Окончательный диагноз на дерматомикозы устанавливают при помощи

Цель занятия: изучить методы диагностики дерматомикозов, систему профилактических и оздоровительных мероприятий.

Материалы и оборудование: пробы для исследования, взятые от животных, больных трихофитией, препаровальные иглы, пинцеты анатомические, чашки Петри, 10…20%-е растворы гидроксида натрия или калия, 50%-й раствор глицерина, предметные и покровные стекла, спиртовки, питательные среды, микроскопы, лампа ПРК-4, вакцины.

Место проведения занятия: аудитория кафедры эпизоотологии.

Дерматомикозы (трихофития, микроспория, фавус) — инфекционные болезни кожи животных и человека, вызываемые грибами-дерматофитами родов Trichophyton, Microsporum,

Методы диагностики. Диагноз на дерматомикозы устанавливают на основании эпизоотологических и клинических данных, а также результатов лабораторных исследований.

Согласно эпизоотологическим данным дерматомикозами болеют сельскохозяйственные и дикие животные всех видов, а также человек. Восприимчивы все возрастные группы, но наиболее — молодняк. Источником возбудителя инфекции служат больные и переболевшие животные. Дерматомикозы встречаются в любое время года, но чаще в осенне-зимний период. При эпизоотологическом обследовании хозяйства особое внимание обращают на условия содержания и кормления животных, степень распространения болезни, характер эпизоотического процесса, возраст и вид пораженных животных. Необходимо отметить, что перемещение и перегруппировки, скученное содержание, плохое кормление нередко приводят к перезаражению животных и массовому распространению дерматомикозов.

Клиническая картина дерматомикозов настолько характерна, что в большинстве случаев можно поставить окончательный диагноз без дополнительных исследований.

При лабораторных исследованиях материалом служат соскобы кожи, волосы, чешуйки, корочки с пораженных или периферических участков кожи, не подвергавшейся лечению.

Для микроскопического исследования патологический материал помещают на часовое стекло или в чашку Петри и заливают 10%-м раствором гидроксида натрия, затем ставят на.15…20 мин в термостат или слегка подогревают, после чего расщепляют препаровальными иглами. Необходимое количество материала переносят на предметное стекло в каплю 50%-го раствора глицерина, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.

Грибы рода Trichophyton при микроскопическом исследовании обнаруживают в виде прямых гифов мицелия с перегородками, лежащими параллельными рядами по длине волоса. Споры одноклеточные, круглые, овальные, расположены муфтами или цепочками у основания волоса.

Грибы рода Microsporum под микроскопом представляют собой круглые одноклеточные, резко преломляющие свет споры, расположенные, как правило, беспорядочно внутри волоса и на его

Грибы рода Achorion обнаруживают в препарате в виде тонкого мицелия, иногда септированного и широкого, состоящего из прямоугольных клеток с двухконтурной оболочкой. Споры округлые или многогранные, располагаются цепочками или группами. Кроме спор в волосе можно увидеть пузырьки воздуха в виде черных длинных тяжей, а также капельки жира.

Для дифференциальной диагностики дерматомикозов широко применяют люминесцентный метод. Он основан на свойстве грибов рода Microsporiim флюоресцировать. При ультрафиолетовом облучении пораженные волосы дают ярко-зеленое свечение. Техника исследования следующая: животное ставят в темное помещение на расстоянии 20 см от лампы ПРК-4 или другого источника со светофильтрами, пропускающими ультрафиолетовое излучение. Исследуют только животных (материал), которых не обрабатывали медикаментами. Пораженные микроспориями волосы дают хорошо видимое свечение, а при поражении трихофитонами свечения не бывает.

При необходимости делают посевы из исходного материала на агар Сабуро, МПА, в сахарный МПБ с антибиотиками и используют биопробу на кроликах, морских свинках или белых мышах.

В дальнейшем изучают морфологию и культуральные свойства выделенных культур. Сроки исследований: микроскопического — 1 день, микологического — 10…20 дней.

