Применение набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства

Сухарьков А.Ю, Назаров Н.А., Метлин А.Е. ФГБУ ВНИИЗЖ

Бешенство - острая инфекционная болезнь животных и человека, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Бешенство регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России.

Диагностика бешенства играет важную роль для оказания своевременной постэкспозиционной лечебной помощи людям и борьбы с бешенством среди животных [7]. Она должна быть быстрой и достоверной, так как это необходимо для оценки риска, который угрожает людям.

В настоящее время базовыми методами диагностики бешенства являются реакция иммунофлуоресценции (РИФ) и биологическая проба на мышах, а также выделение вируса на культуре клеток, постепенно заменяющее биологическую пробу на мышах [6]. Несмотря на высокую надежность и чувствительность этих методов, они имеют ряд недостатков. Основным недостатком биологической пробы на мышах и выделения вируса в культуре клеток является то, что для получения результатов исследования может потребоваться длительное время [11]. Точность постановки диагноза методом РИФ во многом зависит от наличия у персонала диагностических лабораторий необходимой квалификации. Кроме этого, для проведения диагностики с использованием этих методов, как правило, не годятся пробы с признаками частичного разложения мозговой ткани, в силу возможного получения лож-ноотрицательных результатов. Эти диагностические системы также малопригодны для широкомасштабного мониторинга бешенства. Перечисленных выше недостатков метод имму-ноферментного анализа (ИФА) не имеет. Этот метод в числе других рекомендован для диагностики бешенства Всемирной Организацией Здравоохранения (В0З) и Всемирной Организацией Охраны Здоровья Животных (OIE) [5]. Иммуноферментный анализ отличается простотой и быстротой выполнения, может обходиться без применения дорогостоящего оборудования в случае визуальной оценки результатов исследований. Он отлично подходит для проведения мониторинга бешенства, при этом позволяя интерпретировать полученные результаты с высокой степенью достоверности.

Ранее нами был разработан твердофазный непрямой сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для диагностики бешенства животных, с использованием поликлональных антител, полученных на рибонуклеопротеин вируса бешенства [2]. Прямой сэндвич-вариант ИФА более быстрый по времени и менее затратный, чем непрямой.

Целью данной работы являлась разработка прямого сэндвич-варианта ИФА для диагностики бешенства и проведение сравнительных испытаний прямого и непрямого сэндвич-варианта ИФА.

Материалы и методы. Рибонуклеопротеин вируса бешенства (далее, РНП ВБ) выделяли из клеток ВНК-21, инфицированных вирусом бешенства (далее, ВБ), штамм ВНИИЗЖ, по методике, рекомендованной ВОЗ в руководстве "Лабораторная диагностика бешенства" [8]. Вирус бешенства, штамм ВНИИЗЖ, очищали и концентрировали из культурального вирусного сырья, инактивированного димером этиленимина [3]. Концентрацию белка в очищенных препаратах вируса и РНП вируса определяли по методу Лоури [9]. Степень чистоты полученных антигенов контролировали методом вертикального электрофореза в агарозном геле с додецилсульфатом натрия в денатурирующих условиях.

В качестве улавливающих использовали поликлональ-ные антитела к РНП ВБ, которые получали иммунизацией кроликов соответствующим антигеном. Очищенный РНП ВБ вводили животным внутримышечно три раза (0, 40, 54 дни) в дозе 400 мкг на голову.

В качестве детекторных использовали антирабические антитела морской свинки, которые получали иммунизацией животных очищенным ВБ. Антиген вводили животным внутримышечно четырехкратно в дозе 200 мкг на голову с интервалами в 1 неделю, 5 и 2 недели. При иммунизации морских свинок и кроликов первую инъекцию проводили с полным, а последующие - с неполным адъювантом Фрейнда "Sigma".

Через две недели после последней инъекции в сыворотках крови иммунизированных животных определяли титры специфических антител методом твердофазного непрямого варианта иммуноферментного анализа. Титровали с шагом три, начиная с разведения 1:1000. В дальнейшей работе использовали сыворотки крови с титрами антител к ВБ и РНП ВБ не ниже 1:243000. Из отобранных сывороток выделяли фракцию IgG методом трехкратного высаливания сульфатом аммония. Концентрацию белка в конечных препаратах определяли методом спектрофотомерии при длине волны 280 нм.

Поликлональные антирабические антитела морских свинок использовали для получения антирабического перокси-дазного коньюгата по методу Накане [4].

Для отмывки лунок планшетов от компонентов реакции использовали Трис-HCl буферный раствор с добавлением Tween-20 (ТБСТ).

В качестве субстрата для пероксидазы использовали ор-тофенилендиамин.

Для учета результатов непрямого сэндвич-варианта ИФА использовали антивидовой пероксидазный конъюгат к антителам морской свинки производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (г. Москва) в разведении 1:1000.

Положительным контролем в ИФА служила инактивиро-ванная р-пропиолактоном [10] лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани кролика, инфицированного ВБ штамма CVS. В качестве отрицательного контроля использовалась лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани неинфицированного кролика.

Исследуемые образцы (пробы ткани головного мозга животных) поступали в ФГБУ "ВНИИЗЖ" из разных региональных ветеринарных лабораторий. Поступивший биоматериал до использования хранили при минус 20°С. Образцы мозговой ткани для исследования готовили следующим образом. В пенициллиновый флакон с Трис - НС1 буферным раствором помещали кусочки ткани головного мозга из разных отделов (продолговатый мозг, мозжечок, аммоновы рога, кора больших полушарий) в количестве, необходимом для приготовления 30%-ной суспензии. Содержимое флакона тщательно гомогенизировали путем интенсивного встряхивания и подвергали однократному замораживанию. Далее пробу подвергали частичному размораживанию при комнатной температуре, и интенсивно встряхивали для более полной гомогенизации. Затем содержимое флакона переносили в пластиковую центрифужную пробирку с крышкой в объеме 1,5 мл и центрифугировали в течение 20 минут при 1000g. Для исследования использовали супернатант в цельном виде. Оставшийся в пенициллиновом флаконе материал хранили при минус 200С.

Кроме прямого сэндвич-варианта ИФА пробы исследовали методами РИФ [1] и непрямым сэндвич-вариантом ИФА [2]. При исследовании проб головного мозга в РИФ использовали ФИТЦ-иммуноглобулин производства ФГБУ "ВНИИЗЖ".

Результаты и обсуждение. Исследования проб в прямом сэндвич-варианте ИФА выполняли по следующей схеме.

Сенсибилизация планшетов. Для сенсибилизации планшетов в лунки вносили поликлональные кроличьи антитела к РНП ВБ по 100 мкл в лунку, разведенные в карбонатно-би-карбонатном буферном растворе (рН 9,5) до концентрации 5 мкг/мл, и инкубировали в течение 18-20 ч при 4°С. Сенсибилизированный планшет 3 раза отмывали ТБСТ.

Внесение исследуемых проб и контрольных препаратов. В лунки вертикального ряда по очереди в трех повторностях вносили положительный, отрицательный, безантигенный (промывочный буферный раствор) контроли и исследуемые пробы по 100 мкл в лунку. Планшет инкубировали 1 ч при 37°С и затем трижды отмывали промывочным буферным раствором.

Внесение пероксидазного антирабического конъюгата. Рабочее разведение антирабического конъюгата с перокси-дазой хрена готовили на ТБСТ с добавлением 5%-ной нормальной сыворотки лошади. В лунки планшета вносили по 100 мкл приготовленного коньюгата, инкубировали 1 ч при 37°С и отмывали 5 раз промывочным буферным раствором. Рабочее разведение антирабического пероксидазного конъюгата предварительно определяли в прямом сэндвич-варианте ИФА методом последовательных разведений, с использованием положительного и отрицательного контрольных препаратов, которое составило 1:1500.

Внесение субстрат-хроматогенной смеси. Раствор субстрат-хроматогена вносили по 100 мкл на лунку. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 3н H2SO4.

Учет результатов . Результаты реакции учитывали с помощью сканирующего спектрофотометра "BioRad PR 2100" при длине волны 490 нм. Определяли среднюю оптическую плотность (ОП) безантигенного, положительного и отрицательного контролей, а также среднюю ОП тестируемых образцов. После этого рассчитывали ОП тестируемых образцов, положительного и отрицательного контролей, вычитая среднюю ОП безантигенного ряда. Согласно рекомендациям ВОЗ, расчетная ОП (ОПр) отрицательного и положительного контролей должна быть не выше 0,1 и не ниже 1,5 единиц, соответственно. Исследуемые образцы считали положительными, если их ОПр превышала ОПр отрицательного контроля на 0,1 единицы [5].

Для оценки диагностической специфичности разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА исследовали 30 проб головного мозга от разных животных, отрицательных по бешенству в РИФ. Расчетная оптическая плотность отрицательных проб составила 0,013±0,0004, что свидетельствует о высокой специфичности разработанного ИФА, которая в данном исследовании составила 100%.

С целью измерения предела чувствительности разработанного метода провели анализ с использованием РНП ВБ известной концентрации. Проведенные исследования показали, что предел чувствительности метода находится в диапазоне 15-30 нг/мл. При этом предел чувствительности непрямого сэндвич-варианта ИФА, разработанного нами ранее [2], составил такую же величину.

Для изучения эффективности диагностики бешенства разработанным прямым сэндвич-вариантом ИФА в сравнении с другими методами, в том числе и непрямым сэндвич-вариантом ИФА, было исследовано 100 проб головного мозга животных, направленных в ФГБУ "ВНИИЗЖ" для исследования на бешенство. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследований мозговой ткани животных, подозреваемых в заболевании бешенством, в прямом сэндвич-варианте ИФА, в сравнении с другими методами диагностики бешенства

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Миронов Александр Николаевич. Усовершенствование средств диагностики бешенства и сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов в эксперименте : диссертация . кандидата биологических наук : 16.00.03 / Миронов Александр Николаевич; [Место защиты: Федер. центр токсик. и радиац. безопасности животных].- Казань, 2009.- 148 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/666

Содержание к диссертации

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Биологические свойства возбудителя бешенства 10

1.2. Методы лабораторной диагностики бешенства 12

1.3. Иммунитет при бешенстве и методы его оценки 21

1.4. Лечебно-профилактические средства от бешенства 25

1.5.Интерферон, индукторы интерферона и другие противовирусные препараты 32

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 39

2.1. Материалы и методы исследований 39

2.1.1. Материалы исследований 39

2.1.2. Методы исследований г 41

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 46

3.1. Усовершенствование способа получения антирабической сыворотки крови овец и анализ её диагностической ценности при изготовлении иммунохимических препаратов 46

3.2. Изучение патогенных свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства 54

3.3. Изучение эффективности антирабического глобулина из сыворотки крови овец производства при экспериментальном бешенстве 59

3.4. Получение препарата эндонуклеазы и определение его антирабического эффекта 64

3.5. Изучение антирабической активности циклоферона 74

3.6. Сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов при экспериментальном бешенстве. 77

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 84

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 102

Список ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 103

Введение к работе

Актуальность проблемы. Бешенство — зооноз, поражающий центральную нервную систему, приводящий к летальному исходу. Учитывая широкое распространение бешенства и экономический ущерб, наносимый данным заболеванием, разработка и усовершенствование антирабических препаратов остаётся актуальной проблемой.

В то же время в центре внимания медицинской и ветеринарной службы России остаются вопросы постэкспозиционной антирабической лечебнопрофилактической вакцинации людей, основанной на комбинированном применении антирабического иммуноглобулина (АИГ) и антирабической вакцины.

Как известно, основная функция АИГ, гомологичного или гетерологичного, состоит в создании пассивного иммунитета с целью предупреждения развития болезни с коротким инкубационным периодом (Селимов М.А., 1978, 1987, 1998). Однако гетерологичный АИГ может вызывать аллергические реакции, а гомологичный - является дорогостоящим. В этой связи, необходим поиск альтернативных специфических и неспецифических препаратов для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства до развития клинических признаков.

Научно-практический интерес представляют работы С В . Грибенча и соавт. (1993, 2006), в которых показана эффективность РНКазы Bacillus intermedius в качестве антирабического препарата при экспериментальном заражении бешенством. В этом отношении определенную ценность представляет также изучение эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens, ингибирующей размножение ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов и применяемой на практике для лечения и профилактики вирусного паралича пчел (Панфилова З.И., Салганик Р.И., 1983; Аликин Ю.С. и др., 1998).

Большой интерес в качестве фактора противовирусного иммунитета представляет интерферон, ингибирующий транскрипцию вирусного генома и трансляцию вирусной мРНК, что препятствует накоплению вируса в клеткемишени. В связи с этим практический интерес представляет индуктор интерферона - циклоферон, эффективность которого установлена в отношении хламидиоза и ряда вирусных инфекций (Ершов Ф.И. и др., 1998).

В связи с вышеизложенным, перспективным направлением исследований является усовершенствование средств лабораторной диагностики бешенства, анализ антирабической активности существующих и разработка новых противовирусных препаратов различной природы для экстренной постэкспозиционной защиты от возможного развития рабической инфекции.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование средств диагностики бешенства и сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов в эксперименте.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
1. Усовершенствовать способ получения антирабической сыворотки крови при иммунизации овец.

2. Изучить эффективность иммуноферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов, изготовленных на основе усовершенствованного антирабического глобулина сыворотки крови овец.

3. Получить препарат эндонуклеазы Serratia marcescens.

Практическая ценность. Антирабическая сыворотка крови овец, полученная по усовершенствованному способу иммунизации, повышает эффективность диагностических исследований.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативные документы: Инструкцию по применению флуоресцирующего антирабического глобулина, утверждённую Россельхознадзором 03.03.2008 г.; Инструкцию по применению набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом имму но ферментного анализа (ИФА), утверждённую Россельхознадзором
03.03.2008 г. Указанные диагностические препараты зарегистрированы в РФ за № ПВР-1-4.9/00196 и № ПВР-1-1.9/00261 от 3 марта 2008 г., соответственно, а также сертифицированы ВГНКИ № РОСС БШ.ФВ01.В18715 и РОСС Рчи.ФВ01.В18714, соответственно.

Использование диагностикумов позволяет осуществлять точную и своевременную постановку диагноза и выдачу практических рекомендаций по эффективной ликвидации бешенства.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 147 страницах и включает: общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 297 источников, в том числе 109 иностранных и 1 ссылка на сайт internet) и приложение. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 13 рисунками.

Биологические свойства возбудителя бешенства

Возбудитель болезни - РНК-содержащий вирус, относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Семейство Rhabdoviridae включает вирусы, выделенные от позвоночных и беспозвоночных животных, а также растений (FranckiR.LB.etal., 1991).

Среди рабдовирусов позвоночных выделено 2 рода - Lyssavirus и Vesiculovirus. Род Lyssavirus включает вирус бешенства и подобные вирусу бешенства (лиссаподобные) вирусы, которые характеризуются как общностью основных свойств генома вириона, так и общей способностью вызывать энцефалит у позвоночных животных. Кроме того, у всех видов рода Lissavirus обнаружен общий групповой нуклеокапсидный антиген, который ответственен за продуцирование комплементсвязывающих, преципитирующих антител (Вагабов A.M., 1979; Павловский В.В., 1975; Черкасский Б.Л., 1985; Шубладзе А.К. и соавт., 1974; 1975). Установлен генетический полиморфизм гена нуклеопротеина вируса бешенства (Kissi В., 1995).

Вирионы рабдовирусов имеют пуле- или бацилловидную форму, спиральный нуклеокапсид, окруженный белково-липидной оболочкой, с поверхностными выступами. Внутренние спирали имеют от 30 до 35 витков в форме цилиндров - 50 нм в диаметре и 150 нм в длину. Геномом является одноцепоченая РБК с молекулярной массой 3,5-4,6x106 дальтон.

Вирионы содержат также РНК-зависимую РНК-полимеразу. Вирус имеет плавучую плотность в CsCl-1,32 г/см . Очищенные рабические вирионы содержат 2-3% РНК, 3% углеводов, 23% липидов и более 70% белка. В составе вириона выявлены 4 мажорных и 1 минорный белковый компонент. Полипептид с самой высокой относительной молекулярной массой (отн. мол. масса 80000, 1783 молекул на вирион) оказался гликопротеином (G), образующим шипы внешней оболочки. Он ответственен за продукцию вируснейтрализующих антител, антигемагглютининов и за формирование иммунитета к заражению вирусом бешенства.

На основе различий гликопротеидного компонента, выявляемый в реакции нейтрализации, в группе вируса бешенства выделяют 7 генотипов. К 1-ому генотипу относят абсолютное большинство уличных и фиксированных штаммов из различных частей света, в том числе и классический стандартный -С VS. Лиссаподобные вирусы остальных генотипов выделены первоначально на Африканском континенте от летучих мышей - Lagos bat вирус (2-й генотип), от землеройки и человека — Mokola вирус (3-й генотип), также человека и летучей мыши Duvenhage (4-й генотип). Позднее вирус Duvenhage был выделен на территории ФРГ и России (Селимов М.А., 1987). К 5 и 6 генотипам относят вирусы европейских летучих мышей (EBL 1, EBL 2) (Пилле Э.Р., 1996). К 7 генотипу относят вирус австралийских летучих мышей (ABLV) (www.who. rabies - bulletin.org.).

Антигенные различия между штаммами вируса бешенства и родственными вирусами изучают с помощью полной и сокращенной панели антинуклеокапсидных (анти-НК) и антигликопротеиновых (анти-ГП) МКА (Селимов М.А. и соавт, 1982, 1983; Хисматуллина Н.А., 1989; Ботвинкин А.Д. и соавт., 1990, 1998; Wiktor T.J. et al., 1980). М.А. Селимовым и соавт. (1987, 1990) изучена антигенная характеристика полевых штаммов вируса бешенства, выделенных от животных и людей из различных районов бывшего СССР с помощью набора из 36 антинуклеокапсидных моноклональных антител. На основании анализа результатов исследований авторы делают заключение, что циркулирующие на территории нашей страны штаммы вируса бешенства по нуклеокапсидной структуре неоднородны и принадлежат штамму классического вируса, серотип 1. Вирус Юли, выделенный от человека, покусанного летучей мышью, идентифицирован как лиссаподобный вирус типа Duvenhage, серотип 4. Это первое обнаружение лиссаподобного вируса на территории России (Ботвинкин А.Д., 1990; Selimov М., 1987).

В последующем было обнаружено еще два, выделенные на территории Западной Украины (Selimov М.А., 1991). Другой штамм Араван, выделеннный от летучей мыши в Кыргызстане, оказался лиссавирусом с оригинальным антигенным профилем, не имеющим аналогов среди известных серотипов (Ботвинкин А.Д., 1992; Кузьмин И.В. и соавт., 1992).

Материалы и методы исследований

2. В работе использовали животных: овец, живой массой 40-50 кг, 5 гол.; морских свинок 0,3-0,35 кг, 100 гол.; белых крыс 0,3 кг, 50 гол.; белых мышей -беспородных, живой массой 6-7 г, 1000 гол.; живой массой 10 г, 200 гол; линии BALB/c 14-16 г, 2000 гол, а также перевиваемую культуру клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1).

Образцы готовили в виде 10%-ной суспензии мозга на 0,85%-ном растворе NaCl с добавлением пенициллина и стрептомицина. Антигены предварительно осветляли центрифугированием при 800 g в течение 15 мин, инактивировали при 56 С в течение 30 минут.

Усовершенствование способа получения антирабической сыворотки крови овец и анализ её диагностической ценности при изготовлении иммунохимических препаратов

Целью исследований явилось усовершенствование способа получения антирабической сыворотки крови овец, обладающей высокой серологической и вируснейтрализующей активностью.

Определение инфекционного титра вируссодержащей взвеси до и после УЦФ на белых мышах показало, что до УЦФ титр вируса был равен 103 84 LD50 /мл, а после УЦФ - 105 51-1)5о/мл. При этом содержание белка в вируссодержащей взвеси составило 6 мг/мл, а после УЦФ - 2,7 мг/мл, то есть произошла частичная очистка вируссодержащей взвеси от белка при одновременном повышении инфекционного титра вируса.

Иммунизирующий антиген вируса бешенства соединяли с масляным адъювантом, в состав которого входила кремнеорганическая жидкость -полиэтилсилоксан (ПЭС-3). Прототипом ПЭС-3 служил неполный адъювант Фрейнда (НАФ), используемый в настоящее время для получения антирабической сыворотки, аналогом - декстран-сульфат (м.м.500000 у.е.) в концентрации - 2%.

Сформировали три группы овец, по 3 головы в каждой. Животных иммунизировали внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра обеих конечностей. Животным первой группы вводили смесь иммунизирующего антигена вируса бешенства с масляным адъювантом, в состав которого входил ПЭС-3. Овцам второй группы вводили смесь иммунизирующего антигена вируса бешенства с НАФ. Животным третьей группы вводили подкожно смесь иммунизирующего антигена вируса бешенства с декстран-сульфатом (м.м.500000 у.е.) в концентрации - 2%. Уровень специфических антител определяли в РН, ИФА и РДСК. В результате исследований установлено максимальное накопление специфических антител через месяц после иммунизации, активность которых составила в РДСК 1:160-1:640, в непрямом ИФА - 1:3200-1:12800 и РН - 1:200-1:800. Титры антител сохранялись в течение 5-10 месяцев (срок наблюдения). Результаты исследований представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что более выраженная стимуляция антителогенеза происходит при иммунизации овец вирусом бешенства в сочетании с масляным и ПЭС-3. Уровень специфических антител в 4 раза превосходит таковой при иммунизации овец вирусом бешенства в сочетании с НАФ и в 2 раза - по сравнению с декстран-сульфатом.

Таким образом, усовершенствован способ получения антирабической сыворотки крови овец, заключающийся в применении в составе масляного адьюванта кремнеорганической жидкости - ПЭС-3 при иммунизации овец вирусом бешенства, позволяющий повысить ее вируснейтрализующую активность в 4 раза по сравнению с прототипом (НАФ) и в 2 раза по сравнению с аналогом (декстран-сульфат).

Для нейтрализации антирабического глобулина использовали стандартный вирус бешенства CVS в дозе 300 LDso- Результаты исследований представлены в таблице 2.

Участники и результаты

Организация, размещающая заказ

Государственный Комитет по Регулированию Контрактной Системы в Сфере Закупок Республики Хакасия

44-ФЗ, Электронный аукцион

ИНН 1901046066 КПП 190101001

Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении

ОКПД2 21.10.60.196 Препараты диагностические (реагенты) микробного и вирусного происхождения; наборы диагностические

Тест-система для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени

Набор для диагностики синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) в реакции торможения гемагглютинации

Набор компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации (РДП)

Набор для иммуноферментной диагностики ринопневмонии (РПЛ) лошадей в ИФА

Тест-система для обнаружения вируса парагриппа-3 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Набор диагностикумов парагриппа-3 крупного рогатого скота

Набор для выявления антигена вируса чумы плотоядных иммуноферментным анализом (ИФА)

Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)

Набор для выявления антигенов парвовируса собак, вирусов энтерита норок и панлейкопении кошек иммуноферментным анализом

Набор для выявления антигенов аденовирусов плотоядных иммуноферментным анализом

Участникам, заявки или окончательные предложения которых содержат предложения о поставке товаров в соответствии с приказом Минэкономразвития России № 155 от 25.03.2014

Требование об отсутствии в предусмотренном Федеральным законом № 44-ФЗ реестре недобросовестных поставщиков (подрядчиков, исполнителей) информации об участнике закупки, в том числе информации об учредителях, о членах коллегиального исполнительного органа, лице, исполняющем функции единоличного исполнительного органа участника закупки - юридического лица (в соответствии с частью 1.1 Статьи 31 Федерального закона № 44-ФЗ)
Единые требования к участникам (в соответствии с пунктом 1 части 1 Статьи 31 Федерального закона № 44-ФЗ)

Электронный аукцион признан несостоявшимся:

По результатам рассмотрения вторых частей заявок принято решение о несоответствии требованиям, установленным документацией об электронном аукционе, всех вторых частей заявок на участие в нем или о соответствии указанным требованиям только одной второй части заявки на участие в нем (ч.13 ст.69 44-ФЗ)

В.Х. ФАЗЫЛОВ¹, Г.Х. МУРТАЗИНА¹, Ю.Р. УРМАНЧЕЕВА², Р.И. МИНГАЖЕВА²

¹Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49

²Республиканская клиническая инфекционная больница им. профессора А.Ф. Агафонова, 420140, г. Казань, пр. Победы, д. 83

Фазылов Вильдан Хайруллаевич — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней, тел. +7-917-254-89-97, e-mail: [email protected] 1

Муртазина Гульнара Харисовна — кандидат медицинских наук, ассистент кафедры инфекционных болезней, тел. (843) 267-80-99, e-mail: [email protected] 1

Урманчеева Юлия Рустемовна — заместитель главного врача, тел. (843) 267-80-00 2

Мингажева Рианна Ильдаровна — заведующая отделением реанимации и анестезиологии № 1, тел. (843) 267-80-02 2

На современном этапе происходит глобальный рост заболеваемости бешенством не только во всем мире, но и в России. В статье представлена клинико-эпидемиологическая характеристика случая бешенства у больного, укушенного бродячей собакой. Рассматриваются современные подходы к прижизненной диагностике бешенства.

Ключевые слова: бешенство, клинический случай, диагностика.

V.Kh. FAZYLOV¹, G.Kh. MURTAZINA¹, Yu.R. URMANCHEYEVA², R.I. MINGAZHEVA²

¹Kazan State Medical University, 49 Butlerov St., Kazan, Russian Federation, 420012

2 Republican Clinical Hospital of Infectious Diseases, 83 Prospekt Pobedy, Kazan, Russian Federation, 420140

Fazylov V.Kh. — D. Med. Sc., Professor, Head of the Department of Infectious Diseases, tel.: +7-917-254-89-97, e-mail: [email protected]

Murtazina G.Kh. — Cand. Med. Sc., Assistant Lecturer of the Department of Infectious Diseases, tel. (843) 267-80-99, e-mail: [email protected]

Urmancheyeva Yu.R. — Deputy Chief Doctor, tel. (843) 267-80-00

Mingazheva R.I. — Head of Resuscitation Department, tel. (843) 267-80-02, +7-917-231-56-32

At present rabies morbidity increases not only worldwide, but in Russia as well. The article shows the clinical epidemiological characteristic of a rabies case in patient bitten by a stray dog is. The modern approaches to the life-time diagnosis of rabies are overviewed.

Key words: rabies, clinical case, diagnosis.

Бешенство, или гидрофобия (Rabies, лат.; Lissa, греч.; Tollwut, нем.; La rage, франц.; Rabies, англ.; La rabbia, итал.), — острое инфекционное природно-антропургическое зоонозное заболевание вирусной этиологии с раневым механизмом передачи инфекции, характеризующееся поражением центральной нервной системой и абсолютной летальностью.

Бешенство встречается на всех континентах, кроме Австралии, Океании и Антарктиды. На современном этапе происходит глобальный рост рабической инфекции. Заболеваемость бешенством регистрируется на территории большинства стран мира. По оценке ВОЗ, бешенство входит в пятерку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший экономический ущерб (покупка и производство антирабических препаратов, проведение противоэпизоотических мероприятий, гибель сельскохозяйственных животных). Ежегодно в мире до 10 млн человек получают специфическую антирабическую помощь [1, 2].

Бешенство характеризуется абсолютной летальностью. В мире ежегодно погибает после укусов бешеных животных около 50 тыс. (от 40 до 70 тыс.) человек (из этого числа около 90% приходится на Азиатский континент, в основном Индию).

В Российской Федерации до 80-х годов ежегодно обращались за антирабической помощью не более 200 тыс. человек, а в последние годы — стабильно более 400 тыс. человек, т.е. прослеживается четкая тенденция к росту этого показателя [3].

Заболеваемость бешенством животных приурочена к природным очагам, расположенным по всей территории России. В среднем в год на 1000 случаев заболевания животных приходится 27,7 случаев бешенства у людей. За период 2007-2012 гг. в Республике Татарстан (РТ) зарегистрировано 1462 случая лабораторно подтвержденного бешенства среди животных в 44 административных районах и двух городах (Казани и Нижнекамске). Показатель случаев бешенства среди животных по РТ имеет неуклонную тенденцию к росту (рис. 1).

Наибольший рост числа случаев бешенства отмечается в дикой фауне, в основном за счет лисиц. На втором месте находятся сельскохозяйственные животные, заражение которых происходит вследствие проникновения лисиц на фермы и пастбища.

Рисунок 1.

Динамика случаев бешенства среди животных по РТ за период с 1984 по 2012 год

Причины эпизоотического неблагополучия по заболеваемости бешенством в РТ [4]:

— широкое распространение природного бешенства;

— неудовлетворительная работа по регулированию численности диких животных;

— недостаточный объем вакцинации домашних животных;

— грубые нарушения правил содержания домашних животных;

— резкое увеличение количества безнадзорных животных;

— низкий объем работ по организации карантинирования подозрительных на бешенство животных;

— неудовлетворительное проведение мероприятий по отлову и уничтожению безнадзорных животных и организации мест их содержания.

За период с 1970 по 2005 г. установлено 5 случаев бешенства у людей, из них в двух случаях источником возбудителя инфекции были лисицы, в остальных — волк, собака и кошка. В 2013 г. вновь зарегистрирован случай бешенства у человека в Казани, который мы представляем в рамках клинико-эпидемиологической и специфической диагностики.

Больной Г., 54 года, поступил в Республиканскую клиническую инфекционную больницу (РКИБ) 26.12.13 г. на 10-й день болезни (д.б.) с предположительным диагнозом: Бешенство?

Из эпиданамнеза: отдыхал в отпуске на Гоа (Индия), 25.10.13 был укушен бродячей собакой за правую голень, за медпомощью не обращался, рану самостоятельно обработал водкой. Экстренной профилактики бешенства и столбняка не проводилось, прививочного сертификата не имеет. Данных о состоянии животного, подозрительного на бешенство, нет.

Жалобы при поступлении на общее недомогание, тревожность, водобоязнь, не пил жидкость в течение 3 дней, нехватку воздуха и затруднение дыхание, гиперсаливацию, выраженные боли тянущего и распирающего характера в области укуса собаки.

Объективный статус на 26.12.13. (10 д.б.): t= 36,8ºС, ЧСС=122 уд. в 1 мин, АД=115/90 мм.рт.ст. ЧДД=20 в 1 мин, больной возбужден, речь скандированная, но сознание ясное, во времени и пространстве ориентирован. Очаговой неврологической симптоматики нет. Костно-мышечная система без патологии. На коже задней поверхности нижней третей правой голени на неизмененном фоне 2 линейных рубца длинной до 1см с синюшным оттенком, отека и гиперемии вокруг нет, пальпация безболезненна.

Тоны сердца приглушены, ритмичные. В легких дыхание жесткое, проводится по всем полям, хрипов нет. Живот мягкий, безболезненный. Печень, селезенка не увеличены. Диурез снижен, стула нет 4 дня.

На фоне интенсивной терапии начато введение антирабического иммуноглобулина (АИГ). Вечером 26.12.13. в связи с нарастанием беспокойства больной получил тиопентал натрия. В 23.50 состояние ухудшается, усиливаются психомоторное возбуждение, дыхательная недостаточность, в связи, с чем пациент переведен на ИВЛ и введен в медикаментозный сон.

В последующие дни состояние больного сохраняется тяжелым, находится в медикаментозном сне. 30.12.13. (14д.б., 5день госп.) состояние с ухудшением, лихорадка 38,8-39С, тахикардия (ЧСС=120 в 1 мин), АД=140/80мм рт ст , сатурация=90%. 31.12.13. Состояние крайне тяжелое. Кома II. Гемодинамика нестабильная, поддерживается вазопрессорами. Лихорадка до фебрильных цифр. Гиперсаливация. 3.01.14. (18 д.б., 9 д.г.) нарастают бронхоспазм, дыхательная недостаточность, гемодинамические нарушения (гипотония, тахикардия). 4.01.14 (19д.б., 10д.г.) в 06.00. внезапная остановка сердечной деятельности, реанимационные мероприятия безуспешны, констатирована биологическая смерть.

Клиническая картина у данного больного развивалась остро с основных симптомов бешенства (гидро-, аэро-, фотофобии, бронхоспазм, гиперсаливация, психомоторное возбуждение) после 52 дней инкубации.

Клинико-эпидемиологический диагноз бешенства был подтвержден результатами специфических методов лабораторного исследования, которые основаны на:

— обнаружении цитоплазматических включений или специфического антигена (световая микроскопия, люминесцентная микроскопия, реакция преципитации, иммуноферментный анализ и др.);

— выделении рабического вируса (биопроба на лабораторных животных или в культуре клеток);

— обнаружении генома вируса бешенства.

Материалы для лабораторных исследований (отпечатки с роговицы, пробы слюны и слезы) были взяты 27.12.2013г., т.е. при жизни пациента.

В результате проведенных специальных методов лабораторной диагностики в данном случае было установлено:

— в отпечатках с роговицы и пробы слюны МИФ обнаружен специфический антиген вируса бешенства в виде типичных отчетливо выраженных ярких желто-зеленых гранул;

-исследование пробы слюны на обнаружение антигена вируса бешенства в ИФА также показало положительный результат с титром рабического антигена 1:16, Kcn=2,2;

— методом гнездовой ОТ-ПЦР в пробах слюны и слезы выявлен геном вируса бешенства.

Таким образом, клиническая картина бешенства в представленном случае протекала по классическому варианту с наличием синдрома интоксикации, периода предвестников с повышением рефлекторной возбудимости и нарушением психики, которые могут быть объединены в так называемый симптомокомплекс тревоги и периода разгара болезни (стадия гидрофобии или возбуждения) [5]. Клинико-эпидемиологический диагноз бешенства подтвержден результатами специфических исследований: МИФ и ИФА с обнаружением специфического антигена вируса в отпечатках с роговицы, слюне, а также выявлен геном вируса в пробах слюны и в отпечатках с роговицы методом гнездовой ОТ-ПЦР.

Приведенный клинический случай указывает на необходимость непрерывного повышения уровня знаний врачей разных специальностей по профилактике и диагностике бешенства, а также проведения санитарно-просветительной работы среди населения [6].

3. Инфекционная заболеваемость в субъектах Российской Федерации за 2012-2013гг.: Информационный сборник статистических и аналитических материалов.-М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2014.-Ч.3.-100с.

4. Иванов В.А., Хисматуллина Н.А, Чернов А.Н., Гулюкин А.М. Бешенство: этиология, эпизоотология, диагностика: учебно-методическое пособие в иллюстрациях. — М.: Колос,2010. — 54с.

5. Фазылов В.Х., Хисматуллина Н.А., Муртазина Г.Х. и др. Бешенство: учебно-методическое пособие. — Казань: КГМУ, 2012. — 72с.

1. Rabies. Informacionnyj bjulleten’ VOZ, no. 99, September, 2010 (in Russ.)

3. Infekcionnaja zabolevaemost’ v subjektah Rossijskoj Federacii za 2012-2013gg.: Informacionnyj sbornik statisticheskih i analiticheskih materialov [Infectious diseases in the Russian Federation for 2012-2013 .: Information compilation of statistical and analytical materials]. Moscow: Federal’nyj centr gigieny i jepidemiologii Rospotrebnadzora, 2014. Part 3. 100 p.

4. Ivanov V.A., Hismatullina N.A, Chernov A.N., Guljukin A.M. Beshenstvo: jetiologija, jepizootologija, diagnostika: uchebno-metodicheskoe posobie v illjustracijah [Rabies: etiology, epizootiology, diagnosis: a teaching aid in graphics]. Moscow: Kolos, 2010. 54 p.

5. Fazylov V.H., Hismatullina N.A., Murtazina G.H. et al. Beshenstvo: uchebno-metodicheskoe posobie [Rabies: a teaching aid]. Kazan: KGMU, 2012. 72 p.

6. Sanitarno-jepidemiologicheskie pravila SP 3.1.7.2627 -10 “Profilaktika beshenstva sredi ljudej” [Sanitary Regulations SP 3.1.7.2627 -10 “Prevention of rabies in people”].

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.

Наименование	Кол-во	Цена за ед.	Стоимость, ₽