Инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых рыб

1. Общие положения
1.1. Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) -высококонтагиозная вирусная болезнь лососевых рыб, выращиваемых в искусственных условиях, наблюдающаяся в пресноводной и иногда, - в морской аквакультуре. Заболевание протекает по типу эпизоотии и характеризуется развитием септического процесса, тяжелым поражением органов гемопоэза, кровоизлияниями в органы и ткани, а также массовой гибелью рыб.

1.2. Болезнь распространена на прилегающих к Тихому океану территориях США и Канады (от Аляски до Калифорнии), в Японии, Китае, Корее и на Тайване, а с 1987 года регистрируется во Франции, Италии, Германии и Бельгии.

1.3. Заболевание проявляется в форме экссудативно-геморрагического синдрома, развитие которого обусловлен размножением вируса в соединительной ткани органов, гемопоэтической ткани и клетках экскреторной части почек, что ведет к нарушению водно-минерального баланса и выходу плазмы и клеток крови в окружающие ткани и полости тела.

2. Этиология
2.1. Болезнь вызывает РНК-содержащий вирус из рода Lyssavirus. Вирус получил название Infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV). Вирус ИНГТ представлен одним серотипом, термолабилен: за 15 мин прогревания при 45° инактивируется более чем на 99,9% и полностью разрушается при 60°С.

2.3. Среди полевых изолятов вируса встречаются как слабовирулентные, так и высоковирулентные изоляты.

3. Эпизоотология
3.1. В пресноводной аквакультуре вспышки заболевания зарегистрированы у нерки, чавычи, кеты, горбуши, симы, стальноголового лосося и радужной форели. Реже болеют кумжа и лосось Кларка.

3.2. Гольцы и кижуч считаются устойчивыми к заболеванию, но могут быть носителями вируса.

3.3. Наиболее восприимчива к заболеванию молодь в период от рассасывания желточного метка до 2-6-месячного возраста. Рыбы более старшего возраста (годовики и двухлетки) болеют реже и легче. Впервые заразившиеся производители могут погибнуть. Отмечены значительные индивидуальные колебания восприимчивости рыб к ИНГТ.

3.4. Заболевание развивается при температуре воды от 3 до 15°С и затухает при дальнейшем ее повышении. Эпизоотии ИНГТ обычно имеют два пика: весенний (конец зимы - начало лета) и - реже, - осенний (конец лета и осень), но при соответствующей температуре могут наблюдаться в любое время года. Наиболее остро болезнь протекает при 10-12°С. При этом может погибнуть до 80-100% молода. У рыб массой 100-500 г заболевание, как правило, протекает в хронической форме, и гибель не превышает 10-25%. Чем меньше возраст рыб, тем при более высокой температуре может развиться у них заболевание. Это связано с несовершенством системы иммунитета у ранней молоди рыб.

3.5. Даже при циркуляции вируса в популяции рыб вспышки ИНГТ может не возникнуть. Заболевание провоцируется стрессированисм рыбы при различных манипуляциях с нею (перевозки, сортировка и т.п.) или нарушении технологического режима выращивания.

3.6. После эпизоотии часть переболевших или устойчивых к заболеванию рыб становятся вирусоносителями.

3.7. Рыбы-вирусоносители формируют естественный резервуар инфекции. В аквакультуре источником инфекции служат также больные и свежепогибшие рыбы. Инфицированные рыбы выделяют вирус с мочой, слизистыми выделениями кишечника (редко с фекалиями), с половыми продуктами, через жабры, кожу и ткани плавников.

3.8. Вирус передается через воду, ил, рыбоводный инвентарь. Возможен оральный путь передачи при каннибализме, скармливании сырого мяса или внутренностей инфицированных рыб. Вероятность вертикальной передачи вируса незначительна. В воде при 15°С инактивация вируса происходит примерно через месяц.

3.9. Механическими переносчиками вируса являются кровососущие паразиты рыб (пиявки, копеподы и др.), а также рыбоядные птицы.

3.10. Воротами инфекции являются жабры, интактные кожные покровы, плавники и начальный отдел пищеварительного тракта. Остропротекающая инфекция носит системный характер. Развивается септический процесс, ведущий к поражению практически всех органов и тканей. Наиболее тяжело поражаются органы гемопоэза - почки и селезенка. Вирус обладает повышенным тропизмом в отношении соединительной ткани.

3.11. Переболевшая рыба приобретает стойкий иммунитет, в крови появляются антитела.

4. Клинические признаки и патологоанатомические изменения
4.1. Инкубационный период при естественной инфекции и температуре воды 10-15°С составляет 1-2 недели.

4.2. Первыми признаками заболевания являются: анорексия и угнетение рыб, утрата реакции на внешние раздражители. Больные рыбы приобретают темную окраску, ложатся на дно или поднимаются к поверхности воды и перемещаются к краям бассейна или канала, где течение слабее.

4.2.1.Острая вспышка ИНГТ начинается с внезапной массовой гибели, причем первые рыбы могут погибать без внешних признаков заболевания. У больных рыб отмечают экзофтальм, побледнение жабр, точечные кровоизлияния в периокулярной соединительной ткани глаз, в межлучевой ткани оснований плавников, реже - на брюшке и позади головы. Брюшко увеличено (растянуто). Из ануса отдельных больных рыб свисают длинные тяжи слизоподобной консистенции с сероватым оттенком (иногда с примесью крови). У личинок наблюдаются множественные кровоизлияния в желточный мешок и гидроцефалия (припухлость на голове в виде шапочки). При вскрытии в полости тела обнаруживают скопление прозрачного желтоватого (иногда кровянистого) экссудата, множественные петехиальные кровоизлияния в перивисцеральной жировой ткани, на брюшине, стенках кишечника и плавательного пузыря, иногда в мускулатуре. Печень, почки и селезенка бледные, отечные. Желудочно-кишечный тракт свободен от пищи, иногда наполнен слизеподобным содержимым молочно-белого цвета.

4.2.2. Хроническая форма течения болезни характеризуется менее ярко выраженными признаками и умеренной, растянутой во времени гибелью рыб.

4.2.3. У небольшой части рыб - обычно на завершающей стадии эпизоотии, - развивается нервная форма заболевания, проявляющаяся в нарушении поведения рыб (чередование фаз повышенной возбудимости и угнетения) Внешние признаки заболевания, за исключением более темной окраски тела, у таких рыб, как правило, отсутствуют. Эта форма ИНГТ обусловлена поражением центральной нервной системы, и нередко вирус у этих рыб может быть обнаружен только в головном мозге.

4.3. Больные рыбы обычно имеют те или иные признаки заболевания из вышеописанного комплекса. Лишь у немногих пораженных особей в период эпизоотии можно встретить весь набор характерных клинических признаков и патологоанатомических изменении. Ни один из описанных признаков не является патогномоничным. У 1-5% переболевших рыб развивается искривление позвоночника (сколиоз, лордоз).

5. Диагноз
5.1. Предварительный диагноз на ИНГТ ставят на основании анализа эпизоотологических данных, обнаруженных клинических признаков и патологоанатомических изменений. Окончательный диагноз базируется на результатах вирусологических исследований, включающих выделение и серологическую идентификацию вируса, а при необходимости - постановку биопробы.
Отбор проб и их исследования проводят в соответствии с "Методическими указаниями по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезнен рыб" от 10.01.97 г., № 13-4-2/1054.

6. Профилактические мероприятия
6.1. Профилактика ИНГТ основана на предупреждении проникновения его в благополучные хозяйства, строгом выполнении рыбоводных и ветеринарных требований, изложенных в "Ветеринарно-санитарных правилах для рыбоводных хозяйств" и соответствующих инструкциях по борьбе с болезнями лососевых рыб, обеспечении оптимальных гидрохимического и гидробиологического режимов, соблюдении норм плотности посадки рыбы, максимальном снижении стрессирования рыбы при технологических манипуляциях с нею.

6.2. В хозяйстве осуществляют регулярный ветеринарный контроль над состоянием здоровья рыб в сроки, установленные в вышеназванных Правилах, уделяя особое внимание обследованию рыбы в весеннее время.

6.3. Ввоз рыбы и икры для целей разведения и выращивания разрешается только из благополучных по инфекционным и инвазионным болезням рыб рыбоводных хозяйств и рыбохозяйственных водоемов и производится в соответствии с действующей "Инструкцией по ветеринарному надзору за перевозками живой рыбы, оплодотворенной икры, раков и других гидробионтов".

6.4. Для уменьшения возможности передачи вируса через овариальную и семенную жидкости поверхность икринок дезинфицируют, обрабатывая икру растворами иодинола или хлорамина-Б в соответствии с действующими наставлениями по их применению.
Обработки проводят дважды: сразу после оплодотворения и набухания икры и на стадии глазка.

6.5. Для защиты от рыбоядных птиц расположенные на открытом воздухе пруды и бассейны с рыбой затягивают сетью.

6.6. Использовать для кормления выращиваемых рыб мяса (тушек) дикой рыбы разрешается только после термической обработки (пастеризация в течение 1 часа при 60°С). Скармливание сырого мяса и внутренностей рыб недопустимо.

6.7. При подозрении на ИНГТ во время обследования ветеринарным врачом рыбы руководители и специалисты хозяйства под контролем местных органов госвстслужбы организуют доставку живой рыбы или патологического материала (отобранного в соответствии с "Методическими указаниями по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб") в лабораторию для проведения вирусологических исследовании или вызывают специалистов лаборатории для отбора материала на месте.

До установления окончательного диагноза запрещается вывоз рыбы в другие рыбоводные хозяйства и рыбохозяйственные водоемы, а также любая пересадка рыбы из подозреваемых в неблагополучии прудов и бассейнов.

7. Меры борьбы
7.1. При установлении диагноза хозяйство объявляют неблагополучным по инфекционному некрозу гемопоэтической ткани лососевых рыб и на него накладывают карантин. Независимо от формы проявления болезни - вирусоносительство или клинически протекающее заболевание, - факт выделения вируса от рыб достаточен для наложения карантина.
Ветеринарный врач хозяйства обязан:
- немедленно сообщить о неблагополучии хозяйства непосредственному руководителю по ведомственной линии, а также оповестить рыбоводные хозяйства, в которые вывозили рыбу для выращивания и разведения;
- одновременно сообщить главному ветеринарному врачу района (города) и вышестоящему ветеринарному органу о появлении заболевания и зоне его распространения;
- уточнить время появления заболевания и количество погибшей рыбы всех возрастных групп раздельно;
- принять меры по выявлению источника инфекции в хозяйстве.
- принять меры по скорейшему купированию и ликвидации заболевания.

7.2. Учитывая благополучие России по ИНГТ, и с целью предупреждения появления очагов инфекции оздоровление карантинированных хозяйств проводят методом радикальной дезинфекции и летования.

7.3. Работу по оздоровлению хозяйства проводят в соответствии с разработанным местным органом государственной ветеринарной службы планом, утвержденным администрацией района.

7.4. Ликвидация заболевания:

7.4.1. Товарную рыбу, производителей и ремонтную группу рыб, не имеющих признаков заболевания, разрешается вывозить непосредственно в торговую сеть без передерживания ее в садках живорыбных баз; воду, в которой перевозили рыбу, подвергают хлорированию и после этого сливают в канализационную сеть, а в сельской местности выливают на поля на расстоянии не ближе 500 м от водоемов; тару после перевозки рыбы моют и дезинфицируют 2%-ным раствором формалина.

7.4.2. Всю другую рыбу, икру и трупы погибших рыб собирают и закапывают вдали от водоемов на глубину не менее 1,5 м с предварительным обеззараживанием раствором хлорной или негашеной извести. По заключению ветеринарного врача допускается техническая утилизация этой рыбы (кроме трупов) и икры (проваривание и скармливание птице, свиньям или пушным зверям).

7.4.3. Пруды, бассейны и каналы осушают, очищают от ила и мусора и дезинфицируют негашеной известью из расчета 0,5 кг на 1 м 2 площади.

7.4.4. Помещения инкубационных цехов, бассейны, шлюзы, решетки и другое оборудование в них, складские помещения и комнаты для приготовления кормов тщательно очищают и дезинфицируют горячим 2%-ным раствором едкого натра с помощью щеток или опрыскивателей. Допускается также дезинфекция 2%-ным раствором формалина.

7.4.5. Живорыбный транспорт, баки, фляги, контейнеры подвергают механической очистке с использованием 0,2%-ного раствора двууглекислой соды, а затем дезинфицируют 2%-ным раствором формалина. Малоценный инвентарь сжигают.

7.4.6. При возможности переводят хозяйство на свободный от инфекции водоисточник (артезианская скважина, родник, ручей, свободные от дикой рыбы), либо налаживают озонирование или обработку ультрафиолетовым излучением подаваемой в хозяйство воды.

7.4.7. После проведения указанных мероприятий хозяйство (рыбозавод) не эксплуатируют еще не менее одного месяца, а затем завозят икру из благополучного по инфекционным болезням источника.

7.4.8. На протяжении 12 месяцев после зарыбления хозяйства осуществляют ветеринарное наблюдение за выращиваемой в нем рыбой. В этот период не менее двух раз проводят вирусологическое исследование молоди (весной и осенью при температуре воды 10-12°С). Работу ведут, руководствуясь положениями "Методических указаний по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб" и настоящей Инструкции. Вирусологически исследуют 150 рыб с расчетом детектирования вирусоносительства. В отбираемый материал, помимо паренхиматозных органов, обязательно включают пробы слизи, жабр, кожи, плавников и мозга,

7.5. Если в бассейне реки или на водоеме выявлены несколько неблагополучных по ИНГТ хозяйств, оздоровление всех их проводят одновременно, применяя вышеописанный способ полной дезинфекции к летования.

7.6. В случае выявления в зоне расположения неблагополучного хозяйства сформировавшегося стойкого очага ИНГТ-инфекции и наличия возбудителя в водоисточнике применяют комплексный метод ликвидации заболевания, рассчитанный на постепенное оздоровление хозяйства. В соответствии с ним проводят мероприятия по выявлению и уничтожению источников инфекции, разрыву путей передачи возбудителя, улучшению физиологического состояния рыб и повышению их устойчивости к заболеванию.

7.6.1. По условиям карантина в рыбоводном хозяйстве, оздоравливаемом комплексным методом, запрещаются:
- ввоз и вывоз икры, рыбы и кормовых водных организмов;
- смешанные посадки рыбы разных возрастных групп;
- использование применявшегося в неблагополучном пруду (бассейне) рыбоводного инвентаря в других прудах (бассейнах).

7.6.2. Рыбу выращивают изолированно по видам и возрастным группам, для обслуживания которых закрепляют отдельный персонал, необходимую спецодежду и инвентарь (скребки, щетки, сачки и т.д.). Сортировки и пересадки рыб осуществляют только внутри этих групп.

7.6.3. Устанавливают тщательное ветеринарное наблюдение за всей выращиваемой в хозяйстве рыбой. При появлении заболевания в отдельных прудах или бассейнах уничтожают (обеззараживают и закапывают) всю содержащуюся в них рыбу и проводят их чистку и дезинфекцию.

7.6.4. Обеспечивают усиленную проточность воды, принимают меры по обогащению ее кислородом, максимально разрежают плотности посадки рыбы и плотность загрузки инкубационных аппаратов икрой (для нерки - не более 100 тыс. икринок на м 2 ).

7.6.5. Своевременно проводят антипаразитарные обработки, уделяя особое внимание борьбе с кровососущими паразитами.

7.6.6. Расположенные на открытом воздухе пруды и бассейны с рыбой затягивают сетью для защиты от рыбоядных птиц.

7.6.7. Строго соблюдают режим выращивания рыб, уменьшая влияние техногенных стрессов.

7.6.8. Обеспечивают кормление рыб полноценными, сбалансированными кормами. Весной - в период наибольшего риска возникновения заболевания, - корма обогащают аскорбиновой кислотой (витамин С) или используют ее производное - аскорбат-монофосфат или -полифосфат. Аскорбиновую кислоту вводят в корм из расчета 1-2 г/кг, фосфаты кислоты - 50 мг/кг. Таким кормом кормят рыбу на протяжении 2-4 месяцев.

При возможности повышают температуру воды у годовиков и более старших рыб до 15-16° и до 18-20°С у мальков и сеголетков.

7.6.9. Стадо ремонта и производителей формируют из рыб, не заболевших в период эпизоотии и обладающих повышенной устойчивостью к заболеванию. Целесообразно переходить на выращивание рыб более устойчивых к ИНГТ видов (кижуч, гольцы, лосось Кларка, кумжа). Их завоз в хозяйство осуществляют по согласованию с органами государственной ветеринарной службы.

7.6.10. Рекомендуется проводить индивидуальное тестирование производителей на вирусоносительство путем отбора во время нерестовой кампании половых продуктов и их вирусологического исследования. Икра рыб, из половых продуктов которых был изолирован вирус, и сами производители выбраковываются и уничтожаются.

7.7. Независимо от метода оздоровления карантин с хозяйства снимается и оно объявляется благополучным, если в течение 12 месяцев наблюдения у рыб не отмечали характерных для ИНГТ клинических признаков и патологоанатомических изменений, а двукратные вирусологические исследования (см. п. 7.4.8.) дали отрицательный результат.

С утверждением настоящей Инструкции утрачивает силу "Временная инструкция о мероприятиях по профилактике и мерам борьбы с инфекционным некрозом гемопоэтической ткани лососевых рыб", утвержденная ГУВ МСХ СССР 20.03.81, № 115-6а.

На правах рукописи

ДОРОНИН Максим Игоревич

ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Мудрак Наталья Станиславовна

Официальные оппоненты: Грищенко Леонид Иванович -

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

кандидат биологических наук Жбанова Татьяна Валентиновна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1 Актуальность темы исследования. Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) - высококонтагиозное вирусное заболевание лососевых рыб, которое встречается как в пресноводной, так и в морской аквакультуре [21]. Болезнь протекает по типу эпизоотии, характеризуется развитием септического процесса с тяжелым поражением органов гемопоэза и приводит к массовой гибели рыбы (смертность молоди приближается к 100%) [10,22]. Распространение вируса наносит значительный экономический ущерб, который складывается из затрат на проведение ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий, убоя всей рыбы на территории очага болезни и ограничений в торговле [19, 22]. В связи с большим количеством рыбопосадочного материала, поставляемого из стран, не благополучных по вирусным болезням рыб (США, Канада, страны Скандинавского п-ва и Юго-Восточной Азии), возрастает актуальность проведения экспрессных диагностических исследований в рамках мониторинга по вирусным заболеваниям аквакультуры, в частности по ИНГТ [19].

Возбудитель принадлежит к порядку Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, роду Novirhabdo virus. Геном представлен несегментированной одноцепочечной негативной РНК длиной около 11000 нуклеотидов и кодирует N-, Р-, M-, G-, NV- и L-белки [19].

Впервые заболевание было зарегистрировано в 1953 г. на рыбозаводах США, а затем в Канаде и на Аляске. В семидесятые годы болезнь появилась в Западной Европе, Юго-Восточной Азии и Японии. В Российской Федерации вспышки ИНГТ регистрируют с 2000 г. [7, 12, 19, 22]. По данным Всемирной организации здравоохранения животных (МЭБ, OIE), в течение последних 15 лет в различных странах мира было зарегистрировано около 100 вспышек ИНГТ. Данная инфекция включена в список заболеваний, обязательно декларируемых в МЭБ [19]. В настоящее время Приказом Минсельхоза РФ № 476 от 19.12.2011 г. ИНГТ отнесен к перечню заразных и особо опасных болезней, по которым устанавливается карантин, что предусматривает проведение масштабного эпизоотологического мониторинга данного заболевания.

Согласно Руководству МЭБ, лабораторная диагностика ИНГТ предусматривает выделение вируса в чувствительных клеточных линиях, серологическую идентификацию вируса с помощью ИФА и РИФ, а также выявление РНК вируса ИНГТ в ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ [19]. Применение этих методов предполагает высокие требования к лабораторному персоналу, закупку зарубежных коммерческих наборов и оборудования, что существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественное рыбоводство зависимым от импортных поставок.

В связи с этим разработка экспресс-методов для дополнения существующей схемы диагностики ИНГТ на основе высокочувствительных и специфичных тест-систем, позволяющих упрощать проведение анализа, является актуальной задачей. К одним из таких методов относится реакция агглютинации латекса (РАЛ), используемая для диагностики бешенства, герпеса, сальмонеллеза, листериоза, микоплазмоза и других инфекционных заболеваний. Метод является бесприборным, экспрессным и простым в исполнении, достаточно чувствительным и специфичным. Стоимость исследования значительно ниже по сравнению с другими диагностическими тестами. Учитывая эти преимущества перед другими методами, РАЛ может найти применение в лабораториях рыбохозяйств для проведения скрининговых исследований.

Использование формата реакции ОТ-ПЦР-РВ для одновременного выявления в патологическом материале нескольких возбудителей с применением ПЦР-чипов позволит создать диагностическую тест-систему нового поколения с высокой аналитической и диагностической чувствительностью и специфичностью. За счет снижения количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа по сравнению с классическим вариантом ОТ-ПЦР, совмещения в микрореакторе чипа обратной транскрипции и ПЦР и оптимизации режима термоциклирования сократится время проведения анализа.

Таким образом, применение РАЛ и метода ОТ-ПЦР-РВ с использованием диагностических ПЦР-чипов для проведения скрининговых исследований на ИНГТ даст возможность выявлять возбудителя на ранних стадиях заболевания. Следовательно, разработка экспресс-методов выявления вируса ИНГТ лососевых рыб для дополнения существующей схемы диагностики является актуальной.

1.2 Степень разработанности проблемы. Для изучения структуры и свойств возбудителя ИНГТ были исследованы различные изоляты вируса, выделенные на территории Северной Америки, Европы и Азии. На основе анализа отличий генов N и в были определены 5 генетических групп вируса ИНГТ [13]. Применяя моноклональные антитела к гликопротеину и нуклеопротеину вируса ИНГТ, была проведена серологическая дифференциация его штаммов [14, 21]. Изучена цитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и изучена их чувствительность к некоторым вирусам лососевых [4, 11]. Изоляты вируса были адаптированы к различным клеточным линиям рыб (ЕРС, ЯТО-2 и др.) [1,4, 19].

Были разработаны разные варианты ОТ-ПЦР для выявления вируса ИНГТ. Предложены системы ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения вируса ИНГТ [8, 20, 23]. Разработаны системы мультиплекс-ПЦР и мультиплекс-ПЦР-РВ с целью выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ИНПЖ [17, 24]. ОТ-ПЦР-РВ возможно проводить не только в пробирке, но и в микрореакторах чипа, на гидрофильном дне которых адсорбирована смесь компонентов для одновременного проведения обратной

транскрипции и ПЦР, что позволяет при оптимизации режима термоциклирования сокращать время проведения анализа. В нашей стране в таком формате разработаны коммерческие тест-системы, позволяющие выявлять возбудителей некоторых вирусных и бактериальных болезней птиц и КРС [25]. Сведения о разработке метода ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вируса ИНГТ отсутствуют.

1.3 Цели и задачи исследований. Основная цель данных исследований заключалась в разработке экспресс-методов, позволяющих выявлять вирус ИНГТ в патологическом материале рыб. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

а) подобрать оптимальные условия для получения культурального антигена вируса ИНГТ;

б) получить поликлональные и моноклональные антитела к антигенам вируса ИНГТ и дать им характеристику;

в) оптимизировать параметры получения латексных диагностикумов и разработать экспресс-метод РАЛ для выявления вируса ИНГТ в патологическом материале лососевых рыб с использованием поликлональных и моноклональных антител;

г) разработать экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вируса ИНГТ;

д) провести апробацию разработанных методов при диагностических исследованиях полевого материала в рамках мониторинга в ряде регионов РФ в 2014-2015 гг.

1.4 Научная новизна результатов исследований. Подобраны оптимальные условия для получения культурального антигена вируса ИНГТ. Предложена методика вирусвыделения из патологического материала рыб одновременно в нескольких чувствительных культурах клеток с определением титра накопления вируса. Определены оптимальные параметры получения латексных препаратов, впервые разработан экспресс-метод РАЛ для выявления вируса ИНГТ в патологическом материале лососевых рыб с использованием поликлональных и моноклональных

антител. Впервые разработан экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ в формате диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов ИНГТ, вирусной геморрагической септицемии (ВГС) и весенней виремии карпа (ВВК) в пробах патологического материала рыб. Проведена апробация разработанных методов РАЛ и ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов при диагностических исследованиях полевого материала на вирусные заболевания рыб в рамках мониторинга в ряде регионов РФ в 2014-2015 гг.

Получены 18 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вируса ИНГТ. Проведена оценка чувствительности и специфичности связывания полученных антител с белками вируса ИНГТ в ИФА и вестерн-блот-анализе. Для разработки диагностических тест-систем использовали моноклональные антитела, специфичные к в- и Ы-белкам вируса ИНГТ, с активностью в двойном сэндвич-варианте ИФА 1:192000 и 1:384000, соответственно.

Определены оптимальные условия синтеза и хранения латексных диагностикумов с разными функциональными группами в процессе физической и химической адсорбции антител, специфичных к вирусу ИНГТ. Разработан экспресс-метод РАЛ (реакция агглютинации латекса) для выявления вируса ИНГТ с использованием полученных моноклональных и поликлональных антител. Оценены диагностические характеристики полученных латексных препаратов.

Разработан экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов рыб. Предложены оригинальные системы праймеров и зонды, а также оптимизированы режимы термоциклирования для каждой тест-системы. Разработаны тест-системы с высокими показателями эффективности амплификации, аналитической и диагностической чувствительности и специфичности.

1.6 Методология и методы исследования. Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование, анализ нуклеотидных последовательностей), вирусологические (вирусвыделение, культивирование вируса) и серологические (ИФА, РИФ, РАЛ) методы исследований.

1.7 Положения, выносимые на защиту:

а) метод вирусвыделения из патологического материала рыб одновременно в клеточных линиях RTG-2, EPC, FHM с определением титра накопления вируса; оптимальные условия для получения культурального антигена вируса ИНГТ;

б) получение 18 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вируса ИНГТ, и их характеристика для разработки диагностических тест-систем;

в) тест-системы на основе экспресс-метода РАЛ для выявления вируса ИНГТ лососевых с применением поликлональных и моноклональных антител;

г) экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов рыб;

д) результаты апробации разработанных методов при диагностических исследованиях полевого материала из ряда регионов РФ в 2014-2015 гг.

1.9 Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБУ

1.10 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 статьи в изданиях, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

1.11 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения; иллюстрирована 30 таблицами и 13 рисунками. Список использованной литературы включает 164 источника, из них 112 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Животные. Для получения моноклональных и поликлональных антител к антигену вируса ИНГТ использовали клинически здоровых кроликов массой 1500 г и мышей массой 15-60 г.

Диагностические специфические препараты: поликлональные антитела против иммуноглобулинов кролика и мыши, меченные пероксидазой (рабочее разведение 1:3000) (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея, г. Москва); моноклональные антитела диагностические против антигенов вируса ИНГТ (получены совместно с ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея, г. Москва).

Получение моноклональных антител. Работу проводили совместно с научными сотрудниками ФГБУН ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва). Для иммунизации использовали мышей линии BALB/c, от которых получали лимфоциты. Гибридизацию лимфоцитов проводили с клетками миеломы SP 2/0 по методу Колера и Милыптейна [15]. Полученные гибридомы вводили в брюшную полость мышей, спустя 3 недели отбирали асцитную жидкость, из которой методом высаливания выделяли моноклональные антитела.

Электрофорез и иммуноблоттинг. SDS-ПААГ-электрофорез вируса ИНГТ проводили по методу Лэммли [16]. Белки вируса ИНГТ вместе с полоской геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану ВА-85. Эффективность переноса белков из геля на мембрану проверяли окрашиванием мембраны 0,125% раствором красителя Coomassie blue. Неспецифическое связывание на репликах блокировали обработкой их 1% BSA в трис-солевом буферном растворе с добавлением 0,1% Tween-20 (TBST). После блокирования проводили инкубирование моноклональных антител (5 мкг/мл) с мембраной в течение ночи при комнатной температуре. После промывания мембраны для удаления несвязавшихся антител ее выдерживали в меченных пероксидазой хрена антителах к мышиным иммуноглобулинам (рабочее разведение 1:3000). В качестве хроматогена использовали смесь 4-хлорнафтола с 1% перекисью водорода.

Постановка твердофазного непрямого варианта иммуноферментного анализа. Для определения активности сывороток и асцитов, а также концентрации выделенных антител к антигенам вируса ИНГТ проводили ТФ непрямой вариант ИФА согласно методике, описанной Апасовой Л. Ю. [2].

Синтез латексных диагностикумов. Латексные препараты готовили по стандартной схеме, описанной Molina-Bolivar J.А. [18]. В качестве компонента для дополнительного связывания антител с поверхностью латекса применяли 1% стрептококковый белок А. Химическую адсорбцию биолиганда проводили с использованием 1% глутаральдегида. Для сохранения высокой коллоидной стабильности полученных латексных диагностикумов использовали (2-оксиэтил)-триметиламмоний хлорид.

Определение степени адсорбции антител на поверхности латекса. Степень сенсибилизации латексов определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм и в ТФ непрямом варианте ИФА. Процент адсорбции антител на поверхности латексных частиц рассчитывали по формуле:

, jiOHaesrpiCTt яятитаа после uro^ten,. . „„„,

кгнзигграаяя аягиты ло исзрггш

Статистическая обработка результатов исследований. Статистическая обработка включала расчеты средних арифметических значений, достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фишера, обработку результатов с использованием пакета прикладных программ StatSoft (версия 6.0) и Microsoft Excel 2010, а также методов, приведенных в руководствах Сошниковой Л.А. и др. [9].

2.2 Результаты собственных исследований

Поиск оптимальных условий для получения культурального антигена вируса ИНГТ. Разработка экспресс-методов выявления вируса ИНГТ предполагала необходимость оптимизации условий и поиска источника для получения культурального антигена вируса ИНГТ. С этой целью проводили поиск клеточной линии рыб, наиболее чувствительной к вирусу ИНГТ. При этом также оценивали стабильность его культуральных свойств. Для этого осуществляли культивирование

Штамм/изолят вируса ИНГТ Культура клеток Титр инфекционной активности вируса, ^ ТЦДя/см3

1 пассаж 3 пассаж 5 пассаж 8 пассаж 10 пассаж 15 пассаж

ЕРС 4,85±0,13 5,42±0,15 5,88±0,17 6,34±0,13 7,01 ±0,16 7,13±0,14

РНМ 4,82±0,13 5,36±0,17 5,79±0,14 6,29±0,13 6,93±0,20 7,05±0,14