Профилактические и оздоровительные мероприятия. Общая профилактика дерматомикозов складывается из следующих мер: соблюдают ветеринарно-санитарные правила на фермах, не допускают контакты животных общественного стада и частных ферм, создают нормальные условия содержания поголовья, обеспечивают его полноценными кормами, проводят регулярную дезинфекцию и дератизацию. Всех животных, восприимчивых к дерматомикозам, тщательно осматривают, вновь поступивших выдерживают 30 дней в карантине. При этом обязательно обрабатывают их кожные покровы 1…2%-ми растворами гидроксида натрия, сульфата меди или другими средствами.

С профилактической целью в ранее неблагополучных по трихофитии хозяйствах в корм добавляют гризеофульвин, серу с метионином.

Для специфической профилактики и лечения дерматомикозов животных различных видов в нашей стране разработан ряд средств:

Кроме того, животных, больных дерматомикозом, лечат с по-

Ветеринарно-санитарные мероприятия выполняют с соблюдением мер личной профилактики, учитывая опасность заражения.

Хозяйство считают благополучным через 2 мес со дня последнего случая выделения животных, клинически больных трихофитией, а при поражении фавусом—через 21 день с момента выздоровления (убоя) больных животных, в том числе птиц, и после заключительной дезинфекции.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Исследовать под микроскопом приготовленные мазки.

2. Освоить технику исследования животных с помощью лампы

3. Рассказать, как диагностируют дерматомикозы.

4. Разработать схему дифференциальной диагностики трихофитии и микроспории.

5. Перечислить меры личной профилактики при работе с заразным материалом.

Роспотребнадзор (стенд)

Симптомы, причины возникновения и лечение дерматомикоза

Появление на теле красноватых окружностей, имеющих выраженный и визуально определимый центр, а также четкие контуры, может свидетельствовать о развитии дерматомикоза. Это грибковое заболевание появляется на теле человека вследствие контакта с другим зараженным человеком или животным.

Дерматомикоз можно лечить только после консультации с врачом, а процесс устранения проблемы должен быть выбран и прописан исходя из симптомов, причин возникновения и особенностей развития заболевания. Такой грибок может появиться на теле любого человека, однако чаще он поражает детскую кожу. Особенно если дети долгое время гуляют на улице, не моют руки, бегают в грязной одежде и контактируют с уличными животными.

Областью распространения дерматомикоза могут быть любые гладкие участки кожи, хотя иногда он появляется на волосистой поверхности тела.

Причины возникновения дерматомикоза . Как таковых причин, которые могли бы вызвать развитие грибка изнутри организма, не выявлено. Основной предпосылкой для возникновения дерматомикоза врачи называют контакт с человеком или животным, который уже заражен. Однако в некоторых случаях грибковое заболевание может появиться на теле после контакта с ковриками в ванной, в общественной душевой, бассейне или сауне, через обувь, расческу и даже полотенца. Грибок живет и сохраняет свою жизнедеятельность на неживых поверхностях до нескольких дней, а во влажной и сырой среде может жить даже дольше. Поэтому дерматомикоз может появиться у человека, который не общался с зараженными людьми. Понять и выявить источник такого грибка сложнее, тем более что проявиться он может спустя 7-10 дней после контакта с зараженной поверхностью. Но важно – вовремя заметить у себя покраснение кожи и обратиться к врачу, чтобы не запускать поиск решения проблемы.

Симптомы дерматомикоза. Грибковое заболевание бывает нескольких видов, которые классифицируют в зависимости от места локализации поражения кожи. Дерматомикоз может распространяться на гладкой поверхности кожи, на волосистой части тела, кроме того различают паховый и ногтевой грибок. Реже возникают дерматомикозы сразу в нескольких областях кожных покровов. Дерматомикоз гладкой кожи сложно не заметить, цвет кожного покрова сильно отличается от нормального, а если не предпринимать ничего по его лечению — будет увеличиваться в размерах. Вне зависимости от места локализации грибкового заболевания, очаги поражения выглядят примерно одинаково и характеризуются следующими особенностями: окружность красного цвета, размер которой зависит от степени запущенности заболевания; зуд и шелушение кожи; в начальной стадии развития грибка место поражения может быть влажным, а из ранки иногда сочится жидкость.

Симптомы заболевания волосистой части тела. Если дерматомикоз развивается на голове, в волосистой части кожных покровов, то кроме покраснения и зуда еще одним симптомом грибка может быть выпадение волос. Хотя голова редко служит местом локализации заболевания, особенно у взрослых, такой вид грибка характерен скорее для детей. Грибковый очаг воспаления сложно не заметить на коротких и тонких детских волосах.

Симптомы ногтевого дерматомикоза. Дерматомикоз ногтей отличается по своим симптомам от других видов заболевания тем, что поражает в основном ногтевую пластину, редко затрагивая кожу. При этом ногти могут менять цвет или искривляться на ранних стадиях развития грибка, а если заболевание запустить, ноготь может быть полностью разрушен под воздействием дерматомикоза. Кроме визуальных изменений на ногтях, будет также ощущаться дискомфорт и даже боль, особенно при обрезании или подпиливании ногтя. Поэтому симптомы ногтевого дерматомикоза сложно не заметить или пропустить.

Лечение заболевания. Любые дерматомикозы должны лечиться под наблюдением и по рекомендации врача, после проведения обследования и диагностики. В процесс диагностики может входить взятие общего анализа крови и соскоб с места размножения грибка, который поможет определить его характер и особенности. Дальнейшее лечение будет проходить одновременно по двум направлениям: внешнее и внутреннее. Внешнее воздействие на грибок может осуществляться при помощи мазей, гелей, шампуней и специальных болтушек, в составе которых должны быть противомикотические компоненты. Это вещества, которые будут воздействовать на грибок, предотвращая его развитие и размножение. Прежде чем начинать их применять, нужно понимать, не возникнет ли аллергическая реакция на то или иное средство, поэтому без предварительных анализов, обследования лечить грибок нельзя.

Хорошим средством, подсушивающим раны и препятствующим разрастанию грибкового пятна, является ежедневное протирание дерматомикоза раствором йода. Однако делать это можно только с разрешения врача, если стадия запущенности раны и ее характер позволяют использовать йод. Средства для внутреннего применения должны помочь организму активизировать силы для борьбы с грибком и предотвращению его распространения на другие участки тела. Любые средства, которыми можно лечить дерматомикоз, должны быть назначены и подобраны дерматологом индивидуально, исходя из особенностей заболевания и организма пациента. Любое самостоятельное вмешательство в развитие грибка может усугубить ситуацию и привести к нежелательным последствиям. Профилактика возникновения грибка

Профилактические меры, помогающие избежать развития дерматомикоза, заключаются в соблюдении правил личной гигиены. Особенно важно соблюдать их детям: не трогать уличных животных, не пользоваться чужими вещами в детском садике или школе, не носить чужую обувь. Еще одним важным правилом, соблюдая которое можно снизить вероятность заражения дерматомикозом, является ношение одежды из натуральных качественных тканей. Правильный поток воздуха между тканью и телом обеспечит нужную вентиляцию, сократив риск возникновения опрелостей или развития грибка. При любом появлении зуда, покраснения или шелушения кожи нужно обязательно проконсультироваться с врачом, чтобы вовремя остановить развитие болезни.

Саркоптоз свиней.

Возбудитель болезни — клещи Sarcoptes suis семейства Sarcoptidae.

Морфофизиологические признаки их соответствуют родовой характеристике саркоптид.

Эпизоотологические данные. Источником инвазии являются свиньи, пораженные клещами. Особенно опасны в этом отношении производители и матки, у которых заболевание протекает обычно без выраженных клинических признаков.

Заражение происходит при прямом контакте здоровых живот­ных с больными, через предметы ухода, одежду обслуживающего персонала и т. п. Механическими переносчиками клещей могут быть крысы и мыши, часто обитающие в свинарниках в больших количествах. Благоприятствуют перезаражению неудовлетвори­тельные условия кормления и содержания свиней.

Наиболее восприимчивы к заболеванию молодые животные — до года, но основная масса заболевших — в возрасте 2—5 мес; забо­левают поросята и в подсосном возрасте — 1—1,5 мес.

Сезонная динамика заболевания свиней саркоптозом характерна для всех возрастных групп животных. Наибольшего распростране­ния саркоптоз достигает в осенне-зимнее время, когда создаются наилучшие условия для развития клещей. Но при нарушении техно­логии содержания свиней энзоотические вспышки саркоптоза могут быть и в летнее время. Этому способствуют содержание животных в сырых темных помещениях, антисанитарное состояние станков и выгулов, отсутствие прогулок и т. д.

Патогенез. Саркоптесы внедряются в толщу эпидермиса с помощью хорошо развитого хоботка и проделывают в нем ходы. Уколы наносятся клещами в местах выхода волос, где эпидермис тоньше. При травмировании эпидермиса в воспалитель­ный процесс вовлекаются сосочковый и более глубокие слои кожи.

Воспалительные явления в коже вначале выражаются в узелко­вом утолщении, вызванном набуханием зернистых и шиловидных клеток, отечностью субэпидермального слоя, дегенеративными изменениями эпидермальных клеток и волосяных луковиц. Впослед­ствии узелковая сыпь превращается в пузырьки и гнойнички. При расчесах они вскрываются, их содержимое изливается и, подсыхая, превращается в корочки. Разрушаются волосяные луковицы, выпадают волосы. Нарастает слой разрушенных эпителиальных клеток, он пропитывается вос­палительным экссудатом, обра­зуя корку. Кожа теряет эластич­ность, становится грубой, склад­чатой, в запущенных случаях лопается с появлением кровото­чащих трещин. При тотальном поражении кожного покрова животные погибают от интокси­кации и прогрессирующего истощения.

Симптомы болезни. Саркоптоз у свиней протекает в двух формах: ушной — поражение ушных раковин и тотальной — поражение всего тела, в том числе и ушных раковин.

Ушной саркоптоз клинически проявляется только у взрослых свиней в возрасте от 2 лет. Внутренняя поверхность ушных раковин покрывается сероватыми корками, довольно прочно прикреплен­ными к коже. У животных, как правило, не отмечают беспокойства и истощения.

Тотальный саркоптоз при подостром течении клинически прояв­ляется у свиней всех возрастов, но чаще всего у молодняка от 3 до 6 мес. Процесс начинается на голове, вокруг глаз и ушей, затем переходит на спину, боковые части туловища, внутреннюю поверх­ность бедер, нижнюю стенку живота. Вначале образуются неболь­шие зудящие очажки, покрытые серовато-белыми корочками. По мере развития инвазии и вследствие загрязнения они приобретают буровато-черный цвет. Корки становятся массивными, кожа — утолщенной и складчатой. Между складками образуются язвы и абс­цессы. Если животным не оказать своевременную помощь, инвазия распространится по всему телу. Поросята отстают в росте и разви­тии, становятся малокровными (заморышами), сильно истощаются и часто погибают. У взрослых свиней, но с ослабленной резистентностью болезнь протекает малозаметно — в виде покраснения и шелушения кожи, преимущественно на нижней части живота.

При хроническом течении тотального саркоптоза появляются локальные очаги поражения на различных частях тела, но чаще в ушных раковинах, вокруг глаз и в области препуция у хряков.

У поросят отъемного возраста (2,5—3 мес) заболевание иногда сопровождается некротическим поражением ушных раковин. Вна­чале на внутренней поверхности уха, а затем распространяясь на его нижний край, появляются небольшие темные пятна в виде плотных корочек, по внешнему виду напоминающие стригущий лишай. Одновременно образуются множественные грязно-коричнего цвета, зловонного запаха налеты. Под ними видны гной и некроз ткани. Обычно болезнь длится 2—3 мес и заканчивается выздоровлением. Некротизированные ткани отпадают, образуется рубец. У отдель­ных поросят-заморышей некроз распространяется на голову и грудь. Причина такого атипичного течения болезни достоверно не выяснена.

Патологоанатомические изменения. Трупы истощены, анемич­ны. Кожный покров усеян многочисленными саркоптозными оча­гами или они слиты в обширные участки, покрытые грязно-корич­невыми корками со следами кровоизлияний. Кожа местами собрана в складки. Поверхностные лимфатические узлы увеличены. Токси­ческие вещества, поступающие в организм с пораженной кожи, вызывают катар и отек легких, миокардит, нефрозонефрит с мел­кими кровоизлияниями в корковом и мозговом слоях почек, гипер­плазию клеток ретикулоэндотелия красной пульпы селезенки, застойную гиперемию печени.

Диагностика. Учитывают сезонность и клиническое проявление заболевания. Окончательный диагноз устанавливают на основании акарологического исследования. При постановке диагноза необхо­димо исключить другие кожные заболевания (экзему, сифункулятоз, стафилококкоз, дерматомикозы, лептоспироз и др.).

Лечение. Наиболее приемлемым и эффективным методом обра­ботки свиней против саркоптоза является опрыскивание. Обрабаты­вают животных, как правило, группами при расходе 0,5—2 л акарицидной эмульсии на животное. Кроме опрыскивания поросят и маловесных подсвинков можно купать в ручных ваннах небольшой вместимости.

Больных свиней с ушной формой саркоптоза, а также хряков-производителей и свиноматок как клещеносителей обрабатывают аэрозолям и или акарицидами в виде мазей и линиментов.

Владельцы патента RU 2563619:

Изобретение относится к области медицины и предназначено для детекции гриба Trichophyton mentagrophytes. Осуществляют выделение тотальной нативной ДНК из образца кожи и волос, проводят полимеразную цепную реакцию и амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Trichophyton mentagrophytes с использованием специфических праймеров. При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. определяют наличие возбудителя. Изобретение обеспечивает специфическую детекцию Trichophyton mentagrophytes в клиническом материале и может быть использовано для диагностики зооантропонозной трихофитии. 2 пр.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, лабораторной микологии и дерматовенерологии, и может быть использовано для диагностики зооантропонозной трихофитии.

В настоящее время сохраняется интерес к дерматофитиям, обусловленным зоофильными грибами. Периодические эпидемиологические вспышки этих инфекций регистрируются в различных областях нашей страны и за рубежом. В России наиболее неблагоприятными районами по заболеваемости трихофитией являются Северо-Кавказский и Уральский регионы, где заболеваемость в среднем составляет 7,8 и 6,9 на 100 тысяч населения соответственно. В Республике Башкортостан заболеваемость зооантропонозной трихофитией превышает заболеваемость в РФ в 5-6 раз [Латыпов, А.Б. Научное обоснование профилактики зооантропонозной трихофитии и совершенствования медицинской помощи больным (на примере Республики Башкортостан): дис. канд. мед. наук. - Екатеринбург, 2007]. Одним из диагностических критериев постановки диагноза трихофитии являются клинические проявления. Однако клиническое многообразие, наличие атипичных и стертых клинических форм дерматофитий в настоящее время затрудняют своевременную диагностику [Елинов Н.П., Васильева Н.В., Разнатовский К.И. Дерматомикозы или поверхностные микозы кожи и ее придатков, волос и ногтей. Лабораторная диагностика. Проблемы медицинской микологии 2008; 1: 27-34]. Поэтому выставить окончательный диагноз микоза или снять его возможно только при проведении лабораторного обследования.

При подозрении на трихофитию основным методом лабораторной диагностики, как и при других дерматофитиях, является обнаружение возбудителя в исследуемом материале (частички кожи и волосы). Для этого в настоящее время применяются следующие методики [Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. Том 3. / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Лабора, 2009. - 880 с.]:

1. Микроскопия клинического материала - метод предварительной диагностики заболевания. В случаях отсутствия роста возбудителя в культуре положительный результат прямой микроскопии является единственным подтверждением микотической инфекции. Патологический материал изучают в нативных препаратах. Для просветления препаратов, т.е. для растворения роговых масс, используют 20% раствор едкой щелочи (КОН или NaOH).

2. Культуральный метод исследования до сих пор остается предпочтительным методом диагностики микозов. Осуществляется для окончательного уточнения диагноза и выяснения эпидемиологии. Она включает получение культуры гриба с последующим микроскопическим исследованием. По внешнему виду колоний на чашках Петри можно составить представление о роде возбудителя (Trichophyton), его виде (Trichophyton mentagrophytes). Окончательное уточнение рода и вида гриба возможно только на основании микроскопического исследования полученной культуры.

Однако все используемые методы имеют ряд существенных недостатков:

1. Микроскопия клинического материала не позволяет идентифицировать грибы в патологическом материале до вида по их морфологии. Кроме того, чувствительность этого метода не достаточна.

2. Культуральный метод исследования является очень трудоемким и занимает от 5 до 21 дня. Несмотря на то что специфичность этого метода значительно выше, чем при микроскопии клинического материала, чувствительность этого метода тоже не достаточна.

Эффективность перечисленных методов лабораторной диагностики не в полной мере отражает истинную ситуацию по заболеваемости трихофитией. Следовательно, для формирования наиболее объективных представлений о масштабах ее распространения, необходимо широкое внедрение в практику здравоохранения и ветеринарной службы молекулярно-генетических методов диагностики, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую отличает исключительно высокая чувствительность и специфичность, что позволит выявлять Trichophyton mentagrophytes в клиническом материале при различных формах заболевания и, в особенности - при стертых и атипичных формах.

Известен способ диагностики дерматомикозов, заключающийся в том, что диагностику дерматомикозов осуществляют путем высева дерматофитов из клинического материала на плотную селективную среду Сабуро с добавлением антибиотика - левомицетина и гидролизата кератина, полученного из куриного пера. Питательная среда для выделения дерматофитов имеет следующий состав, г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар - 18,0-20,0; гидролизат кератина (в пересчете на сухое вещество) - 10,0-20,0; левомицетин - 50000 ЕД; дистиллированная вода - остальное. Посев инкубируют при температуре 22-24°C в течение 4-8 дней с последующей идентификацией вида колоний. Способ наиболее эффективен при выделении из материала от больных культур грибов-дерматофитов, в частности Microsporum canis, Trichophyton vermcosum, Trichophyton mentagrophytes var. gypseum, Trichophyton rubrum [патент RU №2275631, 2006 г.].

Прототипом предлагаемого изобретения является способ диагностики онихомикоза кистей и стоп, сущность которого заключается в том, что грибок Trichophyton rubrum идентифицируют методом ПЦР, для чего выделяют ДНК из образца кожи или ногтевых пластинок, при этом для выделения ДНК образец инкубируют в 2-4 М растворе щелочи не менее 1 ч при температуре 50-65°C, нейтрализуют раствор 30%-ной соляной кислотой, переосаждают образец в 50%-ном растворе этанола при температуре минус 10 - минус 20°C и высушивают при температуре 50-65°C; проводят ПЦР ДНК с применением высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum синтетических ДНК-зондов, имеющих последовательность: TR-1-F (смысловой): 5' atcgaatctttgaacgcaca 3'; TR-1-R (антисмысловой): 5' tataaagattggggccaggg 3' и при положительном результате диагностируют онихомикоз, вызванный грибком Trichophyton rubrum [патент RU №2319962, 2008 г.].

