Вирусы и бактериофаги использование в биотехнологии

Термин "вектор" применяется в науке обычно в тех случаях, когда надо подчеркнуть существование определённого направления.

Так что уже по смыслу термина можно понять, что биологические векторы направляют искуственно внедрённую в них ДНК в интактные клетки-мишени. Для введения небольшого количества ДНК в бактериальные прокариотические безядерные клетки обычно используют плазмиды (мелкие кольцевые ДНК), и этот процесс совершается с помощью хлорида кальция (CaCl2). Такая плазмидная система биовекторов работает очень хорошо лишь для небольшого количества генетического материала, т.к. сами плзмиды - это небольшие молекулы. Плазмидные векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК, размеры которых не превышают 10 т.п.н. А вот для более крупных генов уже требуются другие векторы.

Биологические (биотехнологические) векторы – это биологические структуры, способные вносить чужеродный генетический материал в клетку. К ним относятся: 1) плазмиды, 2) бактериофаги, 3) вирусы.

Эти биовекторы используются для внедрения в чужую клетку искусственно изменённой ДНК, которая называется рекомбинантной.

Например, рекомбинантной ДНК называют плазмиду, в которую встроен участок ДНК, чужеродной для бактерии.

Плазмиды (эписомы) - это отдельные кольцевые молекулы ДНК у бактерий, которые определяют внехромосомную наследственность бактериальной клетки и предсталяют собой генетический элемент, способный к длительному автономному существованию и репликации. Обычно это двухцепочечная кольцевая ДНК длиной 1-200 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов).

Количество плазмид у бактерии может быть разное, и чем больше плазмид, тем они мельче.

Плазмиды передают генетическую информацию от "своих" бактерий всем другим бактериям, даже если эти бактерии относятся к другим семействам. Какие же свойства придают плазмиды своим хозяевам-бактериям? Они содержат информацию о ферментах, обеспечивающих приспособление к использованию конкретного субстрата (вещества) в качестве источника питания или о ферментах, обеспечивающих устойчивость бактерий к различным неблагоприятным факторам среды: антибиотикам, ксенобиоикам и прочим.

Обычно плазмиды захватываются бактериями из окружающей среды и используются ими уже в качестве своих собственных дополнительных источников генетической информации.

Т.к. захват плазмид из окружающей среды является для бактерий обычным делом, то плазмиды используются в биотехнологии в качестве векторов: в них встраивают нужные людям гены и таким образом эти гены вместе с плазмидой внедряются в бактерию и начинают в ней действовать.

Видео: Получение плазмид

Видео: Перенос гена в бактерию с помощью плазмиды

В качестве векторов в биотехнологии используются не только плазмиды, но также вирусы и бактериофаги.

Бактериофаги как биовекторы

Особенно удачный вектор был сконструирован на основе такого бактериофага, как колифаг λ.
Фаг λ — умеренный колифаг с длинным несократительным хвостовым отростком и днДНК-геномом (т.е. двунитевой дезоксирибонуклеиновой кислотой) размером 48502 п.н. (пар нуклеотидов). Центральная часть генома фага несущественна для его функционирования и используется для заместительной вставки клонируемой ДНК по единственному сайту узнавания для рестриктазы EcoRI. Сам по себе этот вектор слишком короток для упаковки в головку фага. И тут важно, что размеры головки накладывают ограничение не только на максимальную, но и на минимальную длину генома. А это означает, что укороченная рестриктазой ДНК фага уже не сможет занять его головку. Таким образом, чтобы получить фаг, способный размножаться с образованием зрелых фаговых частиц, в разрезанный родительский вектор обязательно должен быть встроен навязанный фагу фрагмент чужеродной ДНК. Это обстоятельство приводит к образованию автоматической селективной системы для отбора химерных фаговых геномов.

Для удобства отбора рекомбинантных фагов в несущественную область генома, используемую для вставки, вводят ген lacZ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет.

Фаг M13 — нитевидный колифаг, имеющий кольцевой онДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Использование векторов на основе фага M13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага M13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК.
Попытка объединить преимущества плазмидных и фаговых векторов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (cos — сайтами), отвечающими за Упаковку ДНК фага λ в фаговой частице. Такие векторы могут существовать в бактерии в виде плазмид, но могут быть выделены в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. Ценность космидных векторов заключается в их большой емкости — то есть в возможности клонирования вставок большого размера. На длину этих векторов также накладываются ограничения, обусловленные размером головки фага, но в таком геноме не обязательно присутствие генов, необходимых для литического цикла.

Видео: Бактериофаг

Видео: Внедрение ДНК бактериофага в бактерию

Рисунок: Перенос генетического материала у бактерий с помощью плазмид

Когда в 1930-х гг. группа ученых занялась проблемами функционирования живых систем, то в поиске простейших моделей они обратили внимание на бактериофаги – вирусы бактерий. Ведь среди биологических объектов нет ничего проще, чем бактериофаги, к тому же их можно легко и быстро выращивать и анализировать, а вирусные генетические программы невелики.

Фаг – это минимального размера природная структура, содержащая плотно упакованную генетическую программу (ДНК или РНК), в которой нет ничего лишнего. Эта программа заключена в белковую оболочку, снабженную минимальным набором устройств для ее доставки внутрь бактериальной клетки. Бактериофаги не могут размножаться сами по себе, и в этом смысле их нельзя считать полноценными живыми объектами. Их гены начинают работать только в бактерии, используя имеющиеся в бактериальной клетке биосинтетические системы и запасы молекул, необходимых для синтеза. Однако генетические программы этих вирусов принципиально не отличаются от программ более сложных организмов, поэтому эксперименты с бактериофагами позволили установить основополагающие принципы устройства и работы генома.

В дальнейшем эти знания и разработанные в ходе исследований методы стали фундаментом для развития биологической и медицинской науки, а также широкого спектра биотехнологических приложений.

Борцы с патогенами

Первые попытки использовать бактериофаги для лечения инфекционных заболеваний были предприняты практически сразу после их открытия, однако недостаток знаний и несовершенные биотехнологии того времени не позволили достичь полного успеха. Тем не менее дальнейшая клиническая практика показала принципиальную возможность успешного применения бактериофагов при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, при острых гнойно-септических состояниях больных, для лечения хирургических инфекций и т. д.

По сравнению с антибиотиками бактериофаги имеют ряд преимуществ: они не вызывают побочных эффектов, к тому же строго специфичны для определенных видов бактерий, поэтому при их использовании не нарушается нормальный микробиом человека. Однако такая высокая избирательность создает и проблемы: чтобы успешно лечить пациента, нужно точно знать инфекционный агент и подбирать бактериофаг индивидуально.

Бактериофагами лечат инфекционные болезни не только людей, но и домашних и сельскохозяйственных животных: мастит у коров, колибактериоз и эшерихиоз у телят и свиней, сальмонеллез у кур. Особенно удобно применять фаговые препараты в случае аквакультуры – для лечения промышленно выращиваемых рыб и креветок, так как в воде они долго сохраняются. Бактериофаги помогают защитить и растения, хотя применение фаговых технологий в этом случае затруднено из-за воздействия природных факторов, таких как солнечный свет и дождь, губительных для вирусов.

Фаги могут сыграть большую роль в поддержании микробиологической безопасности продуктов питания, так как применение антибиотиков и химических агентов в пищевой отрасли, не решает эту проблему, одновременно снижая уровень экологической чистоты продукции. О серьезности самой проблемы говорят статистические данные: например, в США и России ежегодно регистрируется до 40 тыс. заболевших сальмонеллезом, из которых 1 % умирает. Распространение этой инфекции в значительной степени связано с выращиванием, переработкой и потреблением различных видов птицы, и попытки применить для борьбы с ней бактериофаги дали многообещающие результаты.

Так, американская компания Intralytix производит фаговые препараты для борьбы с листериозом, cальмонеллезом и бактериальным загрязнением кишечной палочкой. Они разрешены к применению как добавки, предотвращающие размножение бактерий на продуктах питания – их распыляют на продукты из мяса и домашней птицы, а также на овощи и фрукты. Эксперименты показали, что коктейль из бактериофагов может быть успешно применен и при транспортировке и реализации живой прудовой рыбы для снижения бактериального загрязнения не только воды, но и самой рыбы.

Очевидным применением бактериофагов является дезинфекция, т. е. уничтожение бактерий в тех местах, где их не должно быть: в больницах, на пищевых производствах и т. п. Для этой цели британская компания Fixed-Phage разработала метод фиксации фаговых препаратов на поверхностях, обеспечивающий сохранение биологической активности фагов до трех лет.

Семь дней творения

Современные методы синтетической биологии позволяют не только вносить различные модификации в фаговые геномы, но и создавать полностью искусственные активные фаги. Технологически это несложно, нужно только синтезировать фаговый геном и ввести его в бактериальную клетку, а там он уже сам запустит все процессы, необходимые для синтеза белков и сборки новых фаговых частиц. В современных лабораториях на эту работу уйдет всего несколько дней.

Генетические модификации применяют, чтобы изменить специфичность фагов и повысить эффективность их терапевтического действия. Для этого наиболее агрессивные фаги снабжают узнающими структурами, связывающими их с целевыми бактериями. Также в вирусные геномы дополнительно встраивают гены, кодирующие токсические для бактерий белки, нарушающие метаболизм, – такие фаги более смертоносны для бактерий.

Универсальный способ защиты бактерий от всех внешних воздействий – так называемые биофильмы, пленки из ДНК, полисахаридов и белков, которые бактерии создают совместными усилиями и куда не проникают ни антибиотики, ни терапевтические белки. Такие биопленки – головная боль врачей, так как они способствуют разрушению зубной эмали, образуются на поверхности имплантов, катетеров, искусственных суставов, а также в дыхательных путях, на поверхности кожи и т. п. Для борьбы с биофильмами были сконструированы особые бактериофаги, содержащие ген, кодирующий специальный литический фермент, разрушающий бактериальные полимеры.

Фаговые антибиотики

В терапевтических целях фаги необязательно использовать напрямую. За миллионы лет эволюции бактериофаги разработали арсенал специфических белков – инструментов для распознавания целевых микроорганизмов и манипуляций с биополимерами жертвы, на основе которых можно создавать противобактериальные препараты. Наиболее перспективными белками такого типа являются ферменты эндолизины, которые фаги используют для разрушения клеточной стенки при выходе из бактерии. Сами по себе эти вещества являются мощными антибактериальными средствами, нетоксичными для человека. Эффективность и направленность их действия можно повысить, изменив в них адресующие структуры – белки, специфически связывающиеся с определенными бактериями.

Большинство бактерий делятся по устройству клеточной стенки на грамположительные, мембрана которых покрыта очень толстым слоем пептидогликанов, и грамотрицательные, у которых слой пептидогликана расположен между двумя мембранами. Использование природных эндолизинов особенно эффективно в случае грамположительных бактерий (стафилококков, стрептококков и др.), поскольку пептидогликановый слой у них расположен снаружи. Грамотрицательные бактерии (cинегнойная палочка, сальмонеллы, кишечная палочка и др.) являются менее доступной мишенью, поскольку ферменту, чтобы добраться до внутреннего пептидогликанового слоя, необходимо проникнуть сквозь внешнюю бактериальную мембрану.

Для преодоления этой проблемы были созданы так называемые артилизины – модифицированные варианты природных эндолизинов, содержащие поликатионные или амфипатические пептиды, которые дестабилизируют внешнюю мембрану и обеспечивают доставку эндолизина непосредственно к пептидогликановому слою. Артилизины обладают высокой бактерицидной активностью и уже показали свою эффективность при лечении отитов у собак (Briers et al., 2014).

Примером модифицированного эндолизина, избирательно действующего на определенные бактерии, является препарат P128 канадской компании GangaGen, Inc. Он представляет собой биологически активный фрагмент эндолизина, соединенный с лизостафином – адресующей белковой молекулой, которая связывается с поверхностью клеток стафилококков. Полученный химерный белок обладает высокой активностью против разных штаммов стафилококка, в том числе обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

Анализируя размножение фагов в присутствии целевых бактерий, можно количественно определить численность последних. Так как количество фаговых частиц в растворе возрастет пропорционально числу содержавшихся в нем бактериальных клеток, то для оценки численности бактерий достаточно определить титр бактериофага.

Специфичность и чувствительность такой аналитической реакции достаточно высока, а сами процедуры просты в исполнении и не требуют сложного оборудования. Важно, что диагностические системы, основанные на бактериофагах, сигнализируют о наличии именно живого патогена, тогда как другие методы, такие как ПЦР и иммуно-аналитические, свидетельствуют лишь о наличии биополимеров, принадлежащих этой бактерии. Такого типа диагностические методы особенно удобны для использования в экологических исследованиях, а также в пищевой индустрии и сельском хозяйстве.

Вероятно, с помощью модифицированных фагов удастся решить и давнюю задачу глобальной важности – разработать дешевые и быстрые методы детекции возбудителей туберкулеза на ранней стадии заболевания. Задача эта очень сложна, поскольку микобактерии, вызывающие туберкулез, отличаются крайне медленным ростом при культивировании в лабораторных условиях. Поэтому диагностика заболевания традиционными методами может затягиваться на срок до нескольких недель.

Фаговая технология позволяет упростить эту задачу. Суть ее в том, что к образцам анализируемой крови добавляют бактериофаг D29, способный поражать широкий спектр микобактерий. Затем бактериофаги отделяют, и образец перемешивают с быстрорастущей непатогенной культурой микобактерий, также чувствительной к этому бактериофагу. Если в крови первоначально имелись микобактерии, которые были инфицированы фагами, то в новой культуре будет также наблюдаться наработка бактериофага. Таким образом можно выявить единичные клетки микобактерий, а сам процесс диагностики с 2—3 недель сокращается до 2—5 дней (Swift & Rees, 2016).

Фаговый дисплей

Из экспериментов Смита последовало два важных вывода: во-первых, используя технологию рекомбинантных ДНК, можно создавать огромные по разнообразию популяции численностью 10 6 –10 14 фаговых частиц, каждая из которых несет на своей поверхности разные варианты белков. Такие популяции назвали комбинаторные фаговые библиотеки. Во-вторых, выделив из популяции конкретный фаг (например, обладающий способностью связываться с определенным белком или органической молекулой), можно этот фаг размножить в бактериальных клетках и получить неограниченное число потомков с заданными свойствами.

На сегодня можно выделить два основных направления применения фагового дисплея. Технология на основе пептидов используется для исследования рецепторов и картирования сайтов связывания антител, создания иммуногенов и нановакцин, а также картирования сайтов связывания субстратов у белков-ферментов. Технология на основе белков и белковых доменов – для отбора антител с заданными свойствами, изучения белок-лигандных взаимодействий, скрининга экспрессируемых фрагментов комплементарной ДНК и направленных модификаций белков.

С помощью фагового дисплея можно вносить узнающие группировки во все виды поверхностных вирусных белков, а также в основной белок, формирующий тело бактериофага. Вводя в поверхностные белки пептиды с заданными свойствами, можно получить целый спектр ценных биотехнологических продуктов. Например, если этот пептид будет имитировать белок опасного вируса или бактерии, узнаваемый иммунной системой, то такой модифицированный бактериофаг представляет собой вакцину, которую можно просто, быстро и безопасно наработать.

Одним из важных применений метода фагового дисплея белков является создание фаговых библиотек рекомбинантных антител, где антигенсвязывающие фрагменты иммуноглобулинов расположены на поверхности фаговых частиц fd или М13. Особый интерес представляют библиотеки антител человека, поскольку такие антитела могут быть использованы в терапии без ограничения. В последние годы только на фармацевтическом рынке США продается около полутора десятка терапевтических антител, сконструированных с использованием этого метода.

Так как вирус представляет собой достаточно жесткую конструкцию с определенным соотношением размерностей, это обстоятельство позволяет использовать его для получения пористых наноструктур с известной площадью поверхности и нужным распределением пор в структуре. Как известно, именно площадь поверхности катализатора является критическим параметром, определяющим его эффективность. А существующие на сегодня технологии формирования на поверхности бактериофагов тончайшего слоя металлов и их оксидов позволяют получать катализаторы с чрезвычайно развитой регулярной поверхностью заданной размерности. (Lee et al., 2012).

Путем покрытия нитчатых фагов золотом и двуокисью индия были получены электрохромные материалы – пористые нанопленки, меняющие цвет при изменении электрического поля, способные реагировать на изменение электрического поля в полтора раза быстрее известных аналогов. Подобного рода материалы перспективны для создания энергосберегающих ультратонких экранных устройств (Nam et al., 2012).

На основе комплексов бактериофага М13, двуокиси титана и одностенных углеродных нанотрубок были также созданы материалы для солнечных батарей (Dang et al., 2011).

Последние годы ознаменовались широкими исследованиями бактериофагов, которые находят себе все новые применения не только в терапии, но и в био- и нанотехнологиях. Их очевидным практическим результатом должно стать возникновение нового мощного направления персонализированной медицины, а также создание целого спектра технологий в пищевой промышленности, ветеринарии, сельском хозяйстве и в производстве современных материалов. Мы ждем, что второе столетие исследований бактериофагов принесет не меньше открытий, чем первое.

Бактериофаги: биология и применение / Ред.: Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир. 2012.

Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир. 1974. 614 с.

Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител // Аcta Naturae. 2009. № 3. C. 6—15.

Mc Grath S., van Sinderen D. Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology. Horizon Scientific Press, 2007.

КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО БИОТЕХНОЛОГИИ Вариант № 8

студент группы 03031052

заочной формы обучения

Распопова марина Александровна

Белгород 2015 г.

Вариант №8

Вопрос №1: Вирусы и бактериофаги. Использование в биотехнологии.

Вирусы – это группа ультрамикроскопических облегантных (строгих) внутриклеточных паразитов, способных размножаться только в клетках живых организмов: многоклеточных и одноклеточных.

Среди микробов вирусы характеризуются наименьшей величиной – они измеряются в нанометрах (нм), и облигатным паразитизмом. Последний признак положен в основу классификации их на вирусы бактерий, или бактериофаги, вирусы растений и вирусы животных; имеются также и вирусы грибов.

Каждый вирион в очищенном виде представляет собой истинный кристалл, который построен из нуклеиновой кислоты и белка, не связанных друг с другом ковалентными связями. Понятие "вирион" относится к интактной вирусной частице (от лат. intactus – нетронутый, неповрежденный), способный к инфицированию или заражению.

Нуклеиновые кислоты – вещества наследственности вирусов. По типу нуклеиновой кислоты их подразделяют на РНК-содержащие вирусы и ДНК-содержащие вирусы. К первым относят все вирусы растений, ко вторым – большинство бактериофагов, ряд вирусов человека и животных (аденовирусы, вирусы герпеса, осповакцины и др.).

Белок структурируется вокруг вирусной нуклеиновой кислоты (генома) в виде оболочки и называется капсидом. Форма вириона определяется его капсидом. Вместе с нуклеиновой кислотой капсид образует нуклеокапсид.

Примерный перечень вирусов включает 17 семейств вирусов позвоночных и 7 семейств вирусов беспозвоночных животных, 10 семейств вирусов бактерий. Описаны 20 родов вирусов растений и 5 родов вирусов грибов. Классификационные схемы вирусов до конца еще не устоявшиеся, к тому же открывают новые для науки вирусы (пример с вирусами эбола, иммунодефицита человека). Представителями ДНК-содержащих вирусов являются вирусы контагиозного моллюска, оспы, герпеса, большинство фагов бактерий; РНК-содержащими являются вирусы растений, вирусы гриппа человека, бешенства, полиомиелита и др.

Вироиды. По молекулярной структуре вироиды представляют собой одноцепочечные, ковалентно замкнутые, кольцевые молекулы РНК, лишенные капсидов. Число нуклеотидов в таких РНК находится в пределах 240-400. По форме вироиды могут быть линейные и кольцевидные, они способны принимать шпилечную, квазидвухцепочечную конформацию (от лат. quasi – якобы, как-будто, почти, близко; conformatio – форма, расположение). Каждый тип вироида содержит уникальный, только ему присущий, особый вид низкомолекулярной РНК. Размеры вироидов находятся в пределах 15 нм. В чувствительных клетках растений-хозяев они сосредоточиваются в ядре, ассоциируясь с ядрышком в виде белково-нуклеинового комплекса, и реплицируются автономно целиком при помощи предшествующих или активированных ферментов хозяина. Вироиды не транслируются. Это подтверждается структурным сходством их между собой и отсутствием у ряда вироидов кодонов-инициаторов. В то же время репликация происходит благодаря транскрипции последовательностей вироидных РНК с РНК-матриц при участии РНК-полимераз.

Бактериофаги переводятся с греческого языка как "пожиратель бактерий". Они относятся к особым представителям царства вирусов, однако в отличие от других видов, бактериофаги умеют использовать бактериальные клетки для размножения.Бактериофаги очень мелкие, неклеточные организмы. Средняя величина одного экземпляра 0,1-0,2 миллимикрона, а проще говоря, миллионные доли миллиметра, что составляет 1/100 часть от клетки обычной бактерии размером около пяти микрон. Внешний вид бактериофагов тоже непривычный. Среди них есть роскошные кристаллы, с четкими гранями, расположенные на ножках, словно космические корабли. Их стенки состоят из белковых молекул, а внутри расположена бесценная генная информация - дезоксирибонуклеиновая кислота и рибонуклеиновая кислота, или же ДНК и РНК. Среда обитания, как и морфология, бактериофагов очень разнообразна. Их можно встретить везде, где обитают бактерии - в земле, воздухе, воде, в атмосферных осадках, на предметах, одежде и еде, на шерсти животных и коже, а также внутри нашего организма.Словом, там, где много микроорганизмов, можно встретить много бактериофагов. Самым излюбленным местом обитания фагов является вода и почва с органическими удобрениями и чернозем.

Использование вирусов и бактериофагов в биотехнологии.

Пожиратели бактерий

Фотография, сделанная с помощью электронного микроскопа,
показывает процесс закрепления бактериофагов (колифагов T1) на поверхности бактерии E. coli .

В конце ХХ века стало ясно, что бактерии безусловно доминируют в биосфере Земли, составляя более 90% ее биомассы. У каждого вида имеется множество специализированных типов вирусов. По предварительным оценкам, число видов бактериофагов составляет около 10 15 . Чтобы понять масштаб этой цифры, можно сказать, что если каждый человек на Земле будет каждый день открывать по одному новому бактериофагу, то на описание всех их понадобится 30 лет.

Бактериофаг – это не живое существо, а молекулярный наномеханизм, созданный природой.
Хвост бактериофага – шприц, который протыкает стенку бактерии и впрыскивает вирусную ДНК,
которая хранится в головке (капсиде), внутрь клетки .

У каждого этапа существует множество нюансов, имеющих глубокий эволюционный и экологический смысл. Ведь бактерии и их вирусные паразиты сосуществуют сотни миллионов, если не миллиарды лет. И эта борьба за выживание не закончилась ни тотальным уничтожением одноклеточных, ни приобретением тотальной устойчивости к фагам и бесконтрольным размножением бактерий.

Помимо постоянного эволюционного соревнования механизмов защиты у бактерий и нападения у вирусов, причиной сложившегося равновесия можно считать и то, что бактериофаги специализировались по своему инфекционному действию. Если имеется крупная колония бактерий, где своих жертв найдут и следующие поколения фагов, то уничтожение бактерий литическими (убивающими, дословно – растворяющими) фагами идет быстро и непрерывно.

Если потенциальных жертв маловато или внешние условия не слишком подходят для эффективного размножения фагов, то преимущество получают фаги с лизогенным циклом развития. В этом случае после внедрения внутрь бактерии ДНК фага не сразу запускает механизм инфекции, а до поры до времени существует внутри клетки в пассивном состоянии, зачастую внедряясь в бактериальный геном.

В таком состоянии профага вирус может существовать долго, проходя вместе с хромосомой бактерии циклы деления клетки. И лишь когда бактерия попадает в благоприятную для размножения среду, активируется литический цикл инфекции. При этом, когда ДНК фага освобождается из бактериальной хромосомы, часто захватываются и соседние участки бактериального генома, а их содержимое в дальнейшем может перенестись в следующую бактерию, которую заразит бактериофаг. Этот процесс (трансдукция генов) считается важнейшим средством переноса информации между прокариотами – организмами без клеточных ядер.

Как действует бактериофаг

Первые попытки лечения фагами дизентерии, раневых инфекций, холеры, тифа и даже чумы были проведены достаточно аккуратно, и успех выглядел вполне убедительно. Но после начала массового выпуска и использования фаговых препаратов эйфория сменилась разочарованием. О том, что такое бактериофаги, как производить, очищать и применять их лекарственные формы, было известно еще очень мало. Достаточно сказать, что по результатам предпринятой в США в конце 1920-х годов проверки во многих промышленных фагопрепаратах собственно бактериофагов вообще не оказалось.

Проблема с антибиотиками

Такие бактерии комфортно существуют в медицинских учреждениях, заселяя сантехнику, мебель, медицинскую аппаратуру, порой даже дезинфицирующие растворы. У людей с ослабленным иммунитетом, каких в больницах большинство, они вызывают тяжелейшие осложнения.

Бактериофаги и иммунитет

Поскольку бактериофагов в природе несметное количество и они постоянно попадают в организм человека с водой, воздухом и пищей, то иммунитет их просто игнорирует. Существует даже гипотеза о симбиозе бактериофагов в кишечнике, регулирующем кишечную микрофлору. Добиться какой-то иммунной реакции можно лишь при длительном введении в организм больших доз фагов.

Но таким образом можно добиться аллергии на почти любые вещества. И наконец, очень важно, что бактериофаги недороги. Разработка и производство препарата, состоящего из точно подобранных бактериофагов с полностью расшифрованными геномами, культивированных по современным биотехнологическим стандартам на определенных штаммах бактерий в химически чистых средах и прошедших высокую очистку, на порядки дешевле, чем современных сложных антибиотиков.

Это позволяет быстро приспосабливать фаготерапевтические препараты к меняющимся наборам патогенных бактерий и применять бактериофаги в ветеринарии, где дорогие лекарства экономически не оправданы.

На медицинской службе

Достоинств у бактериофагов как потенциальных лекарств множество. Прежде всего – это их несметное количество. Хотя изменять генетический аппарат бактериофага тоже намного проще, чем у бактерии, и тем более – у высших организмов, в этом нет необходимости. Всегда можно подобрать что-то подходящее в природе. Речь идет скорее о селекции, закреплении востребованных свойств и размножении нужных бактериофагов.

Это можно сравнить с выведением пород собак – ездовых, сторожевых, охотничьих, гончих, бойцовых, декоративных… Все они при этом остаются собаками, но оптимизированы под определенный вид действий, нужных человеку. Во-вторых, бактериофаги строго специфичны, то есть они уничтожают только определенный вид микробов, не угнетая при этом нормальную микрофлору человека.

Две стороны медали

К сожалению, недостатков у медицинских бактериофагов тоже немало. Самая главная проблема проистекает из достоинства – высокой специфичности фагов. Каждый бактериофаг инфицирует строго определенный тип бактерий, даже не таксономический вид, а ряд более узких разновидностей, штаммов. Условно говоря, как если бы сторожевая собака начинала лаять только на одетых в черные плащи громил двухметрового роста, а на лезущего в дом подростка в шортах никак не реагировала.

Поэтому для нынешних фаговых препаратов нередки случаи неэффективного применения. Препарат, сделанный против определенного набора штаммов и прекрасно лечащий стрептококковую ангину в Смоленске, может оказаться бессильным против по всем признакам такой же ангины в Кемерове. Болезнь та же, вызывается тем же микробом, а штаммы стрептококка в разных регионах оказываются различными.

Для максимально эффективного применения бактериофага необходима точная диагностика патогенного микроба, вплоть до штамма. Самый распространенный сейчас метод диагностики – культуральный посев – занимает много времени и требуемой точности не дает. Быстрые методы – типирование с помощью полимеразной цепной реакции или масс-спектрометрии – внедряются медленно из-за дороговизны аппаратуры и более высоких требований к квалификации лаборантов. В идеале подбор фагов-компонентов лекарственного препарата можно было бы делать против инфекции каждого конкретного пациента, но это дорого и на практике неприемлемо.

Из биологической природы и довольно большого, по сравнению с низкомолекулярными лекарствами (теми же антибиотиками), размера вытекает третье ограничение – проблема доставки бактериофага в организм. Если микробная инфекция развивается там, куда бактериофаг можно приложить напрямую в виде капель, спрея или клизмы, – на коже, открытых ранах, ожогах, слизистых оболочках носоглотки, ушей, глаз, толстого кишечника – то проблем не возникает.

Но если заражение происходит во внутренних органах, ситуация сложнее. Случаи успешного излечения инфекций почек или селезенки при обычном пероральном приеме препарата бактериофага известны. Но сам механизм проникновения относительно крупных (100 нм) фаговых частиц из желудка в кровоток и во внутренние органы изучен плохо и сильно разнится от пациента к пациенту. Бактериофаги бессильны и против тех микробов, которые развиваются внутри клеток, например возбудителей туберкулеза и проказы. Через стенку человеческой клетки бактериофаг пробраться не может.

Нужно отметить, что противопоставлять применение бактериофагов и антибиотиков в медицинских целях не следует. При совместном их действии наблюдается взаимное усиление противобактериального эффекта. Это позволяет, например, снизить дозы антибиотиков до значений, не вызывающих выраженных побочных эффектов. Соответственно, и механизм выработки у бактерий устойчивости к обоим компонентам комбинированного лекарства почти невозможен.

Расширение арсенала противомикробных препаратов дает больше степеней свободы в выборе методики лечения. Таким образом, научно обоснованное развитие концепции применения бактериофагов в противомикробной терапии – перспективное направление. Бактериофаги служат не столько альтернативой, сколько дополнением и усилением в борьбе с инфекциями.

Автор – и.о. зав.лаб. молекулярной биоинженерии Института биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова РАН