Рнк зависимая днк полимераза вируса
В прошлой части эссе вы познакомились с химиотерапевтическими стратегиями, которые могут помочь бороться с вирусными заболеваниями, блокируя возбудителя на ранних этапах его попадания в клетку.
Однако урон вирусу современная химия может нанести и тогда, когда он собрался размножаться, то есть заниматься тем единственным делом, которое отличает его от неживой материи.
Хочу сразу сказать, что вирусы — существа бесполые, так что о сексе нам говорить не придётся. Ну только если в контексте продирания сквозь кучу новой информации. Этакое химико-биологическое чтиво с налётом BDSM.
Как вы поняли из предыдущей части, вирусы, несмотря на морфологическое сходство, очень неоднородны в своей физиологии, т. е. в том, как они взаимодействуют с клеткой организма хозяина.
Эта разнородность, т. е. множество используемых этими организмами жизненных стратегий, ещё лучше видна при переходе к рассмотрению следующей точки возможного лекарственного приложения противовирусных препаратов — их размножению.
Размножение вирусов сводится к тиражированию их нуклеиновой кислоты (НК). Часть вирусов, такие как ВИЧ и вирус гриппа, высвобождает НК прямо в цитоплазму клетки, а часть вирусов доставляет её непосредственно в ядро. Это первый пример разнообразия их внутриклеточного поведения, которого, правда, мы касаться не будем.
Гораздо важнее то, какая именно НК и каким образом копируется. Дальше будет немного скучно, но без этого понять, как можно бороться с тем или иным вирусом на стадии его размножения, невозможно.
Прежде всего, спасибо стоит сказать нобелевскому лауреату Дэвиду Балтимору, который в 1971 году предложил классификацию вирусов в зависимости от содержащейся в них НК и способа её репликации.
Чтобы понять таблицу, надо дать несколько пояснений.
Репликация заключается в том, что НК первичного вириона, который попал в клетку-хозяина, становится матрицей для получения НК дочерних вирионов, которые выходят из клетки. Поскольку молекула НК является полимером, то фермент, который её копирует, именуется полимеразой. ДНК-полимераза синтезирует ДНК, а РНК-полимераза синтезирует РНК. Важно, что является матрицей для копирования. Если матрица — РНК, то фермент является РНК-зависимым, если матрица — ДНК, то ДНК-зависимым. Итого имеется 4 варианта.
Вирус — паразит, ему желательно по максимуму задействовать в своей жизнедеятельности аппарат клетки. Поскольку клетка размножается и синтезирует белок, то в ней тоже есть ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы. Но надо чётко помнить, что в клетке возможно только движение от ДНК к ДНК при размножении или от ДНК к РНК при транскрипции для синтеза белка. То есть в клетке могут быть только ДНК-зависимые ДНК-полимеразы или ДНК-зависимые РНК-полимеразы и никаких других.
Второй пример. Имеем однонитевую ДНК в вирионе. Значит фермент — ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Поскольку переход ДНК->ДНК в клетке возможен, то репликацию вирусной ДНК может вести как фермент клетки хозяина, так и фермент вируса. Можете потренироваться сами на вирусах других классов по классификации Балтимора.
Вирусы типов VI и VII по классификации Балтимора реплицируют свою НК не напрямую, а через интермедиат, то есть промежуточную молекулу НК. Посмотрите таблицу. Если вы поняли то, что написано выше, разобраться с этими вирусами вам тоже не составит труда. Скажу только, что РНК-зависимую ДНК-полимеразу, которую используют эти вирусы при манипуляциях с НК-интермедиатом, принято называть обратной транскриптазой.
Я надеюсь, что теперь вы самостоятельно сможете предложить химиотерапевтическую стратегию для лечения заболевания, вызванного тем или иным вирусом!
Стратегия это заключается в блокировании фермента, участвующего в репликации вируса. Поскольку вирус III-V классов содержит РНК, то надо блокировать РНК-зависимую РНК-полимеразу. В организме человека такого фермента нет, поэтому побочных эффектов, связанных с непосредственным действием лекарства, быть не должно (что не исключает побочных эффектов другого рода).
