, обязательно обращаться в медучреждения, вызывать скорую помощь либо идти на приём к терапевту", – рассказала техник Оксана Джигарина.

На мониторах крутят ролики о коронавирусе. На столах справочного бюро – брошюры о заболевании, в аптечках каждого служебного помещения – памятка о болезни, её симптомах и способах защиты.

"Если поступает информация о том, что в поезде следует пассажир с повышенной температурой, лихорадкой, ставят в известность работника медпункта и вызывают скорую помощь. Врачей допускают на перрон, они оценивают состояние пассажира и действуют по ситуации", – добавила женщина.

Пока пассажиров с подозрением на коронавирус не было. Но если в поезде ехал человек с симптомами обычной вирусной инфекции, то вагон отправляют в тупик на санобработку.

Следите за самыми актуальными новостями в нашем Telegram-канале и на странице в Facebook

Присоединяйтесь к нашему сообществу в Instagram

Если вы нашли ошибку в тексте, выделите ее мышью и нажмите Ctrl+Enter

УДК: 616-078:577.2

А.Ш.Орадова

Казахский Национальный медицинский университет им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы.

Современная медицина успешно использует достижения естественных наук, интенсивно применяет новые технологии для диагностики и лечения заболеваний. В последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий.

Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, лабораторная диагностика.

Рисунок 1 — Механизм полимеразной цепной реакции: основные этапы цикла ПЦР и процесс многократного копирования ДНК-мишени в ходе последовательно сменяющихся циклов

Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси (рис. 1). Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле, то есть растет с числом циклов экспоненциально.

Усовершенствование технологии ПЦР

Первоначально для осуществления ПЦР использовали обычные ДНК-полимеразы, которые подвергались температурной инактивации в каждом цикле на этапе денатурации ДНК. Полимеразу приходилось многократно добавлять в реакционную смесь, что было довольно трудоемко и не позволяло автоматизировать процесс.

В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термостабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойствами, достаточно велико. Наиболее часто используется Taq-полимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus. Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают, как правило, стабильную воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике.

Для осуществления ПЦР в основном используются приборы (термоциклеры), которые изменяют температуру автоматически на основе заданной программы.

Таким образом, стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1 – 3 ч. Многие приборы позволяют программировать специальные усложненные температурные профили, необходимые для специфических модификаций процесса ПЦР.

Параллельно с усовершенствованием технологии ПЦР развивались и методы анализа продуктов реакции. Метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем, специфичным к ДНК, например бромистым этидием, традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера.

Использование ПЦР в медицинской микробиологии

Среди множества различных направлений клинической диагностики медицинская микробиология занимает, пожалуй, лидирующее место по количеству и разнообразию приложений, использующих технологию ПЦР. Внедрение в практику этого метода наряду с серологической диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или в культуре клеток.

Использование ПЦР для прямой диагностики и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний

В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах [2,3]. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления C. trachomatis.

Имеется также возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей. Такая модификация получила название множественной ПЦР (multiplex PCR).

Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. Так, например, описаны варианты применения множественной ПЦР для одновременного обнаружения двух (C. trachomatis и N. gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта [5]) или даже четырех возбудителей (H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis и A. otitidis при хроническом гнойном отите [10]).

Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с помощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших систематических групп (рода, семейства) [11], так и крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S рРНК), которые имеют сходную структуру у различных прокариотических микроорганизмов.

Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих описанный принцип идентификации, на практике обычно используются менее трудоемкие и дорогостоящие методы, которые тем не менее позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК-фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами – метод ПДРФ (RFLP) – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, или на определении электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод SSCP – одноцепочечный конформационный полиморфизм) [12].

Использование ПЦР для выявления лекарственной устойчивости у микроорганизмов

В последнее время ПЦР все чаще используется для исследования различных свойств патогенных микроорганизмов, в частности для выявления устойчивости отдельных видов возбудителей к определенным лекарственным препаратам. Как правило, использование ПЦР для определения чувствительности микроорганизмов является целесообразным лишь в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам с помощью культуральных методов занимает обычно от 4 до 8 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов в подобных случаях могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов.

Исследование молекулярных механизмов лекарственной устойчивости M. tuberculosis и некоторых других возбудителей позволило разработать методы на основе ПЦР для быстрого выявления генетических маркеров резистентности.

Для подобного анализа обычно используется ДНК или РНК возбудителя, выделенного в чистой культуре. Однако в некоторых случаях имеется возможность прямого ПЦР-анализа на антибиотикорезистентность без предварительно культивирования возбудителя. Исследуемый образец клинического материала при этом используется как источник ДНК-мишени для ПЦР, а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу с целью выявления мутаций, связанных с антибиотикорезистентностью. Разработан, например, метод, позволяющий с помощью ПЦР обнаружить у пациентов, страдающих туберкулезным менингитом, устойчивость возбудителя к рифампицину.

