Клинические материалы на грипп для пцр

На отчетной неделе по данным на 14.12.10 исследования по выделению вирусов гриппа были проведены в 11 БЛ ФЦГ и 2 БЛ ЦЭЭГ. По результатам тестирования 518 клинических материалов от больных гриппом и ОРВИ выделено 2 (0.4%) вируса гриппа A(H3N2) во Владивостоке и 1 (0.2%) вирус гриппа типа В в Новосибирске (табл. 1) .

Согласно данным ИФ обследования 1083 клинических материалов от больных гриппом и ОРВИ в 38 БЛ ФЦГ и 8 БЛ ЦЭЭГ было диагностировано 17 (1.7%) случаев гриппа, в т.ч.:

- 1 (0.09%) случай гриппа А(Н1N1+H1N1v) в Санкт-Петербурге,

- 6 (0.6%) случаев гриппа А(Н3N2) в 4 городах (Красноярск, Санкт-Петербург, Челябинск, Чита),

- 11 (1.0%) случаев гриппа В в 7 городах (Белгород, Новосибирск, Ростов-на-Дону, Самара, Смоленск, Сыктывкар, Челябинск).

Общая частота ИФ распознавания природы ОРВИ, включая грипп, на этой неделе составила 22.1% , в том числе заболеваний не гриппозной этиологии - 20.3 % , из них парагриппозной - 10.4%, аденовирусной - 5.6%, РС-вирусной - 4.3% случаев от числа обследованных больных, соответственно (табл. 2).

ПЦР-диагностика проведена в 47 лабораториях - в 38 БЛ ФЦГ и 9 БЛ ЦЭЭГ. По результатам анализа материалов от разного количества больных выявлен 1 (0.4%) случай сезонного гриппа А(Н1N1) (Кемерово), 4 (1.7%) - гриппа А(Н3N2) (Чита, Владивосток) и 37 (3.4%) случаев гриппа В (Белгород, Волгоград, Краснодар, Курск, Мурманск, Ростов-на-Дону, Сыктывкар, Ульяновск, Челябинск, Владивосток, Липецк). Случаев не субтипированного гриппа А, пандемического гриппа А(Н1N1)v и гриппа А(Н5N1) не диагностировано.

Общая частота ПЦР распознавания ОРВИ не гриппозной этиологии на этой неделе составила 17.5 % , в том числе парагриппозной, аденовирусной и РС-вирусной инфекций в 11.0%, 6.2% и 1.3%, соответственно (табл.3).

Сводные результаты диагностирования гриппа поступили из 54 базовых лабораторий. По этим данным в результате анализа клинических материалов от 1872 больных сезонный грипп А(Н1N1) выявлен в 0.2%, грипп А(Н3N2) - в 0.5%, грипп В - в 2.2% случаев (табл. 4).

Таблица 1.

Выделение вирусов

Город	Общ. число обсл.	Кол-во выделенных вырусов
		H1	H3	B	H1v	Нети- пир.	Всего
БЛ НИИГ (абс)	480	0	0	1	0	0	1
(%)		0,0	0,0	0,2	0,0	0,0	0,2
БЛ ИВ (абс)	38	0	2	0	0	0	2
(%)		0,0	5,3	0,0	0,0	0,0	5,3
ВСЕГО (абс)	518	0	2	1	0	0	3
(%)		0,0	0,4	0,2	0,0	0,0	0,6

Таблица 2.

Иммунофлуоресцентная диагностика

Город	Общ. число обсл.	Грипп			Парагрипп			AD	RS	Всего
		H1+H1v	H3	B	I	II	III
БЛ НИИГ (абс)	973	1	6	11	18	31	42	53	42	204
(%)	0,1	0,6	1,1	1,8	3,2	4,3	5,4	4,3	21,0
БЛ ИВ (абс)	110	0	0	0	3	0	19	8	5	35
(%)	0,0	0,0	0,0	2,7	0,0	17,3	7,3	4,5	31,8
ВСЕГО (абс)	1083	1	6	11	21	31	61	61	47	239
(%)	0,09	0,6	1,0	1,9	2,9	5,6	5,6	4,3	22,1

Таблица 3.

ПЦР-диагностика

Город	Общ. число обсл.	Грипп						ПГ	AD	RS
		A (субтип не определен)	H1	H3	H5	B	H1v
БЛ НИИГ (абс)	961	0 / 896	1 / 232	3 / 232	0 / 145	35 / 923	0 / 566	46 / 336	22 / 292	5 / 271
(%)	0,0	0,4	1,3	0,0	3,8	0,0	13,7	7,5	1,8
БЛ ИВ (абс)	170	0 / 170	0 / 0	1 / 1	0 / 0	2 / 170	0 / 0	5 / 129	4 / 129	0 / 129
(%)	0,0	-	100,0	-	1,2	-	3,9	3,1	0,0
ВСЕГО (абс)	1131	0 / 1066	1 / 232	4 / 233	0 / 145	37 / 1093	0 / 566	51 / 465	26 / 421	5 / 400
(%)	0,0	0,4	1,7	0,0	3,4	0,0	11,0	6,2	1,3

Таблица 4.

Общее количество случаев гриппа

Город	Общ. число обсл.	Кол-во диагностированных случаев гриппа
		H1	H1+H1v (по данным ИФ)	H3	A (субтип не определен)	B	H1v	Кол-во диаг.
БЛ НИИГ (абс)	1639	2	1	6	0	40	0	48
(%)		0,1	0,06	0,4	0,0	2,4	0,0	2,9
БЛ ИВ (абс)	233	0	0	3	0	2	0	5
(%)		0,0	0,0	1,3	0,0	0,9	0,0	2,1
ВСЕГО (абс)	1872	2	1	9	0	42	0	53
(%)		0,1	0,05	0,5	0,0	2,2	0,0	2,8

На отчетной неделе превышение эпидемических порогов заболеваемости по всему населению на 23.3% - 85.2% было зарегистрировано в 9 городах, в том числе в 8 городах Европейской части страны (Белгород, Великий Новгород, Воронеж, Екатеринбург, Казань, Мурманск, Нижний Новгород, Сыктывкар) и в 1 городе Сибири (Иркутск). Интенсивные показатели заболеваемости населения в этих городах варьировали от 0.6% до 1.9% и были наиболее высокими в Белгороде, Великом Новгороде, Мурманске и Сыктывкаре. В целом по стране показатель заболеваемости гриппом и ОРВИ на этой неделе превысил базовую линию на 5.0%, в основном за счет Уральского, Северо-Западного и Сибирского регионов. Исследования по выделению вирусов гриппа по-прежнему носили ограниченный характер. Во Владивостоке выделено 2 вируса гриппа A(H3N2), в Новосибирске – один вирус гриппа В. Рост заболеваний, связанных с вирусом гриппа В, регистрировали, в основном, в городах Европейской части России, тогда как в Сибири и на Дальнем Востоке чаще диагностировали грипп A(H3N2). Суммарная частота диагностирования ОРВИ парагриппозной, аденовирусной и РС-вирусной этиологии по результатам ПЦР и ИФ составила на этой неделе 17.5% и 20.3% от числа обследованных больных, соответственно.

ОРВИ и грипп имеют респираторные симптомы и общие. Их можно распознать по катаральным признакам со стороны дыхательных путей и общей симптоматике, характерной для большинства заболеваний.

Современные методы диагностики данной группы заболеваний

Различают несколько видов диагностики, которые различаются по особенностям проведения и методу выявления возбудителя. Это:

• экспресс-методы;
• серологическая диагностика;
• вирусологическая диагностика.

Первая группа - экспресс-методики. Это быстрый способ подтвердить или исключить наличие болезни. Используется метод флюоресценции и ПЦР. Рассмотрим их подробнее.

Изучение флюоресцирующих антител - МФА. Способ основан на определении антигенов к вирусу в эпителиальных клетках носовой слизистой, на конъюнктиве (если есть глазные поражения). Антитела при действии антигена реагируют специфическим свечением, которое легко заметить при микроскопическом исследовании. Этот параметр считается маркером диагностики и является основой для подтверждения результата. Способ имеет диагностическую ценность начиная с 3 и заканчивая 5 днем заболевания. Чувствителен к таким антигенам: вирус гриппа типа А, В, вирус парагриппа, аденовирусы и возбудитель РС-инфекции. Это удобный и быстрый метод, не требующий особых ресурсов, который часто применяется в ходе диагностики.

Метод полимеразно-цепной реакции базируется на основе обнаружения участков нуклеиновых кислот генетического материала вируса и определении их групповой принадлежности по этому критерию. Методика имеет высокую диагностическую ценность, является современным и качественным способом подтверждения заболевания. Считается “золотым стандартом” диагностики, так как не дает ложных результатов и является специфическим для определения конкретных патогенов, широко применяется в стационарных и амбулаторных условиях.

Вирусологические методики основаны на чистом выделении вирусных микроорганизмов и их конкретных штаммов, за чем следует их прикрепление к клеточным культурам в лабораторных условиях. Далее следует определение вида вируса с помощью ПЦР или других реакций. Метод требует значительных ресурсов, довольно длительный и трудоемкий. Его ценность заключается в получении эпидемиологических данных и основе для научных работ. То есть, детальное изучение вируса, частоты его распространения позволяет прогнозировать эпидемическую картину, создавать вакцины. Для исследования берется мазок из носа и носоглотки. Материал пригоден в течении 3-5 дня заболевания. С помощью вирусологических методов можно определить такие возбудители:

Серологические методы диагностики - это ретроспективное исследование, которое дает точные данные относительно стадии процесса, степени активности и типа возбудителя. Используется для эпидемиологических целей.

Для анализа используется сыворотка крови, в которой необходимо определить количество и виды антител. Используется известный антиген вируса. При возникновении реакции с материалом пациента формируются иммунные комплексы антиген-антитело, что подтверждает диагноз. Для диагностики также важен прирост титра антител, для чего используются парные сыворотки.

Результат имеет высокую точность и может определиться даже если все другие методы не дали результата, так как имеет высокую чувствительность. особенно важно использование метода для стертых форм с минимальными клиническими проявлениями. Сыворотки для анализа берутся в начале болезни, а также через 10-14 дней после её завершения. Используется метод для подтверждения наличия в организме таких возбудителей: вирусы гриппа А, В, возбудители парагриппа, аденовирусы и РС-вирусы.

Наличие вируса гриппа можно подтвердить с помощью РТГА - реакции торможения геммааглютинации. Метод основан на свойстве снижения гемагглютинирующих способностях вируса, если в крови есть антитела к нему. Для этого используется кровь с эритроцитами, антиген. Препараты крови берутся парными, в начале болезни, и в период выздоровления. Метод имеет высокую диагностическую ценность, точный и чувствительный.

Виды исследуемого материала и особенности сдачи

Для диагностики используются смывы из носа, мазки из носовых ходов, носоглотки, а также препараты крови.

Забор мазка и смыва проводит медицинский персонал. Он следит за тем, чтобы препараты строго соответствовали должной локализации. Забор проходит в чистых условиях, стерильными инструментами и в стерильную тару. До того, как взять мазки пациента просят высморкаться, чтобы очистить носовые ходы от слизи. Зонд вводится легко, на глубину 2-3 см. Проводится стандартное движение по нижней части носового хода и под раковиной носа. Необходимо, чтобы забор происходит в современной клинике, где есть возможность правильно хранить и транспортировать собранный материал в короткий срок до лаборатории.

Мазок из глотки берется по похожей методике, чтобы затронуть те участки слизистой, на которой скапливается возбудитель. Перед забором необходимо легко прополоскать рот, чтобы взятый материал был чистым. Желательно забирать материал на 3-й день после начал болезни.

Нормы и отклонения от них, расшифровка результатов

Экспресс-тест дает результаты сразу после диагностики, его расшифровка не вызывает трудностей, так как определяет наличие вируса или его отсутствие в организме.

Серологические реакции более сложные и могут расшифровываться по разному: наличие антител класса М говорит об острой стадии процесса, антитела G формируются при хроническом течении.

Сроки готовности результатов

Результаты исследования готовы на 1-2 день после сдачи. Экспресс-тест дает результат сразу. Серологические методы требуют больше затрат времени для сравнения титров антител. Более быстрые методы важны для диагностического процесса, а те, что более затратны - для эпидемиологического и научного исследования.

Скорость диагностики зависит от правильности сдачи препаратов, условий лаборатории, качества реактивов.

Вовремя сданный анализ позволяет точно и быстро определить диагноз. Это - залог правильного и эффективного лечения. Если болезнь запустить, она грозит осложнениями, которые особенно опасны, если у человека грипп. Это актуально для детей, пожилых людей, беременных женщин и лиц с дефицитом иммунной системы, ведь осложнения чаще всего проявляются у них.

Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента

Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма

Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.

Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.

Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"

Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.

Составитель:

Рецензенты:

главный специалист по клинической лабораторной диагностике УЗ Гомельского областного исполнительного комитета А.А. Кудря

Характеристика вируса типа А (H1,N1)

Высокопатогенный вирус гриппа А (H1,N1) (ВПВГА) относится к семейству Orthomyxoviridae. Геном вируса представлен восемью фрагментами РНК. По данным генетического анализа, вирус гриппа, вызвавший вспышку заболевания среди людей в Мексике и США весной 2009 года, является реассортантом вирусов гриппа свиней.

Вирус передаётся от человека к человеку воздушно-капельным путём. Не исключён также и контактно-бытовой путь передачи. Инкубационный период при гриппе ВПВГА составляет обычно 2-3 дня, и вирус может выделяться в окружающую среду заболевшим 7 дней и более. Клиническая картина заболевания разнообразна – от бессимптомных форм до тяжелых пневмоний. Вирус чувствителен к озелтамивиру и занамивиру.

Вирус чувствителен к повышенным температурам и погибает при нагревании до 70 0 С в течении 30 минут. Вирус также чувствителен к различным дезинфектантам, обладающим вирулицидным действием.

ВПВГА характеризуется высокой антигенной изменчивостью. Опасения Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) связаны с генетической новизной вируса и его потенциальной способностью к дальнейшей реассортации, вследствие чего возможно возникновение более агрессивных вариантов инфекции.

ВОЗ присвоила вирусу гриппа А (H1,N1) шестую степень угрозы (из шести). Степень угрозы по ВОЗ не характеризует патогенность вируса (то есть опасность заболевания для жизни людей), а указывает на его способность к распространению.

Определение случаев заболевания

Подтверждённый случай – заболевание, при котором имеются симптомы острого респираторного заболевания (ОРЗ) с лабораторно подтверждённой инфекцией, вызванной ВПВГА одним из следующих методов:

l полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени

l выделение вируса в культуре клеток.

Вероятный случай – у человека имеет место ОРЗ, при этом результат ПЦР положительный на грипп типа А, но отрицательный на подтип Н1 или Н3.

Подозрительный случай – случай, при котором:

l У человека имеется ОРЗ, и этот человек тесно контактировал с лицом с подтверждённой инфекцией, вызванной ВПВГА, в то время, когда это лицо находилось в состоянии болезни, или

l У человека имеет место ОРЗ, и известно, что этот человек недавно контактировал с животным с подтверждённой или подозреваемой инфекцией, вызванной ВПВГА, или

l У человека имеет место ОРЗ, и этот человек совершил поездку в район, где имеют место подтверждённые случаи ВПГА.

При поступлении из организации здравоохранения информации о подтверждённом, вероятном или подозрительном случае заболевания людей ВПГА, специалистами регионального центра гигиены и эпидемиологии проводится эпидемиологическое расследование.

Организация лабораторной диагностики

Сбор, хранение и транспортировка образцов для лабораторной диагностики

Сбор клинического материала осуществляет обученный медицинский работник лечебно-профилактического учреждения в средствах индивидуальной защиты органов дыхания (респиратор), защитных очках или щитках для защиты лица, бахилах, двойных резиновых перчатках в стерильные флаконы, пробирки, контейнеры, стерильными инструментами.

Для диагностики заболевания могут быть использованы следующие образцы:

l мазок из носа

l мазок из носоглотки

l аспират из носоглотки

l смыв из носовой полости

l содержимое эндотрахеальных трубок

По клиническим показаниям к ним могут быть добавлены:

l трахеальный аспират

l бронхоальвеолярный лаваж

l биоптат легочной ткани

l ткань легкого или трахеи, взятая post mortem.

Курьер получает в лаборатории диагностики вирусных и особо опасных инфекций ОблЦГЭ и ОЗ стерильные пробирки с физраствором и стерильные тампоны, упакованные по 10 штук. Пробирки и тампоны хранятся в приемном покое УГОТКБ, годны для использования 7 дней. В приёмном покое хранятся также одноразовые стерильные пластиковые сухие пробирки объёмом 50 мл для сбора биологического материала (мокрота, содержимое эндотрахеальных трубок, ткань лёгкого и др.).

Оптимальные сроки забора

l до начала этиотропной терапии

l мазок из носовой полости, зева - не позднее 5 дня от начала заболевания (лучше первые 3 дня)

l парные сыворотки крови 1-я сыворотка не позднее 3-5 дня заболевания.
2-я сыворотка через 14 дней

l секционный материал - в день смерти больного

Техника забора клинического материала

Венозная кровь

Для серологического исследования забираются парные сыворотки крови. Первую пробу крови берут в первые 3-4 дня заболевания (или в первый день обращения за медицинской помощью). Кровь забирается в чистую сухую пробирку шприцем из вены в количестве 3-5 мл у взрослых.

Первичная обработка крови проводится в клинико-диагностической лаборатории УГОТКБ. Венозная кровь, отстаивается 30 минут при комнатной температуре. При помощи стеклянной палочки отделяют столбик сгустка от стенок пробирки. Пробирку центрифугируют при 1500 об/мин 10 минут. Полученную сыворотку отсасывают автоматическим дозатором с одноразовым наконечником. На каждую сыворотку используется отдельный наконечник. Сыворотка не должна быть гемолизированная, хилезная, с признаками бактериального пророста.

Первую пробу сыворотки хранят при температуре минус 20 0 С до получения второй сыворотки крови. Повторное оттаивание – замораживание не допускается.

Вторую пробу берут через 14 дней после начала заболевания. Обе пробы одновременно отправляют для исследования в лабораторию диагностики вирусных и особо опасных инфекций в течение 24 часов после забора второй сыворотки.

Одиночные сыворотки лаборатория диагностики вирусных и особо опасных инфекций не принимает, т.к. диагностика осуществляется на основании 4-х кратного увеличения титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой.

Мазок из полости носа

Мазок из полости носа забирают сухими стерильными ватными тампонами. Перед взятием материала полость носа необходимо очистить от слизи, лейкоцитов, слущенных клеток эпителия.

Тампон ввести легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опустить книзу, ввести в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, сделать вращательное движение и удалить вдоль наружной стенки носа. Мазок берётся из обеих полостей носа. Тампоны погрузить в стерильную пробирку с 3 мл транспортной среды (фосфатно-солевой буфер или физраствор), отломать концы палочек и плотно закрыть пробкой.

Материал в течение 1 - 4 часов доставляется в лабораторию.

Мазки должны быть забраны таким образом, чтобы в них содержались клетки, имеющие диагностическое значение - цилиндрический эпителий из глубоких отделов носа, в котором размножаются вирусы. Мазки, содержащие клетки плоского и переходного эпителия из наружных отделов носа не информативны и исследованию не подлежат.

Мазок из ротоглотки

Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, нёбных дужек и задней стенки ротоглотки. Тампоны погрузить в стерильную пробирку с 3 мл транспортной среды (фосфатно-солевой буфер или физраствор), отломать концы палочек и закрыть пробкой.

Секционный материал

Кусочки ткани легких берут асептически. Объем проб – около 1-2 см?. Секционный материал помещают в стерильную посуду и транспортируют в термоконтейнере в течение 24 часов.

l Все виды собранного биологического материала должны храниться в больнице не более суток при температуре 2-8°С

l Сыворотка хранится в замороженном состоянии

Каждая проба представляется с сопроводительным документом. Направление на исследование материала на ВПГВА методом ПЦР представлено в Приложении 1. Материал взятый post mortem представляется с направлением по форме Приложения 2. Для исследования на грипп и другие ОРВИ (парагрипп, аденовирусная инфекция, РС-инфекция) методом РИФ с направлением на обычном бланке для исследования биологического материала.

Материал доставляется в лабораторию в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами. При необходимости используются специальные среды для транспортировки вирусосодержащего материала (выдает лаборатория диагностики вирусных и особо опасных инфекций ОблЦГЭ и ОЗ).

Все транспортируемые образцы должны быть упакованы в тройную упаковку, содержащую три упаковочных слоя. Упаковка должна быть выполнена с учётом предотвращения любой утечки содержимого, выдерживать удары и нагрузки, имеющие место при транспортировке. Между первичной ёмкостью и вторичной упаковкой должен находиться мягкий абсорбирующий материал, в количестве достаточном для впитывания всего содержимого первичных ёмкостей. При транспортировке нескольких клинических образцов – каждый упаковывается в первичную упаковку, исключается любой контакт между ними.

Методы лабораторной диагностики

Позволяет обнаружить антиген вируса гриппа в клетках цилиндрического эпителия дыхательного тракта больного за счёт взаимодействия антигенов со специфическими противовирусными антителами. Вирус и инфицированная клетка очень неустойчивы, забор материала нужно проводить как можно быстрее после появления клинических симптомов, т.к. число инфицированных клеток уменьшается по ходу болезни. Вследствие мутаций вновь появившиеся высокопатогенные штаммы вируса гриппа свиней изменили свои антигенные свойства, вследствие чего иммунофлюоресценция может быть ложноотрицательна. Поэтому метод не применяется для диагностики ВПВГА, а используется для диагностики гриппа А (кроме свиного), гриппа В, парагриппа, аденовирусной и респираторно-синтициальной инфекции.

Это методы определения специфических антител в парных сыворотках крови с целью ретроспективного подтверждения диагноза. Серологический анализ позволяет определить заболевание, вызванное одним из 6 подтипов гриппа А, включая свиной и птичий, гриппом В.

Полимеразная цепная реакция

Определяют РНК вируса в диагностическом материале. Результаты получают через 24 часа. При исследовании методом ПЦР анализ проводится в два этапа: I этап – обнаружение вирусов гриппа А, II этап – идентификация субтипов H1N1 и H3N2.

Выделение вируса в культуре клеток или куриных эмбрионах

Метод позволяет не только идентифицировать возбудителя, но и изучить его антигенные, фенотипические, генетические свойства, определить чувствительность к лекарственным препаратам. Это самый длительный метод - результаты через 2-10 дней. Материал для исследования является отделяемое из глубоких отделов носовой полости, зева, секционные ткани. Для транспортировки используют специальные среды. Исследование проводится в г. Минске в лабораториях Национального Центра Гриппа.

Приложение 1

для лабораторного исследования биологического образца от больного ОРИ.