Вирус некротической пятнистости бальзамина

Владельцы патента RU 2481392:

Изобретение относится к области биохимии и касается применения шатамма Trichoderma harzianum Rifai в качестве продуцента ингибитора тосповируса некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus. Штамм гриба Trichoderma harzianum Rifai, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180, является продуцентом гомогенного фермента L-лизина-α-оксидазы, который проявляет выраженную противовирусную активность в отношении Impatiens necrotic spot tospovirus. Представленное изобретение может быть направлено на снижение потерь декоративных и овощных культур, вызванных вирусом Impatiens necrotic spot tospovirus. 2 пр.

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в агробиотехнологии, микробиологии и растениеводстве.

В последние годы в Российскую Федерацию из европейских стран ежегодно импортируются сотни тысяч цветочно-декоративных растений, которые могут являться хозяевами тосповируса некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospovirus). В связи с тем что этот вирус имеет чрезвычайно широкий круг растений-хозяев на большинстве декоративных и овощных культур, создается опасность заражения потенциальных растений-хозяев данным вирусом. Вирус некротической пятнистости бальзамина приносит значительные убытки производству декоративных культур во многих Европейских странах.

Impatiens necrotic spot tospovirus причинял большой вред различным видам декоративных и овощных культур, выращиваемых в теплицах на территории Мексики, США и на юге Канады и странах Европы. Потери урожая доходили до 100% (4, 5).

Из уровня техники известен ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа (1) и ингибитор вируса иммунодефицита человека (2), в качестве ингибитора которых использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - гомогенный фермент L-лизин-α-оксидаза.

Также из уровня техники известна возможность использования гена, ингибирующего вирус пятнистости бальзамина путем его введения в растение семейства Бальзаминовых с получением трансгенных растений, устойчивых к такому вирусу (US 6528703 B1, 04.03.2003) - прототип. Однако такая методика является трудоемкой и требует больших финансовых и временных затрат.

Техническим результатом изобретения является снижение потерь декоративных и овощных культур, вызванных вирусом Impatiens necrotic spot tospovirus.

Технический результат достигается тем, что штамм Trichoderma harzianum Rifai является продуцентом ингибитора тосповируса некротической пятнистости бальзамина. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д.1, Институт генетики и селекции, 1987 г.).

Морфолого-биохимическая характеристика штамма

Штамм Trichoderma harzianum Rifai на среде сусло-агар образует колонии быстрорастущие. Мицелий гриба бесцветный, септированный, распростертый. На 4-е - 5-е сутки роста появляются дерновинки с конидиеносцами, подушковидные, сначала белые, со временем желто- или темно-зеленого цвета. Фиалиды бутыльчатые /9-12µ/, расположены мутовками по 3 и более. На каждой фиалиде образуются конидии, склеенные в головку. Конидии гриба округлые, гладкие, мелкие /3-5µ/, в проходящем свете бледно-зеленые, а в массе - темные.

На агаризованной среде Чапека колонии штамма-продуцента быстрорастущие, но слабо спороносящие. Штамм хорошо растет на среде Чапека, однако лучший рост наблюдается на среде сусло-агар. Агар и желатину не разжижает, молоко не пептонизирует. Аэробный гриб. Температурный оптимум +28 - +29°С. На картофельно-декстрозном агаре наблюдается снижение интенсивности роста, образование воздушного мицелия и спороношения. Оптимальные условия роста гриба при рН 4-6, однако может расти и при рН от 1,5 до 9.

Trichoderma harziatum Rifai в одинаковой степени усваивает как аммонийные, так и азотнокислые соли. Лучшим источником азота из органических соединений является пептон. Хорошо растет на средах с аспарагином и с глутаминовой кислотой. Лучшими источниками углерода являются ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, маннит, крахмал. На средах с этими сахарами наблюдается интенсивный рост. Слабо усваиваются спирты метиловый, этиловый, дульцит. Хорошо усваивает в качестве источника углерода пшеничные отруби. Инокулят гриба, выросший на среде с пшеничными отрубями, дает положительный результат при использовании его при ферментации на средах разного состава.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai обладает L-лизин-α-оксидазной активностью. Активность L-лизин-α-оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai рассчитывали по приросту Н ₂ О ₂ , количество которой определяли спектрофотометрическим ортодиазидиновым микрометодом. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции H ₂ O ₂ с O-дианизидингидрохлоридом. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг O-дианизидингидрохлорида и 0,1-0,5 мг белка в 1 мл конечного объема. После 20 минут инкубирования в термостате при температуре +37°С пробы охлаждали до +4°С. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы).

Для оценки чистоты препарата использовали электрофорез в 10% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, а также капиллярный электрофорез на установке Капель 105 производства фирмы Люмекс (Санкт-Петербург).

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (г.Пущино).

Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г.Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и рН.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор - 0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение рН 5.8-6,0 устанавливали 10%-ным раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 л воды в течение 4-х ч, стерилизовали в автоклаве 1 ч при температуре +125°C. Затем подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°С, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину рН в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 ч, конечные значения рН от 5,3 до 7.5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин в течение часа при температуре +2 - +4°С. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в концентрациях 2,5 Ед/мл и 5 Ед/мл. Также был взят контрольный образец кДНК, в который не был добавлен фермент. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации 2,5 Ед/мл и более кДНК вируса разрушается, при этом не наблюдается образования темной полосы.

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в разных концентрациях (1, 0,1, 0,05, 0,025 Ед/мл). Также был взят контрольный образец кДНК без добавления фермента. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации более 1 Ед/мл кДНК вируса разрушалось, при этом не наблюдалось образования темной полосы. При большем разведении фермента вирусная кДНК сохраняется и наблюдается темная полоса.

1. Ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа. Патент РФ №2022012, 1994. Алексеев С.Б, Берёзов Т.Т., Анджапаридзе О.Г. и др.

2. Ингибитор вируса иммунодефицита человека. Патент РФ №2022011, 1994. Алексеев С.Б., Веса B.C., Смирнова И.П. и др.

3. Смирнова И.П., Алексеев С.Б. Биосинтез противоопухолевого фермента L-лизин-α-оксидазы Trichoderma sp. // Антибиотики и химиотерапия. - 2009 - Т.54. - В.5-6. - С.8-11.

4. ОЕРР/ЕРРО (2004). Diagnostic protocol for regulated pests. PM 7/34(1). Tomato spotted wilt tospovirus, Impatiens necrotic spot tospovirus and Watermellon silver mottle tospovirus. Bulletin ОЕРР/ЕРРО Bulletin 34, 271-279.

5. Windham A.S., Hale F., Yanes J. Impatiens necrotic spot virus: a serious pathogen of floral crops (1998). Agricultural Extension Service University of Tennessee. SP370A.

6. Mumford R.A., Barker I., Wood K.R. (1996b) An improved method for the detection of Tospoviruses using the polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods 57, 109-115.

Применение штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного в ВКПМ под №F-180 - в качестве продуцента ингибитора вируса некротической пятнистости бальзамина.

Introduction

Tospovirus is a virus family that includes Impatiens Necrotic Spot Virus (INSV) and Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV). Almost all greenhouse crops are susceptible except for poinsettias and roses; many vegetables are also susceptible. These viruses are spread from plant to plant in greenhouses and in the field by thrips feeding activity. Both Western flower thrips (Frankliniella occidentalis) and onion thrips (Thrips tabaci) are capable of spreading INSV. Seven species of thrips are known vectors for TSWV, including Western flower thrips. Efficient transmission of TSWV by onion thrips appears to be a genetically recessive trait; therefore, some populations of onion thrips can transmit TSWV, while others cannot. Both INSV and TSWV have very broad host ranges. More than 600 plant species are known to be susceptible to INSV. TSWV has the widest known host range of any plant virus, affecting over 800 plant species (as many as 1,000 according to some sources).

Symptoms on Greenhouse Crops

The name of TSWV was derived from the symptoms (spotting followed by wilt) that develop on tomato. Similarly, the name of INSV was derived from symptoms (necrotic ringspots) on Impatiens. On other hosts, ringspots, purple to black lesions on leaves and stems, flower color breaking, stunting, death of terminals, and wilt may occur. The stage of growth can also influence symptom development.

For many hosts, symptoms are not well known or are not described; however, in some commonly infected crops, symptoms can be diagnostic. Gloxinias infected as young plants develop necrosis of the central leaves, resulting in collapse. Older Gloxinias develop necrotic ringspots on the foliage, as well as necrosis along the veins.

Cineraria develops chlorotic ringspots and/or mottling on the upper leaf surface, and purple to black lesions on the veins underneath. On Exacum (persian violet), the virus causes tan to dark brown cankers on stems. Reiger begonias develop necrotic ringspots, mosaic, and necrosis of the leaf veins. Symptoms on Impatiens and New Guinea impatiens include stunting, leaf distortion and blackened spots or rings on foliage and stems. In some cases, terminals will die and the entire plant may collapse. As with other virus diseases infected plants may remain symptomless for a period of time.

Symptoms on Vegetable Crops

In Massachusetts, tospoviruses are most frequently noted on pepper and tomato. On pepper the foliage becomes distorted and the fruit develop circular rings that are slightly indented into the skin. On tomato, foliage becomes spotted and blackened particularly on the inner leaflets toward the top of the plant. The growing point may also become necrotic and the whole plant may wilt. Fruit symptoms are variable. Small necrotic spots to large circular blotches may develop.

Life History

In greenhouses, the most important vector of TSWV and INSV is considered to be the western flower thrips (WFT). The viruses are associated with thrips in a persistent manner. Both viruses may also be spread by vegetative propagation of infected plant material.

WFT can acquire TSWV and INSV only during the larval stages, but once infected, the thrips remains so for the rest of its life. Thrips acquire the viruses after feeding for about 30 minutes on an infected plant. After a latent period of 3-18 days the thrips is capable of transmitting the virus to any susceptible plant it feeds on. Because the larval stages tend to be brief and pupae do not feed, adult thrips are primarily responsible for spreading these viruses. During feeding, saliva is injected into the plant cell and the contents withdrawn. When tospoviruses are present in the saliva, these are transmitted to the plant during the feeding process in as little as 15-30 minutes. Uninfected adult WFT cannot acquire the virus from tospovirus-infected plants because tospoviruses pass right through the gut and do not enter the salivary fluid. Adults do not transmit the virus amongst themselves, and there is no transmission from adults to eggs. Overlapping generations of thrips within a greenhouse may result in continuous virus transmission. In greenhouses tospoviruses can be perpetuated through successive crops and weeds, resulting in losses year-round. Tospoviruses have not been observed to spread significantly in field-planted vegetable crops in Massachusetts, possibly because most thrips species do not compete well in the outdoor environment.

Test Kits to Detect Tospoviruses

On-site test kits can be used to detect the presence of tospoviruses in plants. These are simple to use and are available from Agdia (www.agdia.com). There are separate tests for TSWV and INSV. If a plant is suspected of being infected with a tospovirus, a tissue sample can be collected from those parts of the plant showing symptoms. Even when plants are systemically infected, tospoviruses do not spread evenly throughout the plant, so the careful selection of tissues is crucial to the success of the test. Use a nickel-sized sample from the part of the plant showing symptoms, including green or chlorotic tissues adjacent to the necrotic area.

Another option for detecting tospoviruses is to send a plant sample to a plant disease diagnostic clinic. Samples may be sent to the University of Massachusetts Plant Disease Diagnostic Lab.

One problem with testing for viruses is that some host plant species do not express TSWV or INSV symptoms until long after the initial infection. Cyclamen, for example, can show no symptoms for up to two months after infection.

Management

Plants infected with tospoviruses cannot be cured. Elimination of infected plant material and WFTs are the most important management practices. Newly-acquired plant shipments should be inspected carefully for evidence of thrips and symptoms of virus before being introduced into the greenhouse. Symptomatic plants should be discarded or isolated and the supplier should be notified after laboratory confirmation of the disease. Since various weed species can harbor the viruses, thorough weed control is important. If possible, keep vegetatively propagated plants isolated from those produced from seed. Do not grow vegetable transplants in the same greenhouse with susceptible ornamentals. Thrips populations should be monitored with sticky traps. Since only a small number of infected thrips is necessary to start an epidemic, thorough control of WFT should be the goal.

For more information on the life cycle and management of thrips see the fact sheet:
Western Flower Thrips and Tospovirus

Новости

Луковицы декоративных растений могут быть заражены

В преддверии дачного сезона, когда садоводы начинают активно запасаться семенным и посадочным материалом, Управление Россельхознадзора по Нижегородской области и Республике Марий Эл считает необходимым обратить особое внимание всех заинтересованных лиц на фитосанитарное состояние декоративных луковичных культур, т.к. на данный момент ряд стран, осуществляющих экспорт данной продукции в Российскую Федерацию, не может в полной мере обеспечить и гарантировать её фитосанитарную безопасность.

Согласно Единых карантинных фитосанитарных требований, предъявляемых к подкарантинной продукции и подкарантинным объектам на таможенной границе и на таможенной территории Евразийского экономического союза, утвержденных Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 30.11.2016 № 157, луковицы, клубнелуковицы и корневища декоративных культур должны быть свободны от:

коричнево-мраморного клопа (Halyomorpha halys),

западного цветочного трипса (Frankliniella occidentalis),

трипса Пальма (Thrips palmi)

и должны происходить из зон, мест и (или) участков производства, свободных от:

бледной картофельной нематоды (Globodera pallida),

желтой болезни гиацинта (Xanthomonas campestris pv. hyacinthi),

зебры чип (Candidatus Liberibacter solanacearum),

золотистой картофельной нематоды (Globodera rostochiensis),

колумбийской галловой корневой нематоды (Meloidogyne chitwoodi),

корневой галловой нематоды (Meloidogyne enterolobii),

ложной галловой нематоды (Nacobbus aberrans),

ложной колумбийской галловой нематоды (Meloidogyne fallax),

нематоды-кинжала (Xiphinema rivesi),

неповируса кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus),

неповируса кольцевой пятнистости томата (Tomato ringspot nepovirus),

тосповируса некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot virus),

рака картофеля (Synchytrium endobioticum),

техасской корневой гнили (Phymatotrichopsis omnivore)

На данный момент Россельхознадзором усилен контроль в отношении декоративных луковичных культур – ввоз луковичных культур осуществляется только на основании результатов лабораторной экспертизы в отношении карантинных объектов, характерных для указанной продукции. Однако особое внимание Россельхознадзор обращает на такие карантинные объекты, как неповирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus), неповирус кольцевой пятнистости томата (Tomato ringspot nepovirus), тосповирус некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot virus) и желтую болезнь гиацинта (Xanthomonas campestris pv. Hyacinthi).

Неповирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovirus) – поражает такие растения, как анемона, ирис, пеларгония, тюльпан, дицентра, эхинацея, нарцисс, лилия, лилейник, флокс, хризантема, гербера. Распространен во многих странах Европы, Азии, Африки, Америки, Океании.

Вирус индуцирует болезнь, вызывающую у некоторых культур поражение (отмирание) почек. Верхушечные почки искривляются вниз в виде крючка, позднее остальные почки становятся коричневыми, некротизированными и хрупкими. На других культурах вирус индуцирует симптомы хлоротической кольцевой пятнистости и крапчатости, некрозы и деформации листьев. Также возможно проявление болезни в виде развития на первых листьях ярко-желтой мозаики с последующим уменьшением величины листьев, их деформации, изменением окраски, в итоге растения угнетаются.

Основным путем заноса данного карантинного объекта на территорию РФ является зараженный посадочный и прививочный материал. А т.к. переносчиками заболевания могут быть обитающие в почве нематоды, риск заноса может значительно возрасти при ввозе саженцев с закрытой корневой системой.

Неповирус кольцевой пятнистости томата (Tomato ringspot nepovirus) – поражает такие растения, как пеларгония, гладиолус, орхидея, анемона, ирис, нарцисс, дельфиниум, дицентра, эхинацея, гипсофила, гейхера, хоста, нарцисс, фиалка, лилия, лихнис, бальзамин, календула, хризантема. Распространен во многих странах Европы, Азии, Африки, Америки и в Новой Зеландии.

На различных культурах вирус проявляется по-разному, может вызывать некрозы вегетативных частей, желтую мозаику почек, ямчатость древесины, коричневую линейность, крапчатость листьев и другие.

Распространение вируса происходит вместе как с растениями-хозяевами, так и посадочным материалом в виде частей растений, включая семена.

Т.к. переносчиком вируса могут являться нематоды, обитающие в почве, риски заноса данного карантинного объекта значительно возрастает при ввозе посадочного материала с закрытой корневой системой.

Тосповирус некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot virus) – поражает такие растения, как аллоплектус, алетромерия, амариллис, анемона, антуриум, бальзамин, бегония, броваллия, бромелия, газания, георгин, гербера, гиппеаструм, ирис, кала, лютик, пеларгония, примула, табак декоративный, флокс, фрезия, хоста, хризантема, цинерария, эустома. Распространен в некоторых странах Европы, Америки, в Египте, Иране, Уганде, Китае, Японии и Новой Зеландии.

На различных культурах вирус проявляется по-разному, может вызывать хлоротический рисунок из межжилковых и прижилковых пятен и полос, пластинки листьев, преимущественно на верхушечных побегах, деформируются, может вызывать краевые некрозы светло-коричневого цвета, изменение окраски цветков, появление светло-зеленых или хлоротических колец и/или пятен на листьях, что приводит к быстрому отмиранию растений. Может вызывать некроз центральных листьев, заканчивающийся их опадением, а также кольцевые и прижилковые некрозы.

Т.к. переносчиком вируса является западный (калифорнийский) цветочный трипс, то путями его распространения может быть ввоз зараженной трипсом рассады, а также укорененных растений с листьями, луковиц, клубней, клубнелуковиц и розеток корней, находящихся в стадии вегетации или цветения, черенков и отводков с листьями, срезанных цветков и бутонов, свежих листьев, ветвей для составления букетов и зеленных культур, заселенных западным цветочным трипсом. (Ссылка на трипсов)

Желтая болезнь гиацинта (Xanthomonas campestris pv. Hyacinthi) – карантинная болезнь бактериальной природы. Поражает гиацинт восточный, пролеску, мускари. Распространен в Европе, США, Японии, Австралии. Согласно перечню карантинных объектов, утвержденному приказом Минсельхоза России от 15 декабря 2014 г. N 501, является карантинным объектом, отсутствующим на территории Российской Федерации.

Основным путем проникновения болезни в свободные от данного карантинного объекта зоны – ввоз луковиц с внутренней инфекцией, а также вегетирующие зараженные растения в контейнерах.

Внешние симптомы заболевания обнаруживаются в виде водянистых, просвечивающих желто-коричневых полос, которые появляются вдоль жилок листа. Во влажную погоду бактериальная масса выступает на поверхность растения в виде желтой слизи. Пораженные растения отстают в росте, не цветут, листья их, начиная с верхушек, желтеют, позже становятся коричневыми и засыхают.

Через сосудистую систему возбудитель желтой болезни проникает в чешуи луковиц, на поверхности которых (чаще на их внутренней стороне) вызывает сначала очень мелкие, позднее значительных размеров выпуклые пятна, резко выделяющиеся своей желтой окраской на белой здоровой ткани чешуи.

Сильно пораженные луковицы имеют размягченное, гнилое донце, которое легко прощупывается при надавливании на него пальцем. Растения из таких луковиц или не развиваются совсем, или только выступают из-под поверхности почвы. Концы листьев остаются закрытыми, желтеют и склеиваются бактериальной слизью.

Иногда больные луковицы по внешнему виду не отличаются от здоровых: донце твердое, корни нормально развитые. Однако на продольном разрезе таких луковиц можно заметить участки ткани, окрашенные в характерный желтый цвет.

Луковицы со слабыми признаками заболевания, будучи высажены в грунт, развиваются сначала как нормальные растения, которые затем внезапно останавливаются в росте, дают укороченную цветоножку, цветы на которой раскрываются неравномерно и преждевременно опадают. Бактерии, развиваясь в сосудистых пучках и закупоривая их, прекращают приток воды к листьям, поэтому явление увядания относится к одному из существенных признаков желтой болезни гиацинтов.

Больные растения не всегда погибают, при слабом заражении они могут перенести период вегетации и дать внешне здоровые луковицы, содержащие внутри возбудителя. Подобные луковицы являются источником инфекции в следующем году.

Несмотря на то, что согласно перечню карантинных объектов, утвержденному приказом Минсельхоза России от 15 декабря 2014 г. N 501, описанные вирусные карантинные объекты относятся к ограниченно-распространенным, а желтая болезнь гиацинтов – к отсутствующим на территории Российской Федерации карантинным объектам, Управление Россельхознадзора по Нижегородской области и Республике Марий Эл рекомендует гражданам приобретать луковицы, клубнелуковицы и корневища декоративных культур только при наличии у продавца документов, удостоверяющих их карантинное фитосанитарное состояние, и внимательно осматривать посадочный материал на предмет признаков заражения. От покупок, вызывающих сомнения в их качестве, стоит воздержаться.

Также рекомендуем в случае обнаружения на растениях поражений, сходных по признакам с поражениями карантинными объектами, незамедлительно обратиться в отдел фитосанитарного надзора, семенного контроля и надзора за качеством зерна Управления Россельхознадзора по Нижегородской области и Республике Марий Эл по тел. 435-51-52, 435-51-53, 435-51-41.