Существуют, однако, естественные ограничения для использования генетических методов оценки лекарственной устойчивости микроорганизмов:

Ø данные о конкретных генетических механизмах резистентности могут отсутствовать;
Ø резистентность к определенным препаратам часто бывает связана с различными механизмами и мутациями в различных генах, которые независимо влияют на фенотип.

Кроме того, отсутствие международных стандартов и рекомендаций по использованию ПЦР для определения чувствительности к антимикробным препаратам является дополнительным фактором, ограничивающим возможность широкого применения этого подхода в практической диагностике.

Преимущества и недостатки метода ПЦР

О многих преимуществах использования ПЦР по сравнению с традиционными микробиологическими методами уже изложено. Такие свойства ПЦР, как скорость и высокая производительность (то есть возможность параллельного анализа большого количества образцов), являются бесспорными преимуществами данного метода. Стандартные процедуры выделения микробной ДНК из клинического материала или чистой культуры и последующей ПЦР-амплификации обычно требуют для своего завершения не более нескольких часов. Продукты ПЦР могут быть идентифицированы с помощью простых методов (гель-электрофорез, гибридизация) приблизительно за то же время.

Преимущество ПЦР в скорости по сравнению с культуральными методами особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов. Однако даже в случае быстрорастущих культур оперативность ПЦР может быть полезной. Например, выделение, идентификация и определение лекарственной устойчивости у штаммов метициллинорезистентного золотистого стафилококка (MRSA) с помощью традиционных микробиологических методов требуют не менее 3 – 5 дней, в то время как ПЦР-анализ позволяет выявить MRSA менее чем за сутки.

Помимо высокой оперативности и специфичности ПЦР отличается чрезвычайно высокой чувствительностью. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК(РНК)-последовательности в исследуемом материале. Если в качестве мишени для ПЦР используется фрагмент ДНК, представленный большим количеством копий в геноме возбудителя (например, гены 16S рРНК у многих видов бактерий), то ПЦР позволяет обнаружить менее одного микроорганизма в образце (то есть фрагмент ДНК из лизированной микробной клетки).

Следовательно, чувствительность порядка 0,5–1 микроорганизма на пробу вполне реальна для ПЦР, что позволяет использовать ее даже в тех случаях, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного титра (например, при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций).

В то же время экстремальная чувствительность ПЦР требует новых подходов к клинической интерпретации результатов, получаемых в лаборатории. В частности, выявление в клинических образцах сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента. По этой же причине следует с осторожностью использовать ПЦР для анализа образцов с характерным полимикробным сообществом (кал и материал, полученный из верхних дыхательных путей и гениталий).

Экстремальная чувствительность реакции ферментативной амплификации ДНК является одновременно ахиллесовой пятой технологии ПЦР. Этот парадокс известен также как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению (контаминированию) посторонними молекулами ДНК, которые могут служить мишенью для используемого набора праймеров [6]. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК-продукта, а, следовательно, к ложноположительному результату.

В связи с опасностью получения ложноположительных результатов в лабораториях, постоянно использующих ПЦР в диагностических целях, необходимы соблюдение строгих требований и специальные подходы, направленные на снижение риска ПЦР-загрязнения.

Дополнительные меры, обеспечивающие защиту ПЦР от загрязнения, могут включать использование ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей, специальные биохимические (урацилгликозилаза) и физико-химические (УФ излучение + изопсорален) методы инактивации ПЦР-продуктов. Особенно важно для оценки достоверности данных ПЦР-анализа и отсутствия ложноположительных результатов регулярное исследование отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами.

Помимо опасности получения ложноположительных результатов существует и обратная проблема, связанная со снижением чувствительности ПЦР, следствием которого являются ложноотрицательные результаты. На практике вопрос о соотношении теоретической (то есть максимально возможной) и реальной чувствительности ПЦР не всегда решается однозначно. Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин, наиболее важной из которых является ингибирование реакции компонентами биологических образцов.

Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в образцах крови (гемоглобин), мокроты, мочи, биопсийном материале. Различные вещества, например часто используемые антикоагулянты (особенно гепарин) или компоненты кровяных питательных сред, могут также подавлять реакцию амплификации ДНК. Ингибирование ПЦР обычно можно выявить путем искусственного добавления ДНК-мишени к исследуемому образцу и ее последующей амплификации. Отрицательный результат, полученный с заведомо положительным контролем, может говорить о наличии ингибиторов, для устранения которых необходимо использовать разведение образца или специальные методы подготовки проб.

Серьезную проблему представляет также выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию с помощью ПЦР. В настоящее время не существует универсальных подходов к выделению ДНК разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие возможность автоматизации, иногда не позволяют достичь требуемого уровня чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать микробную ДНК для ПЦР-анализа, оказываются трудоемкими и могут увеличивать риск контаминирования образцов.

Наконец, ПЦР является дорогостоящей. Для ее реализации необходимо комплексное оснащение лаборатории, включая не только термоциклер и устройство для ДНК-электрофореза, но и отдельные центрифуги, холодильники, дозаторы и другое оборудование. Затраты на ПЦР включают высокую стоимость реактивов и расходуемых материалов. Поэтому только в случае выявления и исследования труднокультивируемых возбудителей ПЦР может быть сопоставима по стоимости с традиционными микробиологическими методами.

Уже сейчас ПЦР является незаменимым инструментом в диагностике и исследовании многих возбудителей инфекционных болезней, а количество лабораторных исследований с помощью ПЦР продолжает стремительно расти. Дальнейшее развитие и внедрение этого метода в практику клинических диагностических лабораторий может быть связано с совершенствованием и стандартизацией самой технологии, особенно этапов подготовки образцов и анализа продуктов реакции.

1 Ллуэлин М.Б. Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир; 1999. c.428 — 47.

2 Маккреди Б.Дж., Чимера, Д.А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир; 1999. c.496 — 506.

3 Bobo L.D. PCR Detection of Chlamydia trachomatis. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. ASM Press: Washington; 1993. p. 235 — 41.

4 Cockerill III F.R. Genetic Methods for Assessing Antimicrobial Resistance. Antimicrob Agents Chemother 1999;43:199 — 212.

5 Crotchfelt K.A., Welsh L.E., DeBonville D., Rosenstraus M., Quinn T.C. Detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in Genitourinary Specimens from Men and Women by a Coamplification PCR Assay. J Clin Microbiol 1997;35:1536 — 40.

6 Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. Quality Control of Polymerase Chain Reaction. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington: ASM Press; 1993. p.160 — 8.

7 Fatima-Hannachi M., Gascoyne-Binzi D.M., Heritage J., Hawkey P.M. Detection of Mutations Conferring Extended-Spectrum Activity of SHV (-Lactamases using Polymerase Chain Reaction Single Strand Conforma tional Polymorphism (PCR-SSCP). J. Antimicrob Chemother 1996;37:797 — 802.

8 Fredericks D.N., Relman D.A. Application of Polymerase Chain Reaction to the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin Infect Dis 1999;29:457 — 88.

9 Greizen K., Loeffelholz M., Purohit A., Leong D. PCR Primers and Probes for the 16S rRNA Gene of Most Species of Pathogenic Bacteria, Including Bacteria Found in Cerebrospinal Fluid. J Clin Microbiol 1994;32:335 — 51.

10 Hendolin P.H., Markkanen A., Ylikoski J., Wahlfors J.J. Use of Multiplex PCR for Simultaneous Detection of Four Bacterial Species in Middle Ear Effusions. J Clin Microbiol 1997;35:2854 — 8.

11 McDonough M., Kew O., Heirholzer J. PCR Detection of Human Adenoviruses. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington: ASM Press; 1993. p. 389 — 93.

12 Meijer A., Kwakkel G.J., DeVries A., Schouls L.M., Ossewaarde J.M. Species Identification of Chlamydia Isolates by Analysing Restriction Fragment Length Polymorphism of the 16S – 23S rRNA Spacer Region.

А.Ш. Орадова

ПОЛИМЕРАЗДЫ ТІЗБЕТТІҚ РЕАКЦИЯ ЗЕРТХАНАЛЫҚ ДИАГНОСТИКАДА

Түйін: Қазіргі медицина ойдағыдай табиғи ғылымның табыстарын пайдаланады, қарышты жаңа технологияларды диагностика және ауруға шалдығудың шипасы үшін қолданады. В соңғы уақытты инфекцияның ауруға шалдығуының зертханалық диагностикасының дәстүрлі микробиологиялық және иммунологиялық әдістеріне молекулалық-генетикалық технологияның игерушілігінде жаңа, негізде қосыла кетті.

Түйінді сөздер: полимеразды тізбеттіқ реакция, зертханалық диагностика.

A.S.Oradova

POLYMERASE CHAIN REACTION IN LABORATORY DIAGNOSTICS

Resume: The modern medicine successfully uses achievements of natural sciences, intensively applies new technologies to diagnostics and treatment of diseases. Recently to traditional microbiological and immunological methods of laboratory diagnostics of infectious diseases were added new, based on use of molecular and genetic technologies.

Keywords: polymerase chain reaction, laboratory diagnostics

Scientific-Practical Journal of Medicine, "Vestnik KazNMU".

Научные публикации, статьи, доклады, рефераты, диссертации, новости медицины, исследования в области фундаментальной и прикладной медицины, публикации журнала "Вестник КазНМУ" и газеты "Шипагер".

ISSN 2524 - 0692 (online)
ISSN 2524 - 0684 (print)

Читайте также: