Тест-система иммуноферментная для определения антигенов хантавирусов

УДК: 57.063.8:616.91-074/078(047.31)(476)
Год издания: 2019

Разработка поливалентной диагностической тест-системы для выявления антител к разным серотипам возбудителей геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) относится к природно-очаговым зоонозным инфекциям. Заболеваемость ГЛПС в Республике Беларусь регистрируется ежегодно: в соответствии с данными по инфекционной заболеваемости в 2017 г. было зарегистрировано 66 случаев ГЛПС, что составляет 0,70 случая на 100 тыс. населения, в 2018 г. - 62 /0,66 случая на 100 тыс. населения, в 2019 г. (по данным за январь-апрель) зарегистрировано 20/0,21 случая на 100 тыс. населения.

Источником инфицирования человека являются мелкие млекопитающие, главным образом дикие и синантропные грызуны - хронические носители хантавирусов. Инфицирование человека происходит преимущественно воздушно-капельным и воздушно-пылевым путем при контакте с выделениями (слюна, моча, экскременты) грызунов.

Основными возбудителями ГЛПС, циркулирующими в Европейском регионе, являются хантавирусы Puumala (доминирующий), Dobrava, Hantaan и Seul, относящиеся к семейству Bunyaviridae. В Республике Беларусь, как и в большинстве стран Европы, где регистрируется ГЛПС, доминирует вирус Puumala, основным носителем которого является рыжая полевка (Сlethrionomys glareolus). По результатам исследований в настоящее время на территории Республики Беларусь достоверно установлена циркуляция двух представителей хантавирусов, вызывающих ГЛПС - Puumala и Dobrava. В связи с этим актуальным является разработка и регистрация в системе здравоохранения Республики Беларусь диагностической тест-системы, позволяющей одновременно выявлять антитела к основным серотипам возбудителей ГЛПС (Puumala, Dobrava, Hantaan), с целью последующего использования в лабораторной диагностике для верификации диагноза.

Цель исследования - разработка диагностической тест-системы, позволяющей выявлять антитела ко всем серотипам хантавирусов, циркулирующих на территории Республики Беларусь.

Основу разработанной тест-системы составляют рекомбинантные антигены, включающие антигензначимые участки нуклеокапсидных белков вирусов Puumala, Dobrava, Hantaan. Для определения дизайна антигенов выполняли биоинформационный анализ структуры нуклеокапсида вирусов-возбудителей ГЛПС как основного вирусного антигена, регистрируемого уже в начале заболевания, на который, по имеющимся данным литературы, отмечается наиболее интенсивный гуморальный иммунный ответ. Для этого были использованы открытые интернет-ресурсы - UniProtКВ, Immune Epitope Database and Analysis Resource, а также авторская компьютерная программа wxGeneBee, разработанная российско-белорусскими программистами. По результатам анализа были установлены аминокислотные последовательности нуклеокапсидных белков, включающие антигенные детерминанты и являющиеся потенциальными участками связывания специфических антител. На последующих этапах исследования с использованием молекулярно-биологических методов (обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция, молекулярное клонирование и биосинтез чужеродных белков) были экспрессированы соответствующие рекомбинантные полипептиды в прокариотической системе E.coli, штамм BL21 (DE3). Рекомбинантные полипептиды были очищены от содержания посторонних клеточных белков с использованием метода аффинной металлохелатной хроматографии. Антигенные свойства полученных полипептидов оценивали методами иммунного блоттинга (ИБ) и твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). В качестве анализируемого материала были использованы референс-сыворотки крови человека, содержащие специфические антитела к вирусам Puumala, Dobrava, Hantaan (получены из референс-лаборатории Федерального научного центра исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН, Российская Федерация) и сыворотки крови человека, не содержащие специфических антител. По результатам постановки ТИФА и ИБ было установлено, что полученные рекомбинантные белки проявляли выраженные антигенные свойства - специфически связывали соответствующие антитела, присутствующие в сыворотке крови и в то же время, не взаимодействовали с компонентами нормальной человеческой сыворотки. Данные результаты позволили использовать полученные рекомбинантные полипептиды вирусов Puumala, Dobrava, Hantaan в качестве основных антигенных компонентов для разработки диагностической тест-системы.

Область применения: лабораторная диагностика.
Рекомендации по использованию: в клинико-диагностических лабораториях инфекционных стационаров, лабораториях диагностики особо опасных инфекций Республиканского и областных центров гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья, иных учреждениях, осуществляющих диагностику ГЛПС.
Предложения по сотрудничеству: выпуск и реализация диагностической тест-системы по разовым договорам, а также в рамках централизованных закупок для организаций здравоохранения.

Иммуноферментная для определения антигенов хантавирусов

набор из 12 компонентов

Описание

Ÿ планшет для иммунологических реакций, полистироловый или полихлорвиниловый, монолитный;

иммуноглобулин человека класса G (ИГ+), сухой, содержащий антитела к хантавирусу, аморфная масса белого цвета;

иммуноглобулин человека класса G (ИГ-) сухой, не содержащий

антител к хантавирусу, аморфная масса белого цвета;

Ÿ антиген хантавируса (АГ+), сухой, инактивированный, аморфная масса белого или светло-розового цвета;

Ÿ коньюгат, жидкий – иммуноглобулин человека класса G (IgG),

содержащий антитела к хантавирусу, коньюгированный с

пероксидазой хрена, вязкая, прозрачная жидкость;

* Взамен: Инструкции по применению, утвержденной 19 мая 1999 года

Ÿ Альбумин из бычьей сыворотки (БСА), стабилизатор, сухой

кристаллический порошок белого или светло-желтого цвета;

Ÿ Концентрат ( х100) фосфатно-солевого буферного раствора, (ФСБх100) – бесцветная прозрачная жидкость, возможно выпадение

осадка, растворяющегося при температуре от 300 до 400 С в течение

Ÿ Концентрат (х2) цитратно-фосфатного буферного раствора, (ЦФБ),

бесцветная прозрачная жидкость;

Ÿ Твин-20, жидкий;

Ÿ Хромоген – ортофенилендиамин (ОФД), таблетка серо-коричневого цвета;

Ÿ Стоп-реагент – серная кислота, 1 М раствор, бесцветная прозрачная жидкость;

Ÿ Гидроперит сухой, таблетка белого цвета.

Набор рассчитан на исследование 48 анализов, включая анализ

контрольного образца АГ+.

1. Приготовление рабочих растворов и реагентов:

1.1. Рабочий раствор ФСБ. ФСБ (х100) разводят до 1 л дистиллированной водой. Раствор предназначен для растворения ИГ+, ИГ- (10 мл), и является исходным для приготовления раствора для отмывания планшета (ФСБ-Т) и раствора для разведения коньюгата (1% раствор БСА в ФСБ-Т). Хранят при температуре 2-8 0С в течение 3 сут.

1.2. ФСБ-Т – во флакон с 0,5 мл твина-20 добавляют 5,0 мл рабочего раствора ФСБ, и смесь осторожно перемешивают до получения

однородного раствора, не допуская образования обильной пены.

Полученный раствор переносят пипеткой в оставшийся объем (985 мл)

рабочего раствора ФСБ. Раствор предназначен для отмывания

планшета и для приготовления 1%-ного раствора БСА в ФСБ-Т. Хранят

при температуре 2-8 0С в течение 4 сут.

1.3. ФСБ — БСА – к 10 мл раствора ФСБ-Т добавляют содержимое флакона с БСА и, не встряхивая, оставляют при комнатной температуре до полного растворения белка. Раствор предназначен для разведения коньюгата. Готовят перед употреблением.

1.4. ЦФБ – к ЦФБ (х2) добавляют 6,0 мл дистиллированной воды и перемешивают. Раствор предназначен для приготовления раствора хромогена. Готовят перед употреблением.

1.5. Перекись водорода – таблетку гидроперита растворяют в 3 мл дистиллированной воды. Полученный раствор перекиси водорода готовят перед употреблением.

1.6. АГ+ — раствор АГ+ получают добавлением во флакон воды в объеме указанном на этикетке. Готовят непосредственно перед употреблением.

1.7. ИГ+, ИГ — — во флаконы с препаратом добавляют по 5,0 мл приготовленного раствора ФСБ. Растворы предназначены для сорбции планшета.

2. Проведение ИФА.

2.1. Сенсибилизация лунок планшета: планшет располагают согласно рекомендуемой схеме, т. е. вертикально так, чтобы буквы (от Н до А) находились вверху, а нумерация рядов (от 1 до 12) – справа (см. схему). Вносят по 0,1 мл рабочего разведения анти-хантавирусного IgG (ИГ+) человека в нечетные ряды лунок и по 0,1 мл рабочего разведения

нормального IgG человека (ИГ-) – в четные ряды лунок. Планшет накрывают

крышкой и выдерживают в холодильнике при температуре 4 – 8 0С в течение 16-20 ч, или при температуре 37 0С в течение 3 ч.

2.2. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют и лунки трижды промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края и сразу же удаляя раствор. Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.3. Внесение исследуемых образцов: в лунки планшета вносят по 0,05 мл исследуемых образцов суспензий, начиная от буквы Н до А — один образец в две вертикально расположенные лунки – с ИГ+ и ИГ-, а в последнюю пару лунок (А-11 и А-12) вносят по 0,05 мл контрольного антигена хантавируса. Панель накрывают крышкой и выдерживают в холодильнике при температуре 4 – 8 0С в течение 16-20 ч, или при температуре 37 0С в течение 2 ч.

2.4. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют и лунки 5 раз промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края (1-й раз сразу же удаляя раствор, а последующие 4 раза, выдерживая с раствором по 5 мин). Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.5. Приготовление рабочего разведения коньюгата: раствор для разведения коньюгата (1% р-р БСА в ФСБ-Т см. п. 1.3.) в объёме 6,4 мл вносят по флакон, содержащих пероксидазный коньюгат и тщательно перемешивают. Коньюгат в рабочем разведении не хранить, использовать сразу!

2.6. Внесение коньюгата: по 0,05 мл рабочего разведения перокисдазного коньюгата вносят по все лунки планшета. Планшет накрывают крышкой и выдерживают при температуре 37 0С в течение 1 ч.

2.7. Приготовление раствора хромогена: ОФД растворяют при перемешивании в 12 мл ЦФБ в течение 1-2 мин в темном месте. Непосредственно перед внесением в лунки к приготовленному раствору ОФД при перемешивании 0,01 мл раствора перекиси водорода.

2.8. Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок 37 0С удаляют и лунки 6 раз промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края (1-й раз сразу же удаляя раствор, а последующие 5 раз, выдерживая с раствором по 5 мин). Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.9. Внесение раствора хромогена: приготовленный раствор хромогена немедленно вносят по 100 мкл во все лунки планшета, который затем в условиях полной темноты выдерживают при комнатной температуре в течение 30 – 50 мин.

2.10. Стоп реагент: реакцию останавливают внесением во все лунки план-шета по 50 мкл стоп-реагента. Результат учитывают не позднее 30 мин.

Результат учитывают спектрофотометрически по оптической плотности (ОП) при длине волны 492 нм. Положительной считают пробу в случае, когда ОП лунки с ИГ+ превосходит ОП лунки с ИГ- в 2,1 и более раз.

Ÿ Планшет для иммунологический реакций — 1 шт.

Иммуноглобулин человека класса G, содержащий антитела

к хантавирусу (ИГ+), сухой — 1 флакон (0,1 мл)

Ÿ Антиген Хантавируса (АГ +), сухой, инактивированный 1 флакон (0,1 мл)

Ÿ Коньюгат, жидкий 1 флакон (5 или 20 мкл)

Ÿ Альбумин из бычьей сыворотки, сухой 1 флакон (0,1 г)

Ÿ Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора

(ФСБ х100) 1 флакон (10,0 мл)

Ÿ Концентрат (х2) цитратно-фосфатного буферного раствора

(ЦФБ) 1 флакон (6,0 мл)

Ÿ Твин-20, жидкий 1 флакон (0,5 мл)

Ÿ Хромоген (ортофенилендиамин) ОФД — 1 флакон (5,0 мг);

Ÿ Стоп-реагент – серная кислота, раствор 1М — 1 флакон (5,0 мл);

Ÿ Гидроперит, сухой — 1 табл

Ÿ Инструкция по применению — 1 шт.

Тест система с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Транспортирование: в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 0С. Допускается транспортирование при температуре до 250С в течение не более 2-х сут.

Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 в сухом помещении при температуре от 2 до 8 0С в недоступном для детей месте.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) -- вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. Случаи заболевания ГЛПС регистрируются в 58 из 83 административных регионов Российской Федерации и составляют ежегодно 8--10 тыс. больных в целом по стране.

Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, участившиеся случаи вспышек ГЛПС, ассоциированных с новыми, ранее не известными в России хантавирусами, свидетельствует о возрастающей медицинской и социальной значимости проблемы ГЛПС.

Открытию возбудителя ГЛПС предшествовал более чем 40-летний период поисков, успешно завершившийся в конце 70-х гг., когда впервые вирус-возбудитель ГЛПС был выделен в Южной Корее от полевой мыши Apodemus agrarius coreae [1].

Несколько лет после открытия возбудителя ГЛПС единственным лабораторным методом для выявления антигена вируса-возбудителя ГЛПС и антител к нему оставался непрямой метод флюоресцирующих антител (МФА) с использованием препаратов криостатных срезов легочной ткани полевых мышей. Ограниченные возможности этого метода, а также трудности, связанные с использованием криостатных срезов легочной ткани диких грызунов (отлов диких животных, транспортировка и хранение легочных тканей, нестандартность антигенной активности препаратов, спонтанная инфицированность грызунов реовирусами, низкая производительность и др.), существенно тормозили изучение ГЛПС, а также применение специфической диагностики этой инфекции в широкой практике. Это в основном и явилось основанием для разработки и усовершенствования методов лабораторной диагностики ГЛПС, чему посвящена настоящая работа.
В процессе исследований было разработано и усовершенствовано применительно к хантавирусам 23 метода, включая иммунологические, вирусологические и молекулярно-генетические.

• обнаружение и титрование вируса по индикации вирусспецифического антигена в клетках VERO-Е6 с использованием непрямого МФА;
• обнаружение и титрование вируса с использованием феномена фокусобразующих единиц (ФОЕ) [10, 11];
• реакция нейтрализации [10, 11].

Реакция нейтрализации с использованием феномена подавления числа ФОЕ применялась в собственной модификации, предусматривающей добавление комплемента при экспозиции вирус-сывороточной смеси, что стандартизует результаты нейтрализующей активности антител в сыворотках крови с различным сроком хранения. По нашим данным, такая модификация позволяет наиболее достоверно выявлять антигенные взаимоотношения между хантавирусами и, соответственно, обеспечивать надежную информацию к таксономической классификации хантавирусов.

Молекулярно-генетические методы:

• выделение хантавирусной РНК с использованием гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией;
• амплификация и секвенирование нуклеотидных последовательностей РНК-сегментов хантавирусного генома [13--15].

При сравнении эффективности применения разработанных нами иммунологических методов принимали во внимание не только их высокую чувствительность и специфичность, но и доступность для широкого применения в условиях практического здравоохранения. Кроме того, учитывали перспективность технологии промышленного изготовления диагностических препаратов. Так, в соответствии с этими критериями оценки эффективности было показано, что по сравнению с ранее применявшимся непрямым МФА (препараты криостатных срезов) возможность широкого практического применения иммуносорбентных методов ИФА и РИА для выявления вирусспецифического антигена у мелких млекопитающих в природных очагах ГЛПС имеет очевидные преимущества, обусловленные высокой производительностью при обследовании большого количества образцов суспензий органов, не нуждающихся в дополнительной очистке от грубых примесей, простотой и объективностью учета результатов опыта. Кроме того, в отличие от непрямого МФА иммуносорбентные методы и РНГА, обладая практически одинаковой чувствительностью и специфичностью, позволяют определять количественное содержание антигена в исследуемых материалах. Вместе с тем следует отметить, что при сравнении возможностей использования ИФА, РИА и РНГА для выявления хантавирусного антигена предпочтение отдано ИФА, поскольку применение РИА требует наличия дорогостоящего оборудования и высокого качества радиоактивных препаратов, а также специальной подготовки персонала, что ограничивает возможности использования этого метода в учреждениях практической сети здравоохранения. Что касается РНГА и РТНГА, то эффективность их широкого практического применения ниже по сравнению с ИФА и РИА, что связано главным образом с необходимостью предварительной обработки исследуемых материалов эритроцитами барана для удаления гетероагглютининов. При оценке эффективности применения двух вариантов непрямого МФА для выявления специфических хантавирусных антител в сыворотках крови больных и переболевших ГЛПС людей из разных регионов России было показано, что частота выявления серопозитивных лиц и среднегеометрические титры антител, выявляемых непрямым МФА с культуральным антигеном хантавируса (92%, титр Σ 8,3 log2), была значительно выше по сравнению с тем же методом, но с применением в качестве антигена препаратов криостатных срезов легочной ткани животных (72%, титр Σ 4,5 log2) [16].

Биотехнологические основы конструирования диагностикумов ГЛПС

Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культуральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции.

До разработки технологии изготовления культурального поливалентного диагностикума в том виде, в котором этот препарат был передан для промышленного освоения, пройден длительный и важный этап его конструирования. Этот этап был связан с усовершенствованием и оптимизацией процессов изготовления диагностического препарата, обусловленных как использованием в технологии новых данных, касающихся особенностей гуморального иммунитета при ГЛПС, антигенной вариабельности хантавирусов и их репродукции в культуре клеток, так и чисто практическими проблемами, возникавшими при широком применении диагностикума.

Первоначально культуральный диагностикум готовили на основе прототипного штамма Hantaan 76-118, полученного из Южной Кореи. Однако применение такого диагностикума в европейских очагах ГЛПС оказалось малоэффективным, особенно в ранние сроки болезни, поскольку циркулирующий в этих очагах вирус-возбудитель ГЛПС имеет, как выяснилось позже, антигенные различия с прототипным штаммом. В связи с этим для приготовления культуральных антигенов стали использовать выделенные нами в европейском и дальневосточном регионах России штаммы, относящиеся к хантавирусам Puumala и Hantaan. Вначале готовили и применяли моновалентные антигены (отдельно для каждого хантавируса), а затем комбинированный двухвалентный препарат, с тем чтобы при серологическом исследовании сывороток крови больных ГЛПС не пропустить гетерологичный для данного региона хантавирусный серотип. Диагностикум включал антигенные препараты, изготовленные по авторской технологии из 2 штаммов, представлявших штаммы хантавирусов Puumala и Hantaan, положительные и отрицательные контрольные сыворотки и ФИТЦ-конъюгат IgG против иммуноглобулинов человека. Поскольку антитела, вырабатываемые в ответ на заражение человека вирусами-возбудителями ГЛПС, относящимися к хантавирусам Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, при исследовании непрямым МФА перекрестно реагируют с минимальной разницей в титре, включение в состав диагностикума одного из этих вирусов для выявления антител ко всем остальным представлялось оправданным. Однако впоследствии было показано, что в остром периоде болезни титры антител в сыворотках крови больных ГЛПС, ассоциированной с хантавирусами Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, в 2--4 раза выше c гомологичным антигеном (в поздних сыворотках эта разница нивелируется). В этой связи для повышения чувствительности препарата при определении антител в ранние сроки болезни диагностикум ГЛПС был усовершенствован: в состав комбинированного двухвалентного антигена были дополнительно включены культуральные антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Seoul и Dobrava/Belgrad (рис. 1).

При разработке экспериментальных серий препарата были проведены научные исследования по изучению оптимальных условий размножения хантавирусных штаммов в культуре клаток VERO-Е6 и накопления вирусспецифического антигена; оптимальных условий приготовления антигенных препаратов; параметров полной инактивации инфекционной активности хантавирусов; оптимальных условий постановки непрямого МФА для выявления вирусспецифических флюоресцирующих антигенов хантавирусов и др.

Успешная апробация культурального диагностикума ГЛПС в широкой практике (серологически обследовано более 20 тыс. больных с подозрением на ГЛПС на 17 административных территориях России) и определение реальных потребностей в препарате практического здравоохранения явились обоснованием к технологической разработке промышленного производства этого диагностикума. Была разработана и утверждена соответствующая нормативно-техническая документация по изготовлению, контролю и применению культурального поливалентного диагностикума ГЛПС, проведены комиссионные испытания диагностикума в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также утверждена фармакопейная статья на диагностический препарат.

В настоящее время диагностикум ГЛПС выпускается в виде набора реагентов, содержащего культуральный антигенный препарат и контрольные сыворотки. Антигенный препарат является основным действующим компонентом комплекта. Он представляют собой равномерно нанесенные на предметное стекло по 0,005 мл высушенные, инактивированные ультрафиолетовым облучением и фиксированные ацетоном суспензии клеток VERO-E6, содержащие специфические антигены, приготовленные на основе штаммов хантавирусов Puumala, Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad, и клетки, не содержащие хантавирусных антигенов в соотношении 2:1:1:1:1. Визуально на стекле антиген определяется в виде серых пятен диаметром 2--З мм (по 12 или 21 капле на каждом стекле). Помимо антигенных препаратов, набор содержит контрольные иммунные сыворотки: анти-Hantaan, выявляющую антигены хантавирусов Hantaan, Seoul и Dobrava/Belgrad; анти-Puumala, выявляющую антигены хантавируса Puumala; нормальную сыворотку человека, а также ФИТЦ-конъюгат против глобулинов человека.

Несомненным достоинством диагностикума ГЛПС является то, что в антигенном поливалентном препарате имеется весь набор присущих хантавирусу антигенных детерминант, представленных в цитоплазме клеток в составе зрелых вирионов, а также компонентов сборки вирусных частиц: белка нуклеокапсида, гликозилированного белка наружной оболочки и его предшественников, вирусной РНК. Именно поэтому непрямой МФА остается стандартом при сравнении специфичности и чувствительности вновь создаваемых диагностических препаратов для серодиагностики ГЛПС.

Следует отметить, что культуральный диагностикум применяется и для исследования сывороток крови животных на присутствие хантавирусных антител. Для этого необходимо использовать ФИТЦ-конъюгат против глобулинов того вида животных, которому принадлежит исследуемая сыворотка.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом занимает ведущее место по заболеваемости среди природно-очаговых инфекций в России. Заболевание протекает как острая инфекция с поражением почек, легких, центральной нервной и гормональной систем, наличием в ряде случаев тяжелых осложнений в остром периоде, приводящих к летальным исходам, и характеризуется длительным сроком восстановления до полного выздоровления. В этой связи проблема ГЛПС представляет серьезную медико-социальную проблему.

Открытие вируса -- одного из возбудителей этого заболевания в 1978 г. (Lee H.W. et al., 1978) стало этапным в изучении этой инфекции, а название вируса -- Хантаан стало родовым для многочисленных впоследствии открытых вирусов, как патогенных, так и не патогенных для человека.

Начало наших исследований по этой проблеме совпало с началом становления хантавирусологии. В первую очередь остро стоял вопрос методической составляющей исследований, поскольку в арсенале экспериментаторов поначалу имелся только метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием криостатных срезов легких инфицированных грызунов -- природных носителей вируса. Отсутствовала специфическая диагностика заболевания, соответственно, вопросы этиологии, ареала и нозоареала инфекции, о ее носителях в природе требовали своего решения.

В начале наших исследований наиболее важным был вопрос обеспечения исследований ГЛПС высокоэффективными и стандартными диагностическими препаратами. Это препараты для специфической лабораторной диагностики ГЛПС у больных людей, с одной стороны, и, с другой, для выявления возбудителей этой инфекции во внешней среде, поскольку источником заражения людей служат дикие грызуны.

В связи с этим были определены основные параметры конструирования иммуноглобулиновых диагностических препаратов, что позволило разработать технологическую схему их промышленного производства. Были разработаны и утверждены нормативно-технические документы по изготовлению, контролю и применению иммуноглобулиновой пероксидазной тест-системы для ИФА и культурального поливалентного диагностикума ГЛПС для непрямого МФА.

Экспериментальная разработка лабораторных методов применительно к хантавирусам и промышленное производство диагностических препаратов ГЛПС в значительной мере способствовало успеху, достигнутому в нашей стране и за рубежом в изучении ГЛПС, а также решению ряда задач практического здравоохранения, связанных с этой инфекцией.

Широкое применение разработанных нами методов специфической диагностики применительно к хантавирусам для обследования людей и мелких млекопитающих позволило значительно расширить наше представление о географическом распространении возбудителей ГЛПС и их носителей в природе. Отмечена тесная корреляция при обнаружении инфицированных хантавирусом мелких млекопитающих и серопозитивных к этому вирусу лиц среди населения административных территорий, где проводились параллельные исследования мелких млекопитающих и людей. В последние годы, благодаря серологическому обследованию людей с заболеваниями, сходными по некоторым симптомам с ГЛПС, в ряде районов России, в которых ранее не регистрировалась заболеваемость ГЛПС, были выявлены больные этой инфекцией.

1. Впервые, применительно к хантавирусам, разработан комплекс лабораторных методов исследования материалов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих, позволивших существенно повысить эффективность специфической диагностики ГЛПС и получить новые данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусных лихорадок в нашей стране и за рубежом.

2. Результаты сравнительной оценки эффективности клинической и специфической лабораторной диагностики ГЛПС позволили установить истинные размеры заболеваемости, расширить представление о диапазоне клинических проявлений инфекции.

3. Получены экспериментальные данные, которые составили основу технологии изготовления иммунобиологических препаратов, предназначенных для специфической лабораторной диагностики ГЛПС.

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - острое, вирусное заболевание зоонозной природы, характеризующееся системным поражением мелких кровеносных сосудов, геморрагическим диатезом и своеобразным поражением почек, высоким уровнем заболеваемости, тяжелым течением (нередко с летальным исходом) и стойкой потерей трудоспособности. Отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую социальную и медицинскую значимость ГЛПС как в России, так и во многих странах мира. Случаи заболевания ГЛПС выявлены в 57 административных регионах Российской Федерации и составляют ежегодно 8-10 тысяч больных, при этом 98% заболеваемости регистрируется в Европейской части России.

Наиболее эффективным методом борьбы с ГЛПС является вакцинопрофилактика, что было продемонстрировано в Китае и Южной Корее. В настоящее время коммерческие вакцины против ГЛПС производятся только в Китае, однако ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России, так как не обеспечивает защиты от вирусов Пуумала и Добрава - возбудителей ГЛПС в этих регионах.

Для изготовления и контроля вакцины против вирусов, возбудителей ГЛПС, необходимо решить проблему разработки эффективных методов контроля содержания специфических антигенов - индукторов иммунного ответа в вакцинных препаратах, в том числе на технологических этапах их производства. Одним из способов иммунохимического определения вирусных белков является метод иммуноферментного анализа. Для повышения специфичности и чувствительности анализа в качестве основы такого метода было решено использовать моноклональные антитела.

Целью предлагаемого изобретения является получение универсальной иммуноферментной тест-системы определения иммуногенных белков хантавирусов - возбудителей ГЛПС.

получение очищенных моноклональных антител к хантавирусам Пуумала и Добрава, отбор антител, перекрестно-реагирующих с вирусами Пуумала, Добрава, Хантаан, Сеул, и приготовление конъюгата моноклональных антител с пероксидазой хрена (далее пероксидазный конъюгат), комплектация набора тест-системы.

Более подробно получение тест-системы осуществляют следующим образом.

I. Получение моноклональных антител. Мышей линии BALB/c иммунизируют очищенными препаратами инактивированных вирусов (Пуумала, штамм К-27/Уфа-85 и Добрава, штамм Аа 1854/Липецк-06) в дозе 100мкг/мышь. Иммунизацию проводят в подушечки задних лап дважды с двухнедельным интервалом. Клетки подколенных лимфоузлов иммунных мышей гибридизуют с клетками мышиной миеломы линии SP2/0 по стандартной методике, используя полиэтиленгликоль 4000. Гибридомные клетки, продуцирующие специфические антитела, подвергают 2-4-кратному клонированию методом предельных разведений. Клоны гибридомы с устойчивой продукцией антител нарабатывают в культуре в среде DMEM (HyClone) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки. Для наработки антител гибридомные клетки вводят в перитонеальную полость мышей, через 7-14 дней регистрируют развитие асцитных опухолей.

Асцитные жидкости проверяют на содержание специфических антител методом иммуноферментного анализа. Для этого образцы, содержащие очищенные антигены хантавирусов в концентрации 100 нг/мл в фосфатносолевом буфере (ФСБ), вносят в лунки иммунопанели (Costar, 3018), с последующей инкубацией при 6±2°С - 18 часов. Далее в лунки вносят 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, 8159) и панели оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре (22±3°С). После отмывания панели (здесь и далее: 5 раз по 5 мин раствором 0,01 М ФСБ+0,05% Tween-20) в лунки вносят культуральную жидкость гибридомы. После 1 ч контакта при 37°С лунки отмывают и вносят меченные пероксидазой хрена IgG против иммуноглобулинов мыши (Sigma, A 4416). В качестве индикатора используют тетраметиленбензидин (ТМБ, Sigma, T8665). Антитела (IgG) выделяют из асцитных жидкостей аффинной хроматографией на колонке с HiTeap ProteinG (GE Healthcare, 17-0405-03). Очищенные моноклональные антитела стандартизуют по белку (до 1 мг/мл) и далее определяют их специфическую активность методом иммунофлюоресценции.

II. Отбор перекрестно-реагирующих антител проводят методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моновалентных культуральных антигенов хантавирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул. Антигены хантавирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул для метода иммунофлюоресценции получают путем заражения культуры клеток VеrоЕ6 с множественностью 0,1-0,5 ФОЕ/кл при объеме инокулята 15 мл на 1-литровую роллерную бутыль. Сбор клеток, содержащих вирусные антигены, проводят на 10-11 сутки инкубации зараженных клеток при 37±1°С. Клетки снимают со стекла смесью 0,02% версена и 0,5% трипсина, 5-кратно отмывают 0,85% раствором NaCl, готовят суспензию инфицированных клеток (450-550 тыс.кл/мл) и наносят ее по 0,005 мл на предметные стекла для иммунофлюоресценции. После высушивания стекла помещают на 30 минут в охлажденный ацетон для фиксации клеток и инактивации вируса и затем высушивают при комнатной температуре. Аналогично готовят контрольные антигены из незараженных клеток VеrоЕ6. Образцы мАТ титруют на 0,85% растворе NaCl и наносят на антигенные препараты. Для индикации мАТ, связавшихся с антигеном, используют антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флюоресцеинизотиоционатом. Опыт учитывают с помощью люминесцентного микроскопа под водно-иммерсионным объективом (×60 или ×65).

Отбирают клоны антител Пуумала и Добрава, в равной степени перекрестно реагирующие с антигенами вирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул. Нами использованы 2 клона антител, соответствующие этим характеристикам: моноклональные антитела к вирусу Пуумала - ПУУ/Н6 и к вирусу Добрава - ДОБ/А4.