Если вирус содержит ДНК, то надо выяснить, чей фермент участвует в её репликации. Если это фермент хозяйской клетки, то, скорее всего, химотерапевтическую стратегию, основанную на подавлении репликации вируса, применять не стоит, так как будет заблокировано деление клеток, что может обернуться проблемой. Если же ДНК-зависимая ДНК-полимераза у вируса своя, то можно пробовать поискать её ингибитор.
Ну и, наконец, для вирусов VI и VII надо блокировать обратную транскриптазу.
Теперь, наконец-то, переходим к химии и рассмотрим примеры лекарственных молекул для лечения вирусных заболеваний, которые ингибируют полимеразы НК.
Помнящие биологию могут предположить, что в качестве таких неправильных ключей применительно к полимеразам НК могут быть использованы аналоги азотистых оснований, слагающих нуклеиновые кислоты, т. е. аналоги аденина, тимина, цитозина, гуанина и урацила.
Ладно, не буду томить, перейду к примерам.
Самый известный пример — ацикловир, который используется для лечения проявлений герпеса, вызываемого одноименным вирусом, содержащим двунитевую молекулу ДНК и собственную ДНК-зависимую ДНК-полимеразу.
Ацикловир очень похож на дезоксинуклеозид дезоксигуанозин.
Действует ацикловир так.
Второй очень известный и важный пример — это азидотимидин, или зидовудин, первое лекарство против СПИДа.
Азитотимидин, как это следует из названия, является аналогом дезокситимидина. Он также фосфорилируется, но уже клеточными ферментами, и блокирует работу вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы, т.е. обратной транскриптазы, что останавливает размножение вируса.
И зидовудин, и ацикловир являются так называемыми нуклеозидными ингибиторами, так как похожи по строению на нуклеозиды, из которые строятся НК. Обратите внимание, что в обоих структурах модификации подверглась углеводная часть молекулы, а часть от азотистого основания осталась неизменной.
Конечно, для получения нуклеозидного ингибитора модифицировать можно не только углеводную часть молекулы, но и фрагмент азотистого основания. Примером может служить такой ингибитор обратной транскриптазы как эмтрицитабин, применяемый для терапии ВИЧ и гепатита В, вирус которого относится к VII классу по Балтимору и также использует обратную транскриптазу.
Однако ингибиторы полимераз НК совсем не обязательно должны быть похожими на их обычные субстраты, то есть нуклеозиды. Существует обширный класс ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы, структуры которых с выше перечисленными соединениями не имеют ничего общего.
Как действуют эти ингибиторы?
Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы как раз и являются такими веществами. Они связываются с ферментом и изменяют его форму таким образом, что он больше не может выполнять свою функцию, это останавливает размножение вируса.
Посмотрите коротенький ролик, визуализирующий изменение формы молекулы обратной транскриптазы под действием невирапина. Обратите внимание, что в ходе такого изменения нарушается связь фермента с растущей цепью РНК (показана серым цветом в верхней части):
Итак, я привёл примеры 2 классов ингибиторов обратной транскриптазы, используемых для лечения болезней, вызываемых вирусами VI и VII классов по Балтимору, а также пример ингибитора вирусной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, который блокирует размножение вируса I класса по Балтимору (вируса герпеса).
Что насчёт других РНК-содержащих вирусов?
Широко известным антивирусным препаратом, который применяется при сравнительно большом спектре заболеваний (гепатит С, геморрагические лихорадки и др.), является рибавирин.
Наличие в молекуле рибавирина фрагмента D-рибозы позволяет отнести его к аналогам рибонуклеозидов, из которых строится РНК, и предположить, что он может ингибировать РНК-зависимые РНК-полимеразы. Кроме того, считается, что рибавирин способствует и тому, чтобы РНК-полимераза делала в своей работе огромное количество ошибок. Это приводит к созданию РНК настолько нашпигованной большим количеством мутаций, что многие вирусные белки, структуру которых она кодирует, попросту оказываются нефункциональными, поэтому несущий её вирион не может сделать с клеткой ничего плохого.
Интересно, что рибавирин может угнетать активность и ДНК-содержащих вирусов. Однако причины такой активности до сих пор точно не установлены.
Вопросы для самоконтроля.
- К какому классу по Балтимору может относится вирус, если спустя некоторое время после попадания его ДНК в клетку, в ней начинает обнаруживаться РНК? Какие уточнения нужны для того, чтобы дать однозначный ответ?
- Известно, что в репликации вирусной НК изучаемого вами вируса принимает участие ферментный аппарат клетки хозяина. К каким классам по Балтимору он может относится? С какими трудностями может быть сопряжена разработка разработка ингибиторов репликации этого вируса?
- Почему при терапии ВИЧ не применяют нуклеозидные ингибиторы-аналоги урацила?
- Как выдумаете, почему практически все нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы содержат в своей молекуле остаток сахара (модифицированной рибозы или дезоксирибозы)?
- Как вы думаете, почему при терапии ВИЧ возникла необходимость в ненуклеозидных ингибиторах обратной транскриптазы?
- Как вы думаете, к какому классу ингибиторов обратной транскриптазы (нуклеозидные или ненуклеозидные) относится препарат, структура действующего вещества которого изображена ниже?
7. Предложите механизмы действия рибавирина в отношении ДНК-содержащих вирусов.
| РНК-зависимая РНК-полимераза | |
|---|---|
 |
| Поиск | |
|---|---|
| PMC | статьи |
| PubMed | статьи |
| NCBI | белки |
| РНК зависимой РНК-полимеразы | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||||||||
| Условное обозначение | RdRP_1 | ||||||||
| Pfam | PF00680 | ||||||||
| Pfam клан | CL0027 | ||||||||
| InterPro | IPR001205 | ||||||||
| СКОП | 2jlg | ||||||||
| СУПЕРСЕМЕЙСТВА | 2jlg | ||||||||
| |||||||||
| РНК-полимераза направленной РНК, флавивирусной | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||||||||
| Условное обозначение | RNA_pol_flaviviral | ||||||||
| Pfam | PF00972 | ||||||||
| InterPro | IPR000208 | ||||||||
| |||||||||
РНК-зависимой РНК - полимеразы ( RDRP ), ( РДР ), или РНК - репликазы , является ферментом , который катализирует репликацию из РНК из РНК - матрицы. Это в отличие от типичного ДНК-зависимой РНК - полимеразы , который катализирует транскрипцию РНК из ДНК матрицы.
РНК-зависимой РНК - полимеразы (RdRp) является одним из важнейших белок , кодируемый в геномах всех РНК-содержащих вирусов, не имеющих стадии ДНК , т.е. только РНК -содержащих вирусов . Она катализирует синтез РНК - нити , комплементарной данной матрицы РНК. Процесс репликации РНК представляет собой механизм , в два этапа. Во- первых, на этапе инициации синтеза РНК начинается на или вблизи конца 3' - РНК - матрицы с помощью праймера -независимый ( De Novo ), или механизм праймера зависит , который использует вирусный геном белка-сшитый (ВПГ) праймера , De Novo инициация состоит в добавлении нуклеозидтрифосфата (NTP) на 3'-ОН от первого инициирующего NTP. В течение следующей так называемой фазы элонгации, это nucleotidyl реакция передачи повторяется с последующим НПТОМ для создания комплементарного РНКА продукта.
содержание
история
Вирусное RdRPs было обнаружено в начале 1960 - х лет из исследований по mengovirus и вирусу полиомиелита , когда было замечено , что эти вирусы не были чувствительны к актиномицин D , препарат , который ингибирует синтез РНКА клеточной ДНК-направленные. Отсутствие чувствительности предположил , что есть вирус-специфический фермент , который может копировать РНК из РНК - матрицы , а не из шаблона ДНК.
Многие RdRPs тесно связаны с мембранами и, следовательно, трудно учиться. Наиболее известными являются RdRPs polioviral 3Dpol, вирус везикулярного стоматита L, и вирус гепатита С NS5B белка.
Многие эукариоты также RdRPs , участвующих в РНК - интерференции ; они усиливают микроРНК и малые временные РНК и производят двухцепочечную РНК с использованием малых интерферирующих РНК в качестве праймеров. На самом деле эти же RdRPs, которые используются в защитных механизмов может быть захвачено РНК вирусов в их пользу.
RdRps высоко консервативны во всех вирусах и даже связан с теломеразой , хотя причина столь высокого сохранения в таких разнообразных организмах , представляет собой непрерывный вопрос 2009 года Сходство привело к предположению , что вирусный RdRps является предком теломеразы человека.
Состав
Все РНК-направленная РНК-полимераза, и многие ДНК-полимераза направлены, используют складку, чья организация была уподоблена формой правой руки с тремя поддоменов называемых пальцами, ладонью и большим пальцем. Только пальмовое подобласть, состоит из четырех многожильных антипараллельной бета-лист с двумя альфа-спиралей, хорошо консервативными среди всех этих ферментов. В RdRp, ладонь подобласть включает в себя три хорошо консервативные мотивы (А, В и С). Мотив А (Dx (4,5) -D) и мотив С (ДДГ) пространственно сопоставляются; остатки Asp этих мотивов подразумеваются в связывании Mg2 + и / или Mn2 +. Asn остаток мотива B участвует в выборе рибонуклеозидтрифосфаты более дНТФ и, таким образом, определяет, является ли синтезируется РНК, а не ДНК. Организация домена и 3D-структура каталитического центра широкого спектра RdPps, даже те, с общей гомологии последовательности низкой, сохраняются. Каталитический центр образован несколько мотивов, содержащего ряд консервативных аминокислотных остатков.
классификация
Есть 4 надсемейства вирусов, которые охватывают все РНК-содержащие вирусы без стадии ДНК:
- Вирусы, содержащие положительно-нити РНК или двухцепочечной РНК, за исключением ретровирусов и Birnaviridae: вирусные РНК-направленной РНК-полимеразы, в том числе всех положительных-нить РНК-вирусов, без каких-либо стадии ДНК, двухцепочечную РНК-вирусов, а также Cystoviridae, Reoviridae, Hypoviridae, Partitiviridae , Totiviridae семьи
- Mononegavirales (отрицательные пряди РНК-вирусы с несегментированными геном)
- Отрицательные пряди РНК-вирусы с сегментированными геномами, т.е. ортомиксовирусами (в том числе гриппа А, В и С, вирусами Thogotoviruses и вирус анемии инфекционного лососевой), аренавирусы, Bunyaviruses, Хантавирусы, Nairoviruses, Phleboviruses, Tenuiviruses и тосповирусы
- дсРНК вирус семья Birnaviridae
РНК-полимеразы, направленной РНК в первой из указанных выше надсемейств можно разделить на следующие три подгруппы:
- Вся положительная нитей РНК эукариот вирусы без стадии ДНК
- Все РНК-содержащие бактериофаги -Есть два семейства РНК-содержащих бактериофагов: Leviviridae (положительные оцРНК фаги) и Cystoviridae (дцРНК фаги)
- дсРНК вирус семья Reoviridae
Транскрипции РНК аналогична , но не такой же , как ДНК - репликации Флавивирусы производят полипротеин из генома оцРНК. Полипротеина расщепляется на ряд продуктов, одним из которых является NS5. Рекомбинантный тип вируса денге 1 NS5 белок экспрессируется в кишечной палочки проявляет РНК-зависимой РНК - полимеразной активностью. Эта РНК-полимераза направленной РНК обладает рядом коротких областей и мотивы , гомологичных к другим РНК-направленной РНК - полимераз.
Вирус гепатита В (частица Дейна) - ДНК-содержащий вирус из семейства Hepadnaviridae, диаметром 42 нм. Липопротеидная оболочка содержит поверхностный антиген HBsAg (австралийский антиген), открытый Бламбергом в 1965г. В частицах HBsAg определяются три белковых домена (Pre-S1, Pre-S2, S), липидный и углеводный компонент, а также рецептор полимеризованного альбумина рАR (рис. 1.).
Рис. 1. Структура вируса гепатита B
Гепатоциты (клетки печени) имеют рецептор для полиальбумина, предполагается, что с помощью рАR HBV проникает в клетку.
Существует один главный серотип и генетически устойчивые подтипы HBsAg, определяемые набором антигенных детерминант его поверхности: adw, adr, ayw, ayr.
В структуру нуклеокапсида (ядерного антигена - HBcAg) входят: субъединица HBeAg, ДНК-полимераза (обратная транскриптаза), протеинкиназа и ДНК.
Молекула ДНК (HBV DNA) частично однонитчатая, кольцевой конфигурации.
HBeAg образуется в процессе превращения белка Pre-core в структурный белок core и выделяется за пределы клетки (служит маркером репликации вируса).
Важные функции выполняют полипептидные Pre-S домены (регионы) HBsAg.
Pre-S1 регион HBsAg “распознается” рецепторами гепатоцита. Его содержание в крови служит отражением репликации вируса. К Pre-S1 вырабатываются вируснейтрализующие антитела, нарушение их синтеза способствует хронизации инфекции.
Предполагается, что антитела к Pre-S2 также имеют значение для элиминации вируса.
Вирус гепатита В во многом уникален. Его геном представлен двуцепочечной кольцевой молекулой ДНК — наименьшей из всех ныне идентифицированных ДНК у ДНК-содержащих вирусов. ДНК ВГВ состоит приблизительно из 3200 нуклеотидов, с колебаниями от 3182 до 3221 в различных изолятах вируса.
В ДНК ВГВ идентифицированы 4 гена (S, С, Р, X). Кроме того, в геноме вируса определены регуляторные последовательности ДНК, ответственные за синтез белков и репликацию вируса. Открытые рамки считывания определенных генов частично перекрывают друг друга, что обеспечивает высокую информационную емкость генома ВГВ.
Ген Р охватывает обширную зону протяженностью приблизительно в 840—850 нуклеотидов, кодируя белок с молекулярной массой 25000, обладающий ферментативной активностью (РНК-зависимая ДНК-полимераза).
Ген S содержит информацию о главном белке оболочки вируса — HBsAg. Этому гену предшествуют две зоны: pre-Sl и рге-S2. Ген S и указанные две зоны кодируют три белка: основной белок (ген S), состоящий их 226 аминокислот, обнаруживаемый в гликозилированной (gp 27) и негликозилированной форме (р 24); средний (ген S и pie-S2), существующий в единожды и дважды гликозилированных формах (gp 33); большой (ген S, pre-S2, pre-Sl) белок, находящийся в негликозилированной (р 39) и единожды гликозилированной (gp 42) форме.
Область pre-Sl кодирует белок, прикрепляющийся к рецептору IgA на поверхности гепатоцита, тем самым способствуя проникновению вируса в клетку.
Область гена pre-S2 несет информацию об участке связывания с полимеризованным альбуминовым рецептором, локализованным также на гепатоците.
Ген С, состоящий из 183-185 аминокислот, кодирует белок нуклеокапсида - HBcAg. Перед геном С расположена зона рге-Соге; синтезированный на ее основе белок является регуляторным или сигнальным в синтезе ядерного антигена.
Ген Х кодирует белок, состоящий из 154 аминокислот с молекулярной массой около 16000, который активирует экспрессию всех генов вируса гепатита В.
Репликация генома вируса гепатита В во многом отлична от таковой у других ДНК-содержащих вирусов. Она начинается с проникновения вириона в гепатоцит с разрушением внешней оболочки частицы Дейна.
При помощи ДНК-полимеразы происходит достройка одноцепочечных участков короткой цепи ДНК ВГВ с образованием РНК-репликативного посредника (прегенома) с одновременной транскрипцией и трансляцией, т. е. с синтезом вирусспецифических белков. Образовавшийся пренуклеоид включает в себя прегеномную РНК- и ДНК-полимеразу.
Следующим этапом репликации является обратная транскрипция, т. е. синтез полной цепи ДНК на РНК матрице при помощи вирусспецифической ДНК-полимеразы, обладающей свойствами обратной транскриптазы (ревертазы) с последующим разрушением прегеномной РНК.
Затем на минус цепи ДНК ВГВ происходит синтез неполной цепи ДНК ВГВ.
Образовавшаяся кольцевая структура ДНК ВГВ вместе с ДНК-полимеразой включается в нуклеокапсид вируса и мигрирует в цитоплазму гепатоцита, где формируется наружная оболочка вируса, состоящая из HBsAg и липидов клетки.
Как только новая вирусная частица выходит из гепатоцита, синтез плюс цепи ДНК ВГВ прекращается.
Различия во времени выхода из гепатоцита вирусных частиц определяют вариабельность длины плюс цепи ДНК ВГВ.
Кроме включения ДНК ВГВ в состав потомства вирусных частиц, она может интегрироваться в геном гепатоцита.
Синтез белков вируса гепатита В регулируется на уровне транскрипции и трансляции. Усилители транскрипции активируют экспрессию генов вируса, действуя преимущественно в клетках печени.
На протяжении длительного времени считалось, что гепатоциты являются единственными клетками организма, где может происходить синтез вируса гепатита В. Идентификация последовательностей ДНК и белков вируса в клетках почек, селезенки, поджелудочной железы, кожи, костного мозга и клетках крови опровергло это положение.
Вместе с тем доказано, что максимальная экспрессия генов вируса гепатита В, и прежде всего S-гена, происходит только в печени, возможно, под влиянием стероидных гормонов.
Одним из уникальных свойств вируса гепатита В является его взаимосвязь с развитием первичного рака печени. В настоящее время можно считать доказанной роль этого вируса в развитии опухоли.
ВГВ может быть обнаружен в сыворотках крови и цитоплазме гепатоцитов больных острым и хроническим гепатитом, а также у носителей вируса
При электронной микроскопии определяются две морфологические формы: частицы, имеющие оптически плотное ядро, содержащие ДНК ВГВ, и неполные частицы - без ДНК. Концентрация вирусных частиц в сыворотках крови с наличием HBsAg колеблется от 10 частиц в 1 мл до количеств, недоступных выявлению с помощью электронной микроскопии.
Некоторые сыворотки крови с наличием ВГВ инфекционны даже в разведениях 10 -7 — 10 -8 .
Инфекционность ВГВ в сыворотке крови сохраняется
- при 30-32° С в течение б месяцев;
- при -20°С - 15 лет;
- после прогревания до +60°С — 4 часа;
- при 98°С — в течение 1 минуты сохраняется частично, а через 20 мин исчезает полностью;
- при обработке сухим жаром (-Н60°С) разрушается в течение 1 часа;
- обработка бета-пропиолактоном в сочетании с ультрафиолетовым облучением снижает инфекционность ВГВ-содержащей плазмы примерно в 10 миллионов раз.
Частицы ВГВ чувствительны к эфиру и неионным детергентам, которые разрушают внешнюю оболочку вириона, освобождая при этом нуклеокапсид.
Многочисленные попытки культивирования ВГВ в различных клеточных культурах были неудачны.
Для обнаружения и количественного определения ВГВ применяют иммуноэлектронную микроскопию и определение ДНК-полимеразной активности. Косвенным доказательством наличия ВГВ в исследуемом материале может быть выявление ДНК ВГВ в тесте гибридизации и амплификации , а также в иммуноферментном или радиоиммунном анализе по наличию HBcAg, выделенного из состава частицы Дейна после обработки детергентами.
В экспериментальных условиях ВГВ способен размножаться в организме человекообразных обезьян, полностью воспроизводя клинико-морфологические проявления, характерные для гепатита В, кроме желтухи.
Читайте также:
