Исследования в инфекционной лаборатории

Стоянова Наталия Александровна – ведущий научный сотрудник, к.м.н.

Фрейлихман Ольга Александровна – ведущий научный сотрудник, к.б.н.

Панферова Юлия Александровна - научный сотрудник

Сюзюмова Елена Александровна – младший научный сотрудник

Кондрашова Вероника Дмитриевна – младший научный сотрудник

Лаборатория зооантропонозных инфекций начала свою деятельность в 1933 г. в качестве структурной единицы на базе отдела паразитарных тифов (основатель отдела Н.Н. Романенко).
В течение 25 лет руководство лабораторией осуществлял К.Н. Токаревич (в последующие годы заведующими были Ф.И. Красник, Е.М. Попова, Б.В. Вершинский, А.Б. Дайтер). С 1993 г. лабораторией руководит Н.К. Токаревич.

На протяжении многих лет одной из основных тем исследований, проводимых в лаборатории, были риккетсиозы: сначала сыпной тиф, включая его редуцированную форму (болезнь Брилля), затем – крысиный риккетсиоз, коксиеллез и клещевой риккетсиоз Азии. В настоящее время – моноцитарный эрлихиоз человека и гранулоцитарный анаплазмоз человека.

В результате многолетних исследований по проблеме сыпного тифа выявлены патогенетические, эпидемические, клинические и иммунологические особенности повторного сыпного тифа и впервые в нашей стране сформулирована концепция о рецидивном происхождении повторных заболеваний сыпным тифом.

Наряду с риккетсиозами и лептоспирозом в разные годы получили развитие и другие направления, посвященные изучению эпидемиологии, лабораторной диагностике и профилактике орнитоза, туляремии, иерсиниоза, геморрагической лихорадки с почечным синдромом, клещевого энцефалита и других арбовирусных инфекций (К.Н. Токаревич, А.Б. Дайтер, Б.В. Вершинский, Л.А. Вишнякова, Г.Я. Ценева, Ф.С. Носков, Е.Д. Соколова, И.И. Камалов и др.). Таким образом, общая линия в эволюции профиля научных исследований и прикладных разработок характеризовалась расширением перечня нозологических форм с акцентом на инфекции, общие для животных и человека (зооантропонозы).

Одним из основных направлений научной деятельности лаборатории на протяжении многих лет является региональная эпидемиология зооантропонозных инфекций на северо-западе России. За разработку концепции ландшафтной нозогеографии и системного картографирования сотруднику лаборатории Б.В. Вершинскому была присуждена Государственная премия СССР.

К настоящему времени выявлены множественные природные очаги этих инфекций в Северо-Западном федеральном округе (СЗФО), показана их трансформация под влиянием урбанизации. Сформулированы положения об эволюции лептоспирозов, установлены причины значительного роста заболеваемости и высокой летальности при этой инфекции в Санкт-Петербурге в 80-90-е гг. XX и в начале XXI вв. Показано, что этиологическая структура лептоспироза, социально-профессиональный состав больных и клиническое течение инфекции существенно меняется в пространстве и времени (Н.А. Стоянова, Г.Ф. Трифонова, С.О. Майорова, Н.К. Токаревич).

Второе направление исследований, проводимых лабораторией, – усовершенствование и разработка средств индикации возбудителей зооантропонозных инфекций и выявления антител к ним. Так были разработаны эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностический препарат для обнаружения коксиелл Бернета в реакции непрямой гемагглютинацин (РНГА); иммуноферментная тест-система для выявления коксиелл, корпускулярный антиген коксиелл 1-й фазы для реакции связывания комплемента; эритроцитарный диагностикум для выявления антител к коксиеллам 1-й фазы в РНГА; эритроцитарный диагностикум для выявления антител к коксиеллам 1-й фазы в реакции непрямого гемолиза, иммуноферментная тест-система для определения антител к коксиеллам 1-й и 2-й фаз. На производство ряда перечисленных препаратов разработаны и утверждены технические документации. Они рекомендованы для применения в практике здравоохранения (Н.К. Токаревич, А.Б. Дайтер и др.).
Разработана технология производства иммуноферментных тест-систем для обнаружения лептоспир и антител к ним (Н.А. Стоянова и др.).

В лаборатории проводятся исследования по усовершенствованию молекулярно-генетических методов для выявления C. burnetii и лептоспир, а также для изучения генетической гетерогенности этих возбудителей. Так, было показано, что сконструированный набор праймеров, позволяющий амплифицировать фрагмент гена groEL С.burnetii, эффективен для выявления методом ПЦР возбудителей Ку-лихорадки в биологическом материале. Проведены исследования генетической гетерогенности штаммов С.burnetii, выделенных на территории России и сопредельных государств с использованием различных генотипических маркеров.
При исследовании музейных штаммов из коллекции НИИ им. Пастера методами мультиспейсер-типирования (анализ нуклеотидной последовательности межгенных спейсеров) и MLVA (мультилокусного анализа тандемных повторов переменной копийности, или VNTR) было установлено, что популяции С.burnetii, циркулирующей на территории России, свойственна относительная генетическая однородность. Однако ряд штаммов С.burnetii, штаммы Ленинград-2 и Ленинград-4, обладают, согласно анализу сиквенс-типов межгенных спейсеров, уникальным для российской популяции генотипом (О.А. Фрейлихман).
При анализе локусов VNTR также были выявлены значительные генетические отличия штамма Ленинград-2 от других штаммов, выделенных на территории России. По результатам мультиспейсертипирования и VNTR-анализа штаммы С.burnetii, выделенные в различных регионах России, филогенетически наиболее близки к группе штаммов европейского происхождения. Результаты мультиспейсер-типирования коррелируют с результатами анализа методом MLVA (Ю. А. Панферова), позволяя дифференцировать штаммы С.burnetii различного географического происхождения.
Высокая дискриминативная способность данных методов позволяет использовать их в качестве методов генотипирования и молекулярно-эпидемиологического мониторинга.
С целью разработки и усовершенствования методики типирования патогенных лептоспир для определения серогрупповой и видовой принадлежности штамма, а также для характеристики их генетических особенностей, было проведено исследование штаммов лептоспир коллекции лаборатории методом VNTR, в ходе которого были разработаны (совместно с Парижским Институтом Пастера) праймеры к кодирующим последовательностям, фланкирующие VNTR, длина которых у лептоспир разных видов варьирует.

Для типирования штаммов в зависимости от их серогрупповой и видовой принадлежности был применен метод анализа длин рестрикционных фрагментов. В ходе исследования были выявлены различные рестрикционные профили гена ompL1 лептоспир, относящихся к разным видам и разным серогруппам. Показано, что детерминирующие сайты рестрикции могут рассматриваться в качестве генетического маркера для дифференциации патогенных лептоспир.
В развитие этих исследований была оценена гетерогенность рестрикционных профилей генов факторов патогенности lsa 21, lenA и lipL32 среди лептоспир различной систематической принадлежности (согласно генетической и серологической классификации). Установлено, что ген lipL32 может быть использован для создания системы для дифференциации геномовидов патогенных лептоспир на основании полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, полученных с использованием рестриктаз Bsa29I и BamHI (А.Н. Ваганова).

Проводимые в лаборатории молекулярно-генетические исследования имеют большое значение для повышения эффективности лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора за зооантропонозными инфекциями.

Изучение патогенеза лептоспироза позволило выявить различные варианты инфекционного процесса и установить ведущие патогенные свойства лептоспир: адгезия к гепатоцитам и способность к колонизации их поверхности, токсическое действие, выражающееся в нарушении микроциркуляции проницаемости сосудов, адгезия к нефротелию и колонизация его поверхности (Ю.Е. Полоцкий, В.Н. Семенович, Н.А. Стоянова).

Совместно с И.С. Фрейдлин установлено, что мишенями стимулирующего действия коксиелл Бернета являются клетки системы мононуклеарных фагоцитов и эндотелиальные клетки. Выявлена взаимосвязь между иммуномодулирующими и протективными свойствами коксиеллезных препаратов, установлено, что показатели раннего индуцированного ответа могут служить критериями эффективности последующей вакцинации коксиеллезной вакциной (Н.К. Токаревич).

Четвертым направлением исследований лаборатории является разработка препаратов для специфической профилактики и лечения зооантропонозных инфекций. Данное направление формировалось еще в блокадные годы, когда сотрудники лаборатории (К.Н. Токаревич, Е.М. Попова, А.Ф. Фомина) в короткие сроки освоили выпуск сыпнотифозной вакцины из легочной ткани инфицированных белых мышей; препарат был с успехом использован для иммунизации наиболее угрожаемых контингентов. Тогда же сотрудниками антирабического отдела (В.Г. Ушаков, С.А. Барановская) был разработан оригинальный метод пассирования вакцинного штамма вируса бешенства и производства антирабической вакцины, которую использовали для иммунизации военнослужащих и гражданского населения.
В послевоенные годы на базе лаборатории были продолжены исследования по технологии производства антирабической вакцины (T.И. Соловьев, И.А. Пискарева). Кроме того, в осажденном городе было проведено экспериментальное и клиническое изучение эффективности лептоспирозных сывороток реконвалесцентов и налажено их производство (К.Н. Токаревич, Е.М. Попова).
В 80-90-е годы совместно с сотрудниками НИИЭМ им. Гамалеи и Института военной медицины были проведены многоплановые исследования, направленные на разработку и испытания инактивированной комбинированной вакцины против лихорадки Ку.

В лаборатории были изучены биологические свойства различных штаммов коксиелл Бернета и отобраны из них наиболее перспективные для создания вакцин; разработаны количественные методы стандартизации коксиеллезных препаратов; определена роль отдельных субстанций коксиелл в индукции различных звеньев иммунной системы, а также проведен отбор адекватных критериев и методов для оценки эффективности вакцинных препаратов (Н.К. Токаревич).
Итогом этой работы (выполненной совместно с А.Б. Дайтером, И.В. Тарасевичем, А.Ж. Василенко и др.) явилось создание инактивированной комбинированной вакцины против лихорадки Ку, обладающей выраженными иммуногенными и протективными свойствами. Результаты морфологических исследований свидетельствовали о ее низкой реактогенности. При испытании на лабораторных животных и волонтерах показана высокая иммунногенная активность вакцины, однократное введение которой защищает животных от внутрибрюшного и аэрозольного заражения вирулентными штаммами коксиелл в течение всего периода наблюдения.
Государственные испытания этого препарата, проведенные в 2007 году, подтвердили ее низкую реактогенность и безопасность. По данным иммуноферментного анализа у 84% и 81% вакцинированных были обнаружены в сыворотке крови IgG антитела к коксиеллам Бернета 2-й фазы через один месяц и один год после однократного подкожного введения препарата, соответственно. Вакцина рекомендована для применения в практике. Новизна этого инновационного препарата подтверждена 9 авторскими свидетельствами и патентами на изобретения.

В настоящее время, в результате исследований, проводимых О.А. Фрейлихман, Ю.А. Панферовой, Н.А. Стояновой и Н.К. Токаревичем, получены новые данные, расширяющие представления о биологических свойствах и генетическом разнообразии популяции патогенных лептоспир и коксиелл, циркулирующих на территории России:

– установлено, что мультилокусный анализ тандемных повторов переменной копийности является высокодискриминативным методом генотипирования патогенных лептоспир;

– разработаны праймеры для генотипирования лептоспир методом MLVA к локусам VNTR_L1, VNTR_L2 и VNTR-Lb5;

– выявлено 22 генотипа лептоспир, различающихся по набору аллелей изученных локусов;

– по результатам анализа нуклеотидной последовательности 16S pPHK лептоспир выявлен ряд редко встречающихся генотипов, некоторые из которых являются уникальными;

– показана высокая дискриминационная способность VNTR-анализа C.burnetii и возможность применения этого метода для молекулярно-эпидемиологического анализа;

– секвенирование гена icmD C. burentii, позволило кластеризовать штаммы, выделенные от разных источников;

– сконструированы наборы праймеров и зондов для эффективного типирования штаммов C. burnetii в рамках полиморфизма A/G гена EnhA.1 и T/G гена TolQ.

Усовершенствована лабораторная диагностика лептоспироза, лихорадки Ку, иксодовых клещевых боррелиозов:

– с помощью методов генной инженерии сконструирована иммуноферментной тест-системы для диагностики лептоспироза (совместно с В.Н. Куликовым и А.А Козаренко)

– аргументирована возможность применения метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для идентификации штаммов лептоспир (совместно с Е.В. Зуевой);

– разработаны праймеры для создания диагностической тест-системы для определения количественного содержания лептоспир в биологическом материале методом ПЦР-РВ;

– разработана диагностическая тест-система для выявления C. burnetii в биологическом материале основанная на амплификации методом ПЦР-РВ по технологии TaqMan фрагмента гена groEL;

– оптимизирована ПЦР для выявления возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов;

– определена роль различных цитокинов в иммунопатогенезе лептоспирозной инфекции (совместно с О.А. Петровой и А.А. Тотоляном);

– установлено влияние климата на рост заболеваемости клещевого энцефалита на территории европейского севера России (Н.К. Токаревич совместно с А.А. Трониным, Б.А. Ревичем, Р.В. Бузиновым, В.П. Болтенковым).

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.

Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

1. бактериологические;
2. серологические;
3. метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.

Бактериологические методы исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов. Они включают:

• микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
• выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
• идентификацию бактерий;
• определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза и т.д.). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видом микроорганизмов в биологическом материале, а также дает предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

1 - стрептококки; 2 - стафилококки; 3 - диплобактерии Фридленда; 4 - пневмококки

Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 ч. Затем чашки Петри просматривают. Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры. Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 10 5 , свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.

Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики. При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентов в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G. При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (IgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.

2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100 % чувствительностью и специфич-ностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.

Авидность - характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген. Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях. Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал - сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:

• возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в т.ч. и материале, получаемом при биопсии;
• возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;
• возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
• высокая чувствительность метода; например чувствительность ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4,0 . 10 2 копий/мл), в то время как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов - 2,1 пг/мл (приблизительно 7,0 . 10 5 копий/мл).

Диагностика инфекций (infectio – перевод с латинского – заражение). Инфекционные заболевания человека представляют собой группу болезней, вызываемых специфическими болезнетворными возбудителями, которые могут передаваться от зараженного человека здоровому. Нередки и случаи передачи патогенных агентов человеку от носителей инфекций или заболевших животных (зоонозные заболевания). Следует отметить, что большинство зоонозных инфекционных заболеваний не передается от человека к человеку. У человека и животных (домашних и диких плотоядных) насчитывают более 300 общих инфекционных возбудителей, из которых более 80 заболеваний вызываются бактериями, свыше 100 – вирусами, около 20 - грибами, 80 заболеваний связано с заражением гельминтами и около 20 - простейшими.

Известны инфекционные болезни, вызываемые, так называемыми арбовирусами – вирусами, передающимися людям через укусы насекомых, например клещей, комаров, блох и др., которые инфицируются от домашних или диких животных. Самая распространенная известная арбовирусная инфекция – клещевой энцефалит. Вирус геморрагической лихорадки также передается клещами. Как известно, клещи являются переносчиками и бактериальных инфекций, например клещевого боррелиоза (болезнь Лайма) или туляремии, хотя туляремию относят к зоонозным заболеваниям, передающимся человеку при непосредственном контакте с больными животными (грызунами), а также при употреблении зараженных продуктов или воды (алиментарный путь заражения). Таким образом, для каждой инфекции у человека характерен свой возбудитель и определенный путь передачи. Возбудителями инфекций могут быть бактерии, вирусы, риккетсии (микроорганизмы, сочетающие в себе особенности бактерий и вирусов), спирохеты, грибки, протозойные (паразитирующие простейшие, одноклеточные), глисты, которые выводятся из организма больного человека или животного при выдохе, мочеиспускании, дефекации, кашле, рвоте, и когда при определенных условиях этот биологический патологический материал становится источником заражения здорового человека.

Согласно литературным данным в настоящее время известно 1415 возбудителей инфекционных и паразитарных болезней. Наиболее обширную группу составляют болезни, вызываемые бактериями и риккетсиями (538 нозологий). Второе место принадлежит паразитарным болезням - 353 нозологии. Вирусные инфекции составляют 217 нозологий. Постоянно возникают новые или впервые выявленные инфекционные заболевания. Так, начиная, с 1970-х голов ежегодно регистрируется, по крайней мере, одно инфекционное заболевание. За последние годы стали известны более 30 инфекционных заболевании, это и ВИЧ, легионеллез, эпидемический ротавирусный гастроэнтерит и ряд африканских лихорадок (например лихорадка Эбола).

В настоящее время существенную роль в распространении инфекционных болезней играет развитие туризма, а также миграционные процессы.

Классификация инфекционных заболеваний

Что касается классификации основных инфекционных болезней человека, то существуют разные системы группировки инфекционных заболеваний. В нашей стране одной из наиболее распространенных является классификация Л.В. Громашевского, построенная в зависимости от локализации возбудителя в организме и механизме его передачи, таких групп насчитывается 5:

• кишечные инфекции;
• инфекции дыхательных путей;
• кровяные инфекции;
• инфекции наружных покровов;
• инфекции с различными механизмами передачи, например передающиеся половым путем, воздушно-капельным путем (один из самых распространенных), фекально-оральный, контактный, трансмиссионный, вертикальный от матери к плоду, от матери к новорожденному в родовом акте, внесенные при операциях, инъекциях и т.п.)

Кроме того в РФ принята также международная более многоступенчатая классификация инфекционных заболеваний:

• кишечные инфекции;
• туберкулез;
• бактериальные зоонозы;
• другие бактериальные заболевания;
• полиомиелит и энтеровирусные болезни центрально нервной системы;
• вирусные заболевания, сопровождающиеся высыпаниями;
• вирусные заболевания,которые передаются членистоногими;
• другие вирусные заболевания;
• риккетсиозы и другие инфекции, передаваемые членистоногими;
• сифилис и другие венерические инфекции;
• заболевания. которые вызываются спирохетами;
• грибковые заболевания (микозы);
• гельминтозы;
• другие инфекции и паразитарные заболевания.

Инфекционные заболевания вызывают у пациента значительные изменения в картине крови, при многих инфекционных болезнях изменяется функция различных внутренних органов – печени, сердца, легких, мозга, почек, кишечника, практически все инфекционные заболевания протекают с изменениями широкого спектра биохимических параметров, отражающих различные стороны патогенеза. Установлено также, что, к примеру, вирусы краснухи, герпеса, коксаки, полиомиелита, цитомегаловирус и эховирусы (род энтеровирусов) могут вызывать серьезные нарушения в развитии плода и новорожденного. Кроме того в настоящее время есть основания считать, что некоторые группы вирусов могут быть виновниками возникновения диабета первого типа, к ним относят вирус Коксаки, вирус краснухи, реовирус 3 типа, вирус энцефаломиокардита, вирус эпидемического паротита, цитомегаловирус, вирус гепатита А.

Диагностика инфекций

Диагноз инфекционного заболевания основывается на анамнезе больного, эпидемиологическом анамнезе, включает инструментальные методы обследования и, как правило, диагностика инфекционных заболеваний не обходится без использования комплекса лабораторных методов. Диагностика инфекционного заболевания начинается с базовых лабораторных методов исследования: это – клинический анализ крови. Известно, например, что в клиническом анализе крови лейкоцитоз чаще всего выявляется в результате инфекционного заболевания, что многие вирусные, бактериальные и рикетсиозные болезни приводят к нейтропении (снижение нейтрофилов), а частой причиной лимфоцитоза и/или моноцитоза является инфекционный мононуклеоз.

Такой показатель крови, как скорость оседания эритрорцитотв (СОЭ), не являясь самостоятельным диагностическим показателем в силу своей неспецифичности, является индикатором общего неблагополучия и продолжает активно использоваться в медицинской практике для выявления и мониторирования инфекционных и воспалительных заболеваний различного происхождения.

Общий анализ мочи является лабораторным тестом, который часто используется при исследования инфекционных заболеваний не только почек, но и инфекций другой локализации.

Так некоторые инфекционные заболевания сопровождаются протеинурией нефротического типа (количество белка в моче не менее 3г/л). Например хронические инфекционные заболевания могут стать причиной нефротического синдрома. Развитие протеинурии нефротического типа могут вызвать, например, бактериальный эндокардит, туберкулез, сифилис, лепра, гепатит В и С, мононуклеоз, цитомегаловирусная инфекция, ветряная оспа, малярия, токсоплазмоз, шистосомиаз. Появление в моче бактерий и возникновение воспаления указывает на наличие инфекционного заболевания мочеполовой системы.

Достаточно эффективным при инфекционных заболеваниях является использование комплекса биохимических тестов, поскольку количественные и качественные изменения биохимических показателей в крови происходящие во время болезни, отражают происходящие при заболевании биохимические нарушения и позволяют следить за динамикой патологического процесса и адекватностью лечения.

К таким эффективным биохимическим параметрам, которые исследуются при инфекционных и воспалительных заболеваниях другого происхождения, например, относится – спектр белков сыворотки крови (белки острой фазы), ферменты и некоторые другие биохимические показатели. Использованием специфических лабораторных методов, например, при диагностике причин лихорадки неясного генеза, хронических инфекций выполняют ис.

В практической медицине часто требуется более глубокое лабораторное исследование с следования мазков из горла, посевы крови, мочи и других жидкостей и выделений организма для выявления бактерий, грибков, иногда, при изменениях характера стула, назначают исследования кала на яйца глист.

В настоящее время в лабораторной диагностике для выявления инфекционных возбудителей широко используются следующие специфические лабораторные методы:

• микроскопические методы, позволяющие идентифицировать инфекционного возбудителя в биологическом патологическом материале с помощью разнообразных типов микроскопов после приготовления окрашенных или нативных мазков.
• Культуральный (бактериологический) метод, который заключается в выделении чистой культуры возбудителя из патологического материала, с дальнейшей его идентификацией по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным, токсикогенным (применяя специфические методы) свойствам и определение его чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Эти исследования часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания.
• Серологические исследования, в основе которых лежит специфическое взаимодействие антигена и направленных к нему антител. Эти исследования позволяют с диагностической целью определять (качественно и количественно) как антигены так и антитела к ним. Использование в лабораторной практике таких серологических методов как: ИФА(иммунофементный анализ), иммунофлюоресцентный, иммунофлюоресцентныф анализ - позволяет определять в крови больного антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (ИГ А, ИГ М, ИГ Ж). Существование определенной закономерности в динамике выработки специфических антител различных классов при инфекционном заболевании позволяет судить как о стадии так и об интенсивности инфекционного процесса.
• Молекулярно-биологические методы, к которым относится полимеразная цепная реакция (ПЦР-метод).

В основе ПЦР-диагностики лежит молекулярно-биологический метод амплификации (многократное копирование) малых фрагментов нуклеиновых кислот бактерий, вирусов, хламидий, микоплазменных и др. с помощью фермента ДНК- полимереразы. ПЦР-диагностика позволяет провести прямую идентификацию нуклеиновых кислот(РНК или ДНК), то есть генетического материала, инфекционного агента в различном биологическом материале.