Титр вируса в ветеринарии

Мазлум Али, Власова Н.Н., Аронова Е.В., Иголкин А.С. ФГБУ"ВНИИЗЖ", г. Владимир
Кривонос Р.А. департамент ветеринарии Краснодарского края, г. Краснодар
Черных О.Ю. ГБУКК"Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория", г. Кропоткин

Введение. Метод, позволяющий определять количество инфекционных единиц вируса в различных образцах, является необходимым инструментом в вирусологии. В исследовательских лабораториях титр вируса, вызывающего цитопатический эффект в культуре клеток, обычно рассчитывают, исходя из количества пораженных единиц культуры клеток (лунки, флаконы), после внесения в них серийных разведений исходного вируссодержащего материала и выражают в тканевых цитопатических дозах - ТЦД50, если эффект наблюдается у половины инфицированных проб [13].

Использование данного метода требует продолжительного периода времени: от 3 до 10 дней в зависимости от свойств исходного вируса. С появлением новых технологий для определения титра вируса в пробе все чаще применяют метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). По данным Van Guilder HD, Vrana KE, Freeman WM (2008) ПЦР-РВ (или количественная ПЦР) лабораторный метод, основанный на циклической амплификации определенных фрагментов генома, который используется для одновременной индикации возбудителя и измерения количества молекул ДНК. В свою очередь, после проведения соответствующих расчетов его результаты позволяют определить титр вируса в испытуемой пробе [22].

Возбудителем африканской чумы свиней (далее, АЧС) является ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae, рода Asfivirus [2, 3, 8, 12]. Поскольку геном вируса АЧС представлен ДНК, в отличие от детекции геномов РНК-содержащих вирусов, для его обнаружения методом ПЦР-РВ не требуются получения кДНК, что, как минимум, на 1 час сокращает время исследований и составляет с этапом выделения ДНК 2 часа 30 минут.

Для титрования вируса АЧС используют первичные культуры клеток (культура клеток костного мозга свиней, культура лейкоцитов свиней, альвеолярных макрофагов свиней, почек свиней и селезенки свиньи), обладающие высокой чувствительностью [3, 4].

При культивировании в первичных культурах клеток свиньи вирус АЧС вызывает специфическую гемадсорбцию и оказывает цитопатогенное воздействие. Постановка реакции гемадсорбции (РГАд) является наиболее специфичным и чувствительным методом идентификации вируса АЧС, поскольку ни один из вирусов, поражающих свиней, не вызывает проявления гемадсорбции. Согласно рекомендации МЭБ, РГАд используется в качестве референтной методики выявления вируса АЧС, несмотря на трудоемкость постановки и продолжительность реакции (5-7 дней) [3, 4, 16, 20].

Исходя из вышеизложенного, при выполнении ряда лабораторных исследований и определении количества вируса в пробе в определенных случаях целесообразно заменить традиционные методы и использовать такие технологии, как ПЦР-РВ для проведения быстрого и эффективного анализа уровня накопления вируса.

Порогового значение цикла (Ct), фиксируемое в результате ПЦР-РВ, дает точные и воспроизводимые результаты с низкими стандартными отклонениями [21, 22].

Кроме того, ПЦР-РВ позволяет проводить абсолютную количественную оценку содержания нуклеиновых кислот в пробе при наличии референтной матрицы ДНК с известной концентрацией и количеством копий [24].

К другим преимуществам ПЦР-РВ относится быстрая и эффективная возможность сравнения и качественной оценки исследуемых образцов.

Так, в зарубежной литературе представлен ряд работ, в которых 4 демонстрируется определение вирулентности вируса по его содержанию в крови, отмечая, что скорость изменения С (соответственно, скорость увеличения титра в крови) у аттенуированного вируса ниже, чем у вирулентного [14, 18].

В своей работе Lacasta Anna et al. показали, что у животных, инфицированных аттенуированным штаммом вируса АЧС, наблюдалась более поздняя регистрация вирусной ДНК. Они выявляли вирус в назальных экскретах и крови только на 7-й день после инфицирования, причем, титр накопления вируса был в среднем ниже на 4-5 lg, чем у свиней, инфицированных вирулентным штаммом E75, и не превышал значений 104-5 ГАдЕ50/мл [18].