Задачей изобретения является разработка высокоспецифичного и высокочувствительного способа детекции Trichophyton mentagrophytes при различных клинических формах заболевания и, в особенности, при стертых и атипичных формах.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности лабораторной диагностики трихофитии у человека за счет достоверного обнаружения мицелия и спор Trichophyton mentagrophytes в клиническом материале.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе детекции Trichophyton mentagrophytes, включающем выделение тотальной нативной ДНК из клинического материала, представляющего образец кожи, проведение полимеразной цепной реакции, согласно изобретению в качестве клинического материала дополнительно используют волосы, проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Trichophyton mentagrophytes с использованием праймеров следующей структуры:

5' CGCCCCATTCTTGTCTACCTT 3',

5' GTTTTAACTGATTTTTGCTTCTAAC 3' и при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. определяют наличие возбудителя.

Предлагаемый способ детекции Trichophyton mentagrophytes осуществляется следующим образом. Из клинического материала (частички кожи и волосы) выделяют тотальную нативную ДНК, после чего проводят специфическую амплификацию (ПЦР) фрагмента гена 5.8S рибосомальной РНК (рРНК) Trichophyton mentagrophytes с использованием праймеров следующей структуры:

5' CGCCCCATTCTTGTCTACCTT 3',

5' CTTTTAACTGATTTTTGCTTCTAAC 3'.

При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. констатируют факт присутствия возбудителя в клиническом материале и подтверждают соответствующий диагноз.

ДНК выделяют из клинического материала (частички кожи и волосы). Для обеспечения необходимой степени чистоты ДНК и достаточного ее количества используют методику Boom R. [Boom R., et al. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. J. Clin. Microbiol. 28: 495-503]:

1. В пробирку с 300 мкл лизирующего раствора (5М гуанидинтиоционат, 1% Triton X100) вносится 1 грамм исследуемого материала. Проба тщательно перемешивается на вортексе и прогревается 5 мин при температуре 65°C. Центрифугировали 5 сек при 5 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Когда проба растворялась не полностью, пробирку центрифугировали на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочная жидкость переносится в новую чистую пробирку.

2. Отдельным наконечником в пробирку вносят 25 мкл ресуспендированного сорбента (силикагель, SiO₂). Перемешивают на вортексе, ставят в штатив на 2 мин, еще раз перемешивают и оставляют в штативе на 5 мин.

3. Сорбент осаждается центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 сек. Надосадочная жидкость удаляется с использованием вакуумного отсасывателя.

4. Далее в пробирку с сорбентом вносится 300 мкл раствора для отмывки (5М гуанидинтиоционат). Образовавшуюся смесь тщательно ресуспендируют на вортексе.

5. Сорбент осаждается центрифугированием при 5 тыс. об/мин на микроцентрифуге в течение 30 сек. Надосадочная жидкость удаляется, с помощью вакуумного отсасывателя и чистого наконечника.

6. Добавляется 950 мкл отмывочного раствора (70% этиловый спирт). Сорбент ресуспендируют на вортексе, центрифугируют 30 сек при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель и чистый наконечник.

7. Пробирку инкубируют при температуре 65°C 5-10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышка пробирки должна быть открыта. В пробирку после подсушки добавляется 50 мкл ТЕ-буфера (1 мМ EDTA, 10 мМ TRIS-HCl рН 8.0) для элюции ДНК. Перемешивается на вортексе. Для лучшей элюции пробирка инкубируется в термостате при температуре 65°C в течение 5 мин с периодическим встряхиванием на вортексе.

8. Далее сорбент осаждается центрифугированием при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость, содержащая очищенную ДНК, готова к постановке ПЦР.

Раствор ДНК можно хранить при температуре -18°C в течение 6 месяцев.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и амплификации нужного фрагмента гена 5.8S рРНК, выявляемого при помощи подобранных нами праймеров следующей структуры:

5' CGCCCCATTCTTGTCTACCTT 3',

5' GTTTTAACTGATTTTTGCTTCTAAC 3'.

Амплификацию специфичного фрагмента гена 5.8S рРНК проводят в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 1 мкл тотальной ДНК, 3 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы, по 1 мкл каждого праймера, 3 мкл dNTP, и 1 мкл Taq-полимеразы.

Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 94°C в течение 2 мин; 30 циклов, включая денатурацию при 94°C - 20 сек, отжиг праймеров и синтез ДНК при 58°C - 20 сек.; элонгация при 72°C - 15 сек; терминальная элонгация - 1 мин.

Амплифицированные фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и после окрашивания геля бромидом этидия идентифицируют в ультрафиолетовом свете. В качестве электролита для электрофореза применяют 0,5 Х боратный буфер (0,089 М трисНСl, рН=7,9; 0,089 М борная кислота, 0,002 ЭДТА, рН=8,0).

Электрофорез проводят при постоянном напряжении 100 В. Детекцию результатов проводят путем окрашивания агарозного геля бромистым этидием в течение 10-15 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Продукт амплификации размером 182 п.н. обнаруживается в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Больной М., 14 лет, поступил с жалобами на обильные высыпания на туловище, сопровождающиеся зудом.

Анамнез: Заболевание обнаружил сам 20 дней назад. Лечился 5% настойкой йода и 5% салициловой мазью, без улучшения. Заразился при контакте с сеном.

Status localis: Процесс поражения носил распространенный характер. На передней поверхности кожи живота, на гиперемированном, отечном основании имелось 9 инфильтрированных очагов, фолликулярные узелки, везикулы, покрытые серозными корками.

Результаты лабораторных исследований:

Микроскопия: С гладкой кожи споры не обнаружены. В пушковых волосах мицелий не обнаружен.

Посев: Trichophyton mentagrophytes.

Результаты ПЦР: в клиническом материале (частички кожи и волосы) методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Trichophyton mentagrophytes фрагменты гена 5.8S рРНК.

Окончательный диагноз: Распространенная инфильтративная трихофития гладкой кожи туловища (9 очагов).

Больной С., 16 лет, поступил с жалобами на поражение кожи правой руки, сопровождающиеся зудом.

Анамнез: Заболевание обнаружил сам 14 дней назад. Источник заражения не известен.

Status localis: На коже тыльной стороны лучезапястного сустава имеется инфильтрированный очаг розового цвета, размером 5,5×6 см в диаметре. В очаге имелись фолликулярные папулы, эрозии, чешуйки, по периферии очага - незначительный инфильтрированный венчик. Субъективно больного беспокоил незначительный зуд.

Результаты лабораторных исследований:

Микроскопия: С гладкой кожи обнаружен Tr. ectothrix microides.

Посев: нет роста.

Результаты ПЦР: в клиническом материале (частички кожи и волосы) методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Trichophyton mentagrophytes фрагменты гена 5.8S рРНК.

Окончательный диагноз: Инфильтративная трихофития гладкой кожи правой руки (1 очаг).

Таким образом, предлагаемый способ специфической детекции Trichophyton mentagrophytes в клиническом материале при различных клинических формах заболевания, в отличие от микроскопического и культурального методов, позволяет выявлять и идентифицировать мицелий и споры Trichophyton mentagrophytes в доступном клиническом материале при различных клинических формах заболевания (в особенности, при стертых и атипичных формах), что надежно коррелирует с результатами других исследований и, соответственно, обеспечивает единую интерпретацию данных.

Способ детекции Trichophyton mentagrophytes, включающий выделение тотальной нативной ДНК из клинического материала, представляющего образец кожи, проведение полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что в качестве клинического материала дополнительно используют волосы, проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Trichophyton mentagrophytes с использованием праймеров следующей структуры:
5' CGCCCCATTCTTGTCTACCTT 3',
5' GTTTTAACTGATTTTTGCTTCTAAC 3' и при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. определяют наличие возбудителя.