Перенос генов в растение при помощи вирусов

Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют "трансгенами") из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются: возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип; возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами; значительное ускорение процесса получения новых генотипов.

Наиболее широко используемый метод трансформации - агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли - корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку.

Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.

Признаки, которые возможно придать с помощью генной инженерии, весьма разнообразны и в основном ограничены только наличием соответствующих генов. Очень условно их можно разделить на три группы. К первой относятся признаки, интересные производителям: устойчивость к различным факторам окружающей среды - гербицидам, болезням, вредителям, засухе, засолению, улучшение минерального питания, повышение укореняемости. Вторая группа признаков представляет интерес непосредственно для потребителей - модификация вкуса и аромата плодов, увеличение продолжительности их хранения, изменение окраски цветков, бессемянность, улучшение питательной ценности растений. В третью группу входят растения-"биофабрики", способные синтезировать вакцины, ферменты, биополимеры и другие полезные вещества.

ДНК бактерий существуют не только в виде хромосом, но и в виде маленьких кольцевых молекул (плазмид). Бактерии Agrobacterium tumefaciens помимо прочих содержат плазмиды, вызывающие опухоли (Ti-плазмиды). На такой плазмиде среди прочих генов имеется так называемая область Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухоли на растениях и синтез опинов. Именно этот кусочек плазмиды агробактерии встраивают в ДНК растений. Выяснилось, что агробактерии в принципе способны переносить в растения любую ДНК, которая расположена в этом месте плазмиды. Поэтому в плазмидах, используемых в генно-инженерных целях, природные гены заменяют любыми другими, представляющими интерес для человека. Как правило, это два-три гена: целевой, который придает, например, устойчивость к насекомым; селективный, который придает устойчивость к определенным веществам (чаще всего - антибиотикам), что позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как нетрансформированные клетки в ней гибнут; и иногда - репортерный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например, по окрашиванию или свечению в ультрафиолетов ом свете.

В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты), из которых проще всего регенерировать целые растения (чаще всего используются листья). Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерии с помощью vir-белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в растительную ДНК.

Затем растительную ткань помещают на питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерии перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам, то есть трансформированные. Условия и состав среды подобраны таким образом, что трансформированные клетки активно размножаются, образуя неорганизованную массу делящихся клеток (калллус), из которой регенерируют трансгенные растения. Полученные растения размножают и подвергают различным анализам сначала в пробирке, а потом - на полях и в теплицах.

Создание одного нового сорта ГМР стоит от 50 до 300 млн долларов и занимает от 6 до 12 лет.

6549
5,0
0
5

Вопрос о происхождении вирусов

Существует три основные теории возникновения вирусов [1]:

Зарождение жизни. Идея последнего универсального общего предка: каким он мог бы быть и что ему предшествовало?

Рисунок 1. Схема трехдоменной классификации, предложенная Вёзе. В основании этой схемы должен находиться последний универсальный общий предок (англ. last universal common ancestor, LUCA). Рисунок из Википедии.

Самый сильный аргумент в пользу существования LUCA — сохранившаяся общая система экспрессии генов (передачи наследственной информации от гена с образованием РНК или белков), одинаковая для всех живущих организмов. Все известные клеточные формы жизни используют один и тот же генетический код из 20 универсальных аминокислот и стоп-сигналов, закодированных в 64 кодонах (единицах генетического кода). Трансляция генетической информации в процессе синтеза белков по заданной матрице выполняется рибосомами, состоящими из трех универсальных молекул РНК и примерно 50 белков, из которых 20 так же одинаковы для всех организмов.

В 2010 году американский биохимик Даглас Теобальд математически проверил вероятность существования LUCA [6]. Он выбрал 23 белка, встречающихся у организмов из всех трех доменов, но имеющих разную структуру у различных видов. И исследовал эти белки у 12 различных видов (по четыре из каждого домена), после чего использовал компьютерное моделирование различных эволюционных сценариев, чтобы понять, при каком из них наблюдаемая картина будет наиболее вероятной. Оказалось, что концепция, включающая существование универсального предка, значительно вероятнее концепций, где его нет. Еще более вероятна модель, основанная на существовании общего предка, но допускающая обмен генами между видами [7].

Предположение о том, что LUCA был прокариотической клеткой, похожей на современные, часто принимается по умолчанию. Однако мембраны архей и бактерий имеют разное строение (рис. 2). Получается, что общий предок должен был обладать комбинаторной мембраной. Новая информация о мембранах LUCA появилась в 2012 году, когда несколько групп ученых подробно проанализировали историю генов всех ферментов биосинтеза компонентов липидов у бактерий, архей и эукариот [8].

Родственными у архей и бактерий оказались ферменты для синтеза терпеновых спиртов и пришивания полярных голов к спиртам. Значит, эти реакции мог проводить и LUCA. Проще всего было предположить, что липиды LUCA состояли из одного остатка терпенового спирта, остатка фосфата и полярной группы (серина или инозитола). Подобные липиды были синтезированы искусственно. Образующиеся из них мембраны обладают высокой подвижностью по сравнению с современными мембранами, хорошо пропускают ионы металлов и малые органические молекулы. Это могло позволять древним протоклеткам поглощать готовую органику из внешней среды даже без транспортных белков.

Реконструкции LUCA методами сравнительной геномики указывают на то, что это должен быть сложный организм без обширного ДНК-генома (геном, состоящий из нескольких сотен РНК-сегментов или ДНК провирусного типа). Но даже если считать возможность существования общего предка доказанной, остается загадкой, в какой среде он мог бы появиться.

Предполагается, что идеальные условия для формирования жизни существовали вблизи термальных геоисточников (морских или наземных) в виде сети неорганических ячеек, обеспечивающих градиенты температуры и рН, способствующих первичным реакциям, и предоставляющих универсальные каталитические поверхности для примитивной биохимии [10].

Эти отсеки могли быть населены разнородной популяцией генетических элементов. Вначале сегментами РНК. Затем более крупными и сложными молекулами РНК (один или несколько белок-кодирующих генов). А позднее и сегментами ДНК, которые постепенно увеличивались (рис. 3).

Такие простейшие генетические системы использовали неорганические соединения из раствора и продукты деятельности других генетических систем. Сначала они должны были подчиняться индивидуальному отбору ввиду большого разнообразия. Но ясно, что важным фактором такого отбора была способность передавать генетическую информацию, то есть, копировать себя. Присутствие одновременно в одной ячейке молекул, способных копировать РНК, кодировать полезные белки и управлять синтезом новых молекул, давало больше шансов выживать в каждой отдельной ячейке. И в такой системе рано или поздно должны были появиться паразитирующие элементы. А если это так, то вирусные элементы стоят у самых истоков эволюции [11].

Возникновение паразитов — неизбежное последствие эволюционного процесса

Рисунок 4. Схематическое представление структуры модели эволюции РНК-подобной системы. На втором этапе цепочки последовательностей начинают соединяться комплементарными связями сами с собой. В результате у двух видов (cat-C и cat-A) возникает вторичная структура молекулы, которая обладает каталитическим свойством. Она ускоряет собственную репликацию (или репликацию несвернувшихся соседей). Два вида при этом приобретают паразитические свойства (par-G и par-U). Пояснения в тексте. Рисунок из [12].

Таким образом, паразитарные репликаторы способствуют эволюции разнообразия, вместо того, чтобы мешать этому разнообразию. Это также делает существующую систему репликатора чрезвычайно стабильной при эволюции паразитов.

Согласно гипотезе Черной Королевы, чтобы поддержать свое существование в постоянно эволюционирующем мире, вид должен реагировать на эти эволюционные изменения и должным образом приспосабливаться к среде. Поэтому, если мы говорим о вирусах как о паразитах, мы обязаны представлять себе взаимоотношения вируса с хозяином. В борьбе с вирусом хозяева развивают новые защитные механизмы, а паразиты отвечают, развивая механизмы для атаки и взлома защиты. Этот процесс может длиться бесконечно либо до вымирания одной из противоборствующих сторон. Так множественные системы защиты составляют существенную часть геномов всех клеточных организмов, а взлом защиты — одна из основных функций генов у вирусов с большими геномами*.

Механизмы клеточной защиты против вирусов

Механизмы защиты от вирусов стандартны, поскольку все вирусы уникальны, и приспособиться к каждому не представляется возможным. Это такие механизмы как:

Деградация РНК (вирусных и клеточных) — РНК-интерференция;
Угнетение синтеза белков (вирусных и клеточных);
Ликвидация зараженных клеток — апоптоз (программируемая клеточная смерть);
Воспаление.

Получается, что клетка борется с вирусом, нарушая собственные обмен веществ и/или структуру. Защитные реакции клетки — это в основном самоповреждающие механизмы.

Вирус заражает конкретную клетку потому, что его механизмы нападения направлены именно против данного типа клеток. Это такие механизмы как:

Угнетение синтеза клеточной РНК;
Угнетение синтеза клеточных белков;
Нарушение клеточной инфраструктуры и транспорта;
Подавление/включение апоптоза и других видов клеточной смерти.

Схемы защитных приемов клетки и противозащиты вирусов во многом идентичны. Вирусы и клетки применяют одни и те же приемы. Для подавления синтеза вирусных белков клетка использует интерферон, а чтобы подавить образование интерферона, вирус угнетает синтез белков.

Поскольку узнавание вируса неспецифическое, клетка не может знать намерения конкретного вируса. Она может бороться с вирусом лишь стандартными приемами, поэтому ее оборонные действия часто могут быть чрезмерными.

Понятие о вирусном геноме, типы вирусных генов, концепция генов-сигнатур

В исследовании, проведенном вирусологом Евгением Куниным и его коллегами [16], анализ последовательностей вирусных геномов выявил несколько категорий вирусных генов, принципиально отличающихся по происхождению. Можно обсуждать, какая степень дробности классификации оптимальна, но четко различаются пять классов, укладывающихся в две более крупные категории.

Гены с четко опознаваемыми гомологами у клеточных форм жизни:

Гены, присутствующие у узких групп вирусов (обычно это гены, гомологичные генам хозяев этих вирусов).
Гены, консервативные среди большой группы вирусов или даже нескольких групп и имеющие относительно отдаленные клеточные гомологи.

Таким образом, отличительные особенности генов-сигнатур:

Происхождение из первичного пула генов;
Наличие лишь очень отдаленных гомологов среди генов клеточных форм жизни, из чего можно сделать вывод, что они никогда не входили в геномы клеточных форм;
Необходимость для репродукции вирусов.

Из всего вышесказанного следует, что эти гены переходили от вируса к вирусу (или к элементу, подобному вирусу) на протяжении четырех миллиардов лет эволюции жизни, а вирусные геномы появились благодаря перемешиванию и подгонке друг к другу генов в гигантской генетической сети, которую представляет собой мир вирусов. Многочисленные гены клеточных форм жизни также пронизывают эту сеть, прежде всего благодаря геномам крупных вирусов, таких как NCDLV и крупным бактериофагам, которые позаимствовали множество генов от своих хозяев на разных этапах эволюции. Однако большинство заимствованных генов сами по себе не критичны для репликации и экспрессии вирусного генома (исключая некоторые случаи возможного неортологичного замещения генов-сигнатур); обычно эти гены участвуют во взаимодействии между вирусом и хозяином. Таким образом, несмотря на интенсивный взаимообмен генами с хозяевами, вирусы всегда происходят от других вирусов.

Вирусы, встроенные в геном, и горизонтальный перенос генов

В процессе эволюции многие вирусы встроились в геномы клеточных форм жизни путем горизонтального переноса генов (ГПГ). Впервые горизонтальный перенос был описан в 1959 году, когда ученые продемонстрировали передачу резистентности к антибиотикам между разными видами бактерий. В 1999 году Рави Джайн, Мария Ривера и Джеймс Лейк в своей статье писали о произошедшей значительной передаче генов между прокариотами [17]. Этот процесс, по-видимому, оказал некоторое влияние также и на одноклеточные эукариоты. В 2004 году Карл Вёзе опубликовал статью, в которой утверждал, что между древними группами живых организмов происходил массивный перенос генетической информации. В древнейшие времена преобладал процесс, который он называет горизонтальным переносом генов. Причем, чем дальше в прошлое, тем это преобладание сильнее [18].

Горизонтальный перенос генов — процесс, в котором организм передаёт генетический материал другому организму, не являющемуся его потомком. Горизонтальная передача генов реализуется через различные каналы генетической коммуникации — процессы конъюгации, трансдукции, трансформации, переноса генов в составе плазмидных векторов, вирусов, мобильных генетических элементов (МГЭ).

Трансдукция — перенос бактериофагом (агентами переноса генов, АПГ) в заражаемую клетку фрагментов генетического материала клетки, исходно содержавшей бактериофаг [19]. Такой бактериофаг обычно переносит лишь небольшой фрагмент ДНК хозяина от одной клетки (донор) к другой (реципиент). В зависимости от типа трансдукции — неспецифической (общей), специфической или абортивной, геном фага или хозяина-бактерии может быть изменен тем или иным образом:

При неспецифической трансдукции (рис. 5) ДНК клетки-хозяина включаются в частицу фага (дополнительно к его собственному геному или вместо него);
При специфической трансдукции гены фага замещаются генами хозяина;
При абортивной трансдукции внесённый фрагмент ДНК донора не встраивается в ДНК хозяина-реципиента, а остаётся в цитоплазме и не реплицируется. Это приводит к тому, что при клеточном делении он передаётся только одной из дочерних клеток и затем теряется в потомстве.

Рисунок 5. Схема общей трансдукции. Фото с сайта vkjournal.ru.

Наиболее известным примером специфической трансдукции служит трансдукция, осуществляемая фагом λ. Поскольку этот фаг при переходе в состояние профага включается в хромосому бактерий между генами, кодирующими синтез галактозы и биотина, именно эти гены он может переносить при трансдукции.

Вот несколько примеров важных эволюционных событий, связанных с молекулярным одомашниванием:

Ферменты теломеразы, служащие для восстановления концевых участков хромосом, возможно, ведут свое происхождение от обратных транскриптаз, кодируемых ретровирусами и ретротранспозонами [22];
Белки RAG, играющие ключевую роль в системе адаптивного иммунитета, по-видимому, происходят от прирученных транспозаз — ферментов, кодируемых транспозонами;
Ген Peg10, необходимый для развития плаценты, был позаимствован древними млекопитающими у ретротранспозона (рис. 6) [23].

Рисунок 6. Роль гена Peg10 в эмбриональном развитии. Ученые под руководством Рюичи Оно из Токийского медицинского университета Японии показали, что у мышей с выключенным геном Peg10 нарушается развитие плаценты, от чего эмбрион погибает через 10 дней после зачатия [24]. Фото с сайта flickr.com.

В 2008 году в ходе целенаправленного поиска неиспорченных вирусных генов в геноме человека исследователи нашли два очень похожих друг на друга ретровирусных гена (их назвали ENVV1 и ENVV2), которые, по всей видимости, находятся в рабочем состоянии [25]. Это гены белков оболочки ретровируса. Каждый из них входит в состав своего эндогенного ретровируса (ЭРВ), причем все остальные части этих ЭРВ давно не функционируют.

Вирусные гены ENVV1 и ENVV2 у человека и обезьян работают в плаценте и, скорее всего, выполняют следующие функции:

Таким образом, как минимум три полезных применения нашли себе вирусные гены в плаценте приматов. Это показывает, что генетические модификации, которым ретровирусы подвергают организмы, в долгосрочной перспективе могут оказаться полезными или даже определить развитие вида. И с учетом всего вышесказанного древо доменов должно выглядеть как на схеме ниже (рис. 7).

Рисунок 7. Горизонтальный перенос генов в рамках трехдоменного дерева. Рисунок из [26].

Заключение

Возникновение паразитов — обязательная черта эволюционирующих систем репликаторов, а соревнование хозяев и паразитов движет эволюцию тех и других. Любой организм является результатом миллионов лет борьбы клеток с невероятно разнообразным миром вирусов. Их действия и их эволюция пронизывают всю историю клеточной эволюции, и сейчас меняется само наше представление о них. Когда-то вирусы считали деградировавшими клетками, но чем больше мы узнаем о вирусах, тем очевиднее, что их роль в общей эволюции значительна. И невероятно много нам еще предстоит узнать.

Статья написана в соавторстве с Евгенией Щепенок.

Что такое горизонтальный перенос генов и насколько он распространен

Авторы недавнего (и, по мнению специалистов, довольно плохого) обзора про ГМО-еду вспомнили старую страшилку, заключающуюся в том, что фрагменты ДНК из пищи, которую мы употребляем, могут попадать в клетки человека или населяющих его микроорганизмов и влиять на экспрессию генов хозяина или даже встраиваться в геном. Подобных примеров современная наука не знает, но вообще случаи горизонтального переноса генов — попадания в организм фрагментов ДНК не от родителей, а извне, из окружающей среды, ученым известны, и многие из них описаны довольно хорошо. Мы решили разобраться в этом вопросе.

Несмотря на то, что позвоночные животные едят ДНК-содержащую еду миллионы лет, свидетельств тому, что съеденные гены как-то влияют на собственный геном, ученые пока не нашли. Тем не менее, получить ДНК не от родителей, а откуда-то извне возможно — этот феномен называется горизонтальным переносом генов. С началом эры массового секвенирования геномов и биоинформатики стало понятно, что горизонтальный перенос сыграл значительную роль в эволюции как прокариот (бактерий и архей), так и высших эукариот, например, растений.

Тем не менее, заполучить чужую ДНК не так-то просто, а наличие и количество, к примеру, бактериальной ДНК в геноме человека до сих пор остается дискуссионным вопросом.

Для того чтобы в геноме появился новый элемент, необходимо, чтобы новая ДНК попала в клетку и встроилась в хромосому. Логично, что проще всего выполнить эти условия, если организм одноклеточный и у него нет дополнительной ядерной оболочки, защищающей геном. По всей видимости, прокариоты (бактерии и археи) действительно пользуются горизонтальным переносом очень активно — для них это еще и аналог полового процесса, позволяющий внести разнообразие в генетическую информацию, наряду со случайным мутагенезом.

В лаборатории свойство компетентности используют для того, чтобы искусственно доставлять ДНК в бактериальные клетки, а в природе к развитию компетентности и натуральной трансформации способны как минимум несколько десятков видов бактерий, среди которых множество патогенных. Как в случае с опытами Гриффита, внешним источником ДНК могут быть погибшие клетки, кроме того, некоторые бактерии выделяют ее наружу намеренно, с использованием систем секреции.

Помимо трансформации, бактерии способны обмениваться ДНК путем конъюгации. Этот специализированный процесс передачи ДНК между клетками при непосредственном контакте был открыт на кишечной палочке в середине XX века. Для того чтобы передать ДНК, клетки кишечной палочки должны содержать небольшую кольцевую экстрахромосомную молекулу ДНК — плазмиду, которая содержит гены, необходимые для конъюгации, и которая, собственно, и передается.

Конъюгация осуществляется с образованием половых пилей — белковых трубочек, при помощи которых устанавливается физический контакт. Кроме кишечной палочки, процесс был найден и у множества других бактерий. Помимо генов, необходимых для собственного распространения, конъюгативная плазмида может содержать гены других полезных признаков, поддерживаемых отбором, например, устойчивости к антибиотикам.

Молекулярный механизм передачи F-плазмиды путем конъюгации у бактерий

Встроить в геном можно не любую ДНК — в общем случае полученный фрагмент просто разрушится внутриклеточными ферментами — нуклеазами и рестриктазами, которые защищают клетку от вторжения. Обмен генами происходит чаще между близкородственными штаммами, у которых большой процент похожих последовательностей. В таком случае новый фрагмент ДНК может встроиться в геном по механизму гомологичной рекомбинации, для которой необходимо наличие одинаковых или близких по составу нуклеотидных последовательностей.

Если существование горизонтального переноса было установлено еще до расшифровки последовательностей генома, то масштабы явления стали понятны только с наступлением эры секвенирования. Попытки построить для всех живых организмов универсальное филогенетическое дерево на основании последовательностей геномов привели к ряду филогенетических конфликтов. Нередко какие-то гены обнаруживаются там, где по логике эволюционного наследования, их быть не должно. Отсутствие гена у предков организма часто наводит исследователей на мысль, что он получен путем горизонтального переноса.

Расшифровка множества эукариотических геномов позволила предположить, что горизонтальный перенос сыграл важную роль в эволюции не только бактерий, но и одноклеточных эукариот, в частности, простейших, а также водорослей и высших растений, многих беспозвоночных животных.

У прокариот механизмы доставки новых генов более или менее изучены и понятны, но у эукариот ДНК дополнительно защищена ядерной мембраной и белками-гистонами. Кроме того, если речь идет о многоклеточных организмах с половым размножением, то для того, чтобы закрепиться в поколениях, хромосома с новым элементом должна попасть в половые клетки. Таким образом, на пути горизонтального переноса у более сложных организмов, нежели бактерии, стоит множество барьеров. Поэтому в его наличие стоит верить только при существовании вероятного механизма передачи.

Обмен генетической информацией между ядерным геномом и митохондриальным детектируют и в настоящее время, например, у человека он иногда наблюдается при злокачественном преобразовании клеток. Происходить это событие может, например, во время митоза, когда ядерная оболочка разрушается. Как при этом преодолевается барьер митохондриальной мембраны, не совсем понятно, скорее всего митохондрии просто деградируют, и митохондриальная ДНК выходит в цитоплазму.

Биологам известны и современные примеры эндосимбиоза и эндопаразитизма, сопровождающиеся горизонтальным переносом генов. К примеру, внутриклеточный симбионт членистоногих и некоторых червей-нематод бактерия вольбахия нередко встраивает большие куски своего генома в геном хозяина. Вероятно, это происходит случайно в процессе репарации ДНК, и большой пользы хозяевам вольбахии от этого нет, так как большинство бактериальных генов при этом неактивны или превращаются в псевдогены, то есть необратимо ломаются.

Микрофотография вольбахии внутри клетки насекомого

Genome Sequence of the Intracellular Bacterium Wolbachia. PLoS Biol 2004

Рекомбинантные ДНК — это ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.

Сшивка фрагментов ДНК, полученных при помощи рестриктаз, производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК:

Векторными молекулами или векторами называют молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию, а может быть, и экспрессию.

Экспрессия гена — проявление генетической информации, записанной в гене, в форме рибонуклеиновой кислоты, белка и фенотипического признака.

Векторы позволяют осуществить введение в клетку дополнительной генетической информации. В качестве векторов используют как правило плазмиды, бактериофаги и вирусы животных.

При создании трансгенных растений применяют природный генный вектор, возникший в организме почвенных бактерий (Agrobacteria). Почти все двудольные растения чувствительны к агробактериям, а злаки и другие однодольные — нет.

Сущность этого способа состоит в следующем: Т-ДНК с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в Е. coli, например pBR 322. Плазмиду с Т-ДНК размножают и, используя стандартные методы, встраивают чужеродный ген внутрь Т-области и вновь размножают с уже вставленным геном. Затем полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefacience, несущую полную Ti-плазмиду. В результате двойной рекомбинации между гомологичными областями Т-ДНК часть рекомбинантной плазмиды, которая содержит чужеродный ген, включится в Ti-плазмиду, заместив в ней нормальную Т-ДНК.

Бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают растения. В результате этого образуются опухоли — корончатый галл. Начинается перестройка метаболизма клеток, которые будут содержать Ti-область со встроенным в него чужеродным геном.

Существуют и другие методы введения чужеродной генетической информации: применение бинарных векторов; векторов на основе ДНК-содержащих вирусов растений; прямого переноса генов.

Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации однодольных.

Сущность этого метода заключается в том, что на мельчайшие частицы золота или вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые или золотые частицы, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биологической баллистической (биолистической) пушки. Они с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.

С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растения-трансформанты.

В мире известны тысячи штаммов Bt с разнообразными генами и широким потенциалом биологически активных белков, представляющих богатейший источник структурных компонентов многочисленных будущих препаратов для борьбы с самыми разнообразными вредителями.

Рис. 6.4. Использование 77-плазмиды в качестве вектора для переноса генов в растительные клетки [21]

Успехи генной инженерии неизмеримо расширили спектр биологических объектов перспективных как доноры генов. Помимо растений ими могут быть насекомые, грибы, бактерии, вирусы. Отсюда стремление биотехнологических компаний создавать свои частные банки генов. Так, фирма Бристайл-Майерс (США) имеет патенты на многие бактериальные культуры, в числе которых 28 образцов из Индии, а также из Филиппин, Фиджи, Бразилии, Перу и др. По нормам промышленного патентования фирма приобретает монопольное право на их использование.

В течение последних 10 лет использование маркерных последовательностей является основополагающим при идентификации ДНК и составлении геномных карт организмов. Обычно маркерные фрагменты ДНК соответствуют полиморфным сайтам или разным аллельным вариантам, которые в последующем можно идентифицировать, используя методы блот-гибридизации и полимеразной цепной реакции (PCR).

Ген, вставленный в ДНК генномодифицированного организма, имеет три основные области, которые являются целевыми объектами для амплификации, и следовательно для выявления соответствующих генов и построения генетических карт растений.

Рис. 6.5. Генетическая конструкция генномодифицированного

Амплификацию фрагмента ДНК между заданными праймерами используют для наработки ДНК с уникальной области генома для его последующего быстрого клонирования (рис. 6.6).

С помощью метода PCR возможна также амплификация фрагмента ДНК, фланкирующего уже известную последовательность, что обусловливает возможность идентификации генномодифицированных источников пищи. Кроме того, в настоящее время с помощью PCR можно клонировать и изучать также РНК, составлять геномные карты, контролировать наличие запатентованных генов и т.д.

Рис. 6.6. Полимерная цепная реакция (PCR) идентификации генов [32].

В настоящее время появились трансгенные растения, которые не содержат таких последовательностей ДНК. Поэтому, в соответствии с Российским законодательством, заявитель продукции, полученной из ГМО, обязан предоставить экспертам данные о структуре рекомбинантной ДНК, внедренной в растительный геном.

Проблема генетических ресурсов Земли, т.е. поиск природных источников генов приобретает особую актуальность. Она, в свою очередь, обуславливает необходимость строгого контроля распространения трансгенных организмов

Следует отметить, что в каждой стране существуют свои правила такого контроля. В то же время, для ускорения коммерческого использования трансгенных растений в разных странах, система получения разрешения на их испытания облегчается, если растение уже зарегистрировано в другой стране.

При этом оценка генномодифицированного организма по критериям безопасности в каждой стране складывается из двух основных направлений:

• исследование биобезопасности генномодифицированных организмов;
• определение пищевой безопасности генномодифицированных организмов и продуктов питания из них.

В некоторых странах создание, производство, применение продукции с использованием ГМИ подлежит государственному регулированию, в том числе и в России, где исследовано и одобрено к применению несколько