В другой работе Lewis T. et. al. показали, что делеция гена 9GL у вируса АЧС изолята Malawi Lil-20/1 (MAL) влияет на созревание ви-риона и репродукцию вируса в макрофагах и ослабляет вирусную инфекцию у свиней. Животные, инфицированные этим аттенуированным изолятом, оставались клинически здоровыми и демонстрировали увеличение значения Ot, выявляемое в ПЦР-РВ, что соответствовало снижению титра вируса в крови в 100-10 000 раз по сравнению с неделетированным изолятом Malawi Lil-20/1 [14].

Использование ПЦР-РВ в диагностике АЧС имеет еще одно преимущество перед РГАд, так как при постановке последнего невозможно выявление негемадсорбирующих вариантов вируса, как правило, у свиней с хронической или бессимптомной формой течения болезни. Следует также учитывать, что специфическая ГАд, хотя и является характерным признаком вирулентных вариантов вируса АЧС, отдельные негемадсорбирующие изоляты также могут быть высоковирулентными [15].

Таким образом, целью наших исследований являлось определение корреляции показателя Ct в ПЦР в режиме реальном времени и значений титра вируса, устанавливаемого в реакции гемадсорбции, а также расчета количества копий генома вируса АЧС в пробе.

Расчет титра вируса проводили по методу Рида и Менча, или по методу Кербера в модификации Ашмарина через 7 дней после начала эксперимента [9, 10].

В качестве источника геномной ДНК и для заражения культуры клеток или титрования исходного вируса в работе использовали вирус АЧС изолят Krasnodar 07/17, выделенный в июле 2017 года из пробы селезенки павшей домашней свиньи (Краснодарский край). Накопление вируса осуществляли путем его пассирования в первичной культуре клеток СС в течение 2-3 пассажей.

Для получения и накопления ПЦР-продукта использовали: матричную ДНК вируса АЧС изолят Krasnodar 07/17 в объеме 5 мкл на реакцию, Taq-ДНК-полимеразу - 0,5 мкл, 10*буфер с (NH4)2SO4 - 2 мкл, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов 10 мМ - 0,5 мкл (Fermentas), праймеры, фланкирующие ген B646L (табл. 1) (по 10 пМ каждого), и 2 мкл 25мМ MgCl2. Объем деионизированной воды рассчитывали, исходя из общего объема реакционной смеси, равного 20 мкл. Режим амплификации использован согласно работе Neilan J.G. и др., 2004 [19].

Таблица 1. Праймеры, использованные для амплификации гена B646L вируса АЧС

Последовательность 5' 3'

Результаты амплификации гена B646L оценивали с помощью электрофореза в 1,0% агарозном геле.

Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения в 1% геле агарозы ПЦР-продукта (вирус АЧС изолят Krasnodar 07/17): трек 1 - электрофорез ПЦР-продукта полноразмерного гена B646L; трек 2 - маркер 1к (производитель ThermoFisher) с линейкой фрагментов от 10000 п.о. до 250 п.о.

Поскольку размер амплифицированного фрагмента 1981 п.о. и его концентрация после очистки из агарозного геля составляла 25,1 нг/мкл, рассчитанное количество копий гена составляло 1,17x1с11 копий/мкл.

На втором этапе исследований приготовили 10 десятикратных разведений образца ПЦР-продукта и провели их анализ в ПЦР-РВ с трехкратной повторностью. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Значение Ct в ПЦР-РВ при разных концентрациях амплификата гена B646L вируса АЧС (n=3)

Разведение пробы	Концентрация ДНК амплификата гена B646L (нг/мкл)	Значение Ct	Количество копий гена в 1мкл	Результат
1	25,1Ч10-1	-*	1,17Ч19	Ложн.отр
2	25,1Ч10-2	-*	1,17Ч18	Ложн.отр
3	25,1Ч10-3	-*	1,17Ч17	Ложн.отр
4	25,1Ч10-4	5.8	1,17Ч16	Пол.
5	25,1Ч10-5	8.2	1,17Ч105	Пол.
6	25,1Ч10-6	11.34	1,17Ч104	Пол.
7	25,1Ч10-7	15.15	1,17Ч103	Пол.
8	25,1Ч10-8	18.09	1,17Ч102	Пол.
9	25,1Ч10-9	21.11	1,17Ч101	Сомн.
10	25,1Ч10-10	25.00	1,17	Сомн

Полученные результаты ПЦР-РВ продемонстрировали обратно пропорциональную линейную зависимость показателя Ct от количества копий гена B646L вируса АЧС, когда снижение концентрации в 10 раз приводит к увеличению Ct на 3 цикла (рисунок 2).

Рис. 2. Корреляция значений Ct ПЦР-РВ с количеством копий гена B646L

Таким образом, в результате экспериментов было установлено, что при высокой концентрации ДНК в образцах (>1,17x10 копий генома) реакция ПЦР-РВ может приводить к ложно отрицательному результату, поскольку чрезмерное количество исходной матрицы препятствует отжигу праймеров на амплифицированных матрицах, а когда количество копий снижается ПЦР-РВ позволяет обнаруживать геном вируса АЧС вплоть до минимального количества копий - 11,7 копии/мкл. Так как для постановки реакции используется 10 мкл матричной ДНК, чувствительность ПЦР-РВ в данных опытах составляет 117 копий.

На следующем этапе для наиболее точного определения титра вируса АЧС в пробе с помощью реакции гемадсорбции, провели сравнительный анализ чувствительности первичных культур клеток.

С этой целью параллельно заразили культуры клеток СС и КМС вирусом АЧС изолят Krasnodar 07/17 в дозе 103 ГАдЕ50 на матрас (объем 50 мл), и наблюдали за репродукцией вируса в культуре клеток. Из каждого матраса на седьмые сутки отобрали по 300 мкл культуральной жидкости, исследовали данные образцы методом ПЦР-РВ и определяли титр вируса АЧС в обеих культурах клеток в РГАд. Р результате титр вируса АЧС в культуре клеток СС составил 106 ГАдЕ50, а титр вируса АЧС в культуре клеток КМС составил 105 ГАдЕ50, то есть на 1lg ниже. Полученные данные также были подтверждены методом ПЦР-РВ, где значение Ct на седьмой день в культуре клеток СС составило 12,2, а в культуре клеток КМС 15,9.

Поскольку обе культуры клеток были использованы для заражения одной и той же дозой вируса, а репродукция вируса АЧС в культуре клеток СС показала более высокую чувствительность данной культуры к вирусу, для выполнения дальнейших этапов работы была выбрана культура клеток СС, как наиболее соответствующая целям исследований.

Таблица 3. Значение Ct ПЦР в реальном времени при разных разведениях вируса АЧС (n = 3)

Титр	Разведение	Ct/ВКВ*	Среднее**	Стандартное отклонение***	95% доверительный интервал****
107 ГАдЕ 50	исходный	20,54	8,03	±0,12	7,67 – 8,39
106 ГАдЕ50	1	22,71	11,95	±0,136	11.54 – 12,36
105 ГАдЕ50	2	23,38	16,23	±0,542	14,6 – 17,86
104 ГАдЕ50	3	23,61	19,84	±0,138	19,43 – 20,25
103 ГАдЕ50	4	23,83	23,86	±0,565	22,17 – 25,56
102 ГАдЕ50	5	23,48	27,37	±0,574	25.65 – 29.07
10 ГАдЕ50	6	25,26	Н.З	Н.З	Н.З
0,1 ГАдЕ50	7	24,38	Н.З	Н.З	Н.З

Примечание: Н.З - нет значения Ct; * - внутренний контроль выделения ДНК; ** - среднее значение рассчитано по формуле:

Для определения формулы расчета титра вируса построили линию регрессии и рассчитали коэффициент корреляции между логарифмом титра вируса и логарифмом Ct с помощью программы Statistica (рисунок 3)

Рис. 3. График зависимости между логарифмом титра вируса АЧС и логарифмом значения Ct ПЦР-РВ

В наших исследованиях, коэффициент корреляции составил 0,9683, что свидетельствует о высокой достоверности (точности) исследований и позволяет производить вычисление титра вируса в пробе.

Таким образом, при анализе корреляции между показателями Ct ПЦР-РВ и результатами титрования проб в культуре клеток СС удалось установить близкую к линейной зависимость показателя Ct от титра вируса АЧС. Необходимо отметить, что в данном случае снижение концентрации на 1,0 lg, приводило к увеличению Ct на 4 цикла (рисунок 4).

Следующим этапом нашей работы являлось определение аналогичного соответствия показателей Ct ПЦР-РВ с титром вируса, полученного из крови инфицированного животного вирусом АЧС изолят Krasnodar 07/17, павшего на 7 сутки после заражения (титр вируса в крови составлял 7,0 lg ГАдЕ/см3). Аналогично опытам с изолятом Krasnodar 07/17 в культуре клеток СС, образцы крови также использовали для приготовления 7 десятикратных разведений для исследования методом ПЦР-РВ в 3 повторностях. Сравнение результатов экспериментов и определение соотношения значений Ct и титра вируса продемонстрировало практически полную идентичность полученных результатов (рисунок 4).

Рис. 4. Значение Ct ПЦР-РВ в соотношении с титром вируса АЧС в культуре клеток и в крови инфицированной свиньи

Результаты Ct обоих экспериментов в культуре клеток и в крови показали высокий уровень достоверности.

По результатам, представленным на рисунке 4, видно равномерное снижение значения Ct на 4 цикла при каждом последующем десятикратном разведении (то есть при увеличении титра на один логарифм). Следовательно, корреляция выражается в линейной зависимости соотношения Ct и титра вируса, подъем значения Ct каждые 4 цикла соответствовал снижению титра вируса на 1 lg.

Рис. 5. Значение Ct ПЦР-РВ в соотношении с титром вируса АЧС в культуре клеток и в крови инфицированной свиньи

Однако, считаем необходимым обратить внимание, что значение циклов Ct могут изменяться в зависимости от чувствительности набора, целевого детектируемого участка генома вируса АЧС, и чувствительности культуры клеток, на которой проводится определение титра вируса.

Заключение. Как правило, уровень репродукции вируса АЧС определяется титрованием в культуре клеток, поскольку чувствительность РГАд в 10 раз выше (1 ГАдЕ - 10-12 вирионов), чем чувствительность ПЦР-РВ (10 ГАдЕ или

117 копий), но постановка этой реакции более трудоемка и длительна (7-10 сутки) по сравнению с ПЦР-РВ (2 час 30 минут). Кроме того, несмотря на то, что титрование более чувствительный метод, в определенных случаях, точность результата зависит от чувствительности культуры клеток и квалификации исполнителя.

Выявленная корреляция между значением Ct и титром вируса в пробе позволяет в лабораторной практике использовать ПЦР-РВ для количественного определения содержания вируса в образце, а также, дает возможность детального изучения ряда биологических свойств возбудителя АЧС.

При необходимости использование ПЦР-РВ также дает возможность определить количество копий генома вируса в исследуемых образцах, с поправкой на то, что корреляция должна быть изучена и оптимизирована для определенного набора.

Ключевые слова: вирус африканской чумы свиней, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, реакция гемадсорбции, значения Ct, культура клеток СС, культура клеток КМС, геном вируса АЧС, корреляция, количество копий, биологические свойства, количественный метод.

Dr. Bart van Leerdam n BioChek B.V. , Burg. Bracklaan 57, 2811 BP Reeuwijk , Netherlands
Dr Pieter Kuhne n Intervet/ Schering Plough Animal Health, P.O. Box 31 5830 AA Boxmeer, Netherlands

Использование данных серологии, полученных с помощью ме­тода ELISA, в системе организации здоровья птицы было повсемест­но принято для многих заболеваний, включая инфекционный бронхит (IBV). Серология является полезным инструментом для отслеживания иммунного ответа после вакцинации и для постановки диагноза. Очень трудно найти в литературе практические рекомендации касательно ин­терпретации результатов (IBV) ELISA.

Часто остаются без ответа такие практические вопросы, как: "Какой уровень титров и какой коэффици­ент вариации (CV) следует ожидать после вакцинации против IBV?" и "Можно ли провести различие между вакцинацией и полевым зараже­нием с помощью IBV ELISA?". В данной статье освещается применение и интерпретация результатов анализа IBV ELISA после вакцинации жи­вой и инактивированной вакцинами, и как серология может облегчить идентификацию заражения вирусом инфекционного бронхита в полевых условиях. Где это представляется возможным, обсуждаются сероло­гические результаты полевых историй болезни Обоснование мониторинга IBV

Связанные с заболеванием проблемы иногда возникают даже у вакцинированных птиц. Связано ли это с качеством вакцины? Возмож­но, но гораздо чаще, неудача вакцины является следствием неудовлет­ворительного обращения и/или применения вакцины. Поэтому, когда имеешь дело с вакцинацией живой вакциной против респираторных заболеваний, наподобие IBV, важно оценить успешность вакцинации Это связано с тем, что успешная вакцинация не всегда является не­избежной, поскольку трудно обеспечить доставку эффективной дозы всем птицам без исключения при использовании методов массовой вакцинация (например, с питьевой водой и спрей методом) для живых вакцин IBV

Мониторинг иммунного ответа на вакцинацию помогает обнару­жить и диагностировать какие-либо сбои с тем, чтобы предпринять кор­ректирующие меры, если вакцинация оказалась неудачной. Таким об­разом, отслеживание результатов вакцинации следует рассматривать как "Контроль Качества" вакцинаций, проводимых в полевых условиях Это приводит нас к очень важному моменту при мониторинге с помо­щью ELISA: следует быть готовым предпринять должные меры в зави­симости от результатов. Без принятия мер нельзя ожидать улучшения оптимизации и поддержания эффективности программ вакцинации

Интерпретация результатов ELISA

Для того чтобы успешно интерпретировать результаты ELISA пос­ле серологического мониторинга вакцинированных стад, должны быть соблюдены следующие условия

В лаборатории следует использовать внешние референтные контроли, чтобы иметь дополнительную гарантию воспроизводимости и точности результатов и обеспечить правильную интерпретацию. Без референтных контролей, в случае получения аномальных титров, мы незнаем, либо это результат ошибок при проведении процедуры теста либо это фактическое отражение иммунного статуса птиц в полевыхус-ловиях.Перед проведением анализа необходимо иметь представление о том, какой результат является ожидаемым (базисный уровень титров для успешной вакцинации). Это позволит легче интерпретировать ре­зультаты, сравнивая с базисным уровнем, и легко судить об успешности вашей программы вакцинации. Также необходимо иметь представле­ние о том, какие действия следует предпринять, если результаты не со­ответствуют ожидаемым

На практике интерпретация результатов вакцинации обычно про­водится путем оценки трех основных компонентов гуморального ответа после введения вакцины, которыми являются

Интенсивность отклика, на что указывает значение среднего титра. Развиваются ли у птиц уровни титров в ожидаемом диапазоне (базисный уровень) для примененной вакцины? Эти титры базисно­го уровня могут варьировать в зависимости от типа птицы, возраста типа вакцины, программа вакцинации и т.д. В каждом конкретном случае следует разработать собственные базисные уровни для своих программ вакцинации и условий на месте. Пример базисных уровней при вакцинации бройлеров против IBV приводятся в таблицах 1 и 2 (в конце статьи). Можно видеть, что базисные уровни (средний титр) могут варьировать в зависимости от использованных вакцинных штаммов Применение относительно мягких вакцин Н120 будет давать значитель­но меньшие титры по сравнению с ответом, полученным после приме­нения более иммуногенных вакцинных штаммов, таких как IB 4/91

Однородность отклика, на что указывает %CV (коэффициент вариации). Была ли вакцина доставлена каждой птице или нет? Нахо­дится ли %CV в пределах требуемого диапазона, или есть ли возмож­ность для улучшения?

В качестве общего руководства для коэффициента вариации пос­ле вакцинации можно привести следующие значения:

Менее 40% Великолепная

Более 60% Следует улучшить

Хотя эти общие рекомендации применимы для большинства жи­вых и инактивированных вакцин, следует иметь в виду, что использо­вание живых вакцин против респираторных заболеваний наподобие IBV, генерирует в целом неоднородный отклик в титрах. Горизонтальное распространение вакцинного вируса среди стад может быть ограничен­ным, а, кроме этого, живые IBV вакцины могут также давать местный иммунный отклик, который нельзя измерить с помощью метода ELISA Поэтому в случае применения таких живых вакцин, как вакцина Н120 ожидаемый СУдля хорошей вакцинации будет составлять 40-70%. Зна­чение CV на уровне Родители бройлеров в 35 недель 15% снижение яйценоскости

До ингоекдии. 34 нед. После инфекции. 37 нед

Клинические признаки: мелкие, деформированные яйца и снижение яйценоскости на 15 %

Соответствующее повышение тигров и снижение % CV

Пример 2. Серология бройлеров в возрасте 44 дня, после двук­ратной вакцинации Н120. Средний титр значительно увеличен, коэф­фициент вариации (CV) значительно снижен. Клинические симптомы также соответствуют серологической картине

Осложненные IBV инфекции

Несмотря на то, что в случае проявления респираторных призна­ков можно подозревать инфекцию IBV, рекомендуется также провести тестирование инфицированных птиц на предмет присутствия других респираторных патогенов по двум причинам

Инфекции IBV часто происходят в сочетании с другими респи­раторными патогенами, в частности, вирусом птичьего ринотрахеита (ART) (известен также, как птичий пневмовирус (APV)), Ornithobactenum rhinotracheale (OR), Mycoplasma gallisepticum (MG) и Mycoplasma synoviae (MS). Осложненные инфекции можно диагностировать лишь

путем просмотра всей серологической картины. Тестирование только на IBV не укажет на взаимодействующие патогены респираторной бо­лезни

Серология после респираторных вакцин типа IBV и NDV часто аномально искажается из-за повреждений, присутствующих после респираторного заражения (трахеит и/или аэросаккулит). Эти повреж­дения делают возможным более активный контакт и проникновение вакцинного вируса в рецепторных местах, что приводит в результате к повышенной по сравнению с нормой серологии после применения живых вакцин IBV и NDV. Это является одной из причин частой ложной диагностики инфекции пневмовирусами (ART), как инфекции IBV, если оценивать только серологию IBV. Анализ всей серологической картины позволяет увидеть характер взаимодействия с другими респираторны­ми агентами, что позволяет надлежащим образом поставить диагноз осложненной инфекции. Часто принятие во внимание ключевых кри­териев при определении инфекции (как описано выше) помогает ис­ключить "эффект пораженной трахеи": как правило усиленные реакции на вакцину не приводят к удвоению ожидаемых средних титров и/или значительному снижению коэффициента вариации (%CV).

Приведенные ниже две истории болезни демонстрируют полез­ность проведения полного тестирования птиц с респираторными забо­леваниями

История болезни 1:

Хроническая респираторная инфекция, ложно диагностиро­ванная, как инфекционный бронхит (IBV)

Стадо бройлеров было дважды вакцинированно живой IBV вак­циной МА 5

В возрасте 21 день у птиц обнаруживалась тяжелая респиратор­ная клиника в сочетании с распухшей головой и смертностью на уров­не 10-15%. Вскрытие выявило аэросаккулит с желтым пенистым экссу­датом, который был отнесен на счет инфекции Е . coli.

Рутинная серология на инфекционный бронхите помощью ELISA выявила слегка повышенные средние титры с более однородным от­кликом, чем обычно. В связи с тем, что титры были повышены, был сде­лан вывод о том, что цыплята-бройлеры были заражены инфекционным бронхитом с вторичной инфекцией Е . coli. В программу вакцинации бройлеров была введена третья вакцинация против IBV, но респиратор­ные признаки сохранились. Если провести более полное серологичес­кое обследование, то обнаруживаются значительные положительные титры ART и OR.

История болезни 2:

Осложненная инфекция IBV с нефропатогенным вариант­ным штаммом.

Стадо бройлеров было дважды вакцинированно живой вакциной Massachusetts (Н120) в возрасте 1 и 20 дней. Птиц также дважды вак­цинировали от NDV с применением живой вакцины Avinew в возрасте 1 (спрей) и 20 дней (выпаивание с водой). В возрасте 14-21 дней у птиц проявились респираторные признаки, мягкая диарея и смертность Посмертное обследование выявило трахеит и нефрит. У некоторых птиц аэросаккулит с плотным желтоватым пенистым экссудатом. На приве­денных ниже фотографиях иллюстрируется ситуация на ферме. Пока­заны тяжелый трахеит, воспаление почек (нефрит) и аэросаккулит с плотным творожистым экссудатом.

Ниже приводятся полученные с помощью ELISA данные сероло­гии у цыплят в возрасте 46 дней. Тесты на MG и MS оказались отри­цательными (данные не показаны). Серология IBV выявила аномально высокие титры со значением CV (25%), что значительно ниже ожидае­мого диапазона (50 - 100%). Клинические симптомы также согласовы­вались с повышенными титрами IBV

Результаты серологии ART и OR были также положительными, ука­зывая на наличие этих попутных инфекций, поскольку птицы не подвер­гались вакцинации. Серология на предмет NDV показала повышенные по сравнению с нормой титры, но усиленная реакция, по всей види­мости, была связана с "эффектом поражения трахеи" вакцинным виру­сом. Для NDV также не удовлетворялись ключевые критерии, которые указывают на инфекцию. (Средний титр в два раза ниже ожидаемого после вакцинации). На основе этих результатов можно сделать вывод о том, что птицы первоначально были инфицированы нефропатогенным штаммом инфекционного бронхита, a ART и OR действовали в качестве вторичных патогенов

Был разработан план на случай непредвиденных дополнительных обстоятельств, который включал вакцинацию с применением живого вариантного штамма IBV (4/91) в возрасте 14 дней с питьевой во­дой. После реализации новой программы параметры продуктивности вернулись к норме. Образцы сыворотки от пораженных стад, исполь­зованных для тестирования с помощью ELISA, были отправлены в ла­бораторию компании Intervet в Боксмеере, Голландия, для проведения серотипирования с помощью теста нейтрализации вируса (VN). Резуль­таты обобщены в приведенной ниже таблице:

История болезни 3:

Серотипирование инфекции IBV с QX-подобным штаммом у бройлеров с респираторной инфекцией

Цыплят-бройлеров вакцинировали дважды вакциной Н120 в воз­расте 1 и 20 дней

В возрасте 14-21 дней у птиц были обнаружены респираторные признаки, нефрит и увеличение смертности

Результаты серологии цыплят в возрасте 46 дней

Специфический тест нейтрализации вируса (VN) выявил самый высокий титр для QX-подобного (или D388) штамма у птиц, которые были вакцинированы только вакциной Н120 серотип Massachusetts (в тесте VN определяется с М41). Можно сделать вывод о том, что результа­ты серологии с помощью метода ELISA оказались очень полезными для ранней диагностики природы первичного патогена (нефропатогенный IBV) и помогли предотвратить дальнейший урон путем немедленной корректировки программы вакцинации, которая включала вакцину с вариантным штаммом IB 4/91

Дополнительное серотипирование с помощью теста нейтрали­зации вируса (VN) помогло установить конечный диагноз до уровня специфического штамма (тип D338). Оно подтвердило обоснованность использования вариантного штамма в программе вакцинации с целью расширения спектра защиты против различных вариантов инфекцион­ного бронхита. Осведомленность о присутствии этого серотипа на пти­цеферме может также оказаться полезной в разработке эффективных программ вакцинации для других пораженных ферм в данном регио­не

Основное преимущество серологического мониторинга инфекци­онного бронхита с помощью ELISA заключается в следующем

Совершенствование методики введения вакцины и повышение ее эффективности

Немедленная диагностика заболевания с целью идентификации причин производственных потерь

Ключевым пунктом применения программы мониторинга явля­ется то, что в зависимости от полученных результатов следуют опреде­ленные действия. Принятие немедленных соответствующих мер явля­ется очень важным для ограничения и предотвращения дальнейших экономических потерь. Если результаты вакцинации являются неудов­летворительными, это позволит провести повторную оценку процедур вакцинации против IBV и осуществить корректирующие действия. Это делает регулярный мониторинг экономически эффективным профилак­тическим средством. Повышение эффективности применения вакцины приведете результате к более эффективному контролю над заболевани­ем и повышению продуктивности стад

Данная статья с практической точки зрения иллюстрирует ключе­вые моменты в интерпретации результатов серологии с помощью ELISA после вакцинации живыми и инактивированными вакцинами против инфекционного бронхита, а также идентификации заражения IBV. По возможности, результаты серологии обсуждаются на примерах истории болезни в полевых условиях. Особое внимание уделяется следующим ключевым моментам

Использование референтной контрольной сыворотки, чтобы обеспечить надежность результатов ELISA

Интерпретация результатов серологии IBV и обсуждение базис­ных уровней антител ожидаемых после вакцинации

Практическое применение ELISA в качестве метода "Контроля Качества" для оценки и оптимизации Вашей программы вакцинации

Критерии для диагностики IBV, включая серологию

Мониторинг инфекционного бронхита с помощью ELISA в качес­тве средства для ранней диагностики заболевания и ограничения про­изводственных потерь

Принятие безотлагательных мер для ограничения и предотвраще­ния дальнейших производственных потерь

Профилактический мониторинг поголовья должен также включать оценку результатов продуктивности, регулярный клинический осмотр, а также рутинное обследование выбракованных и павших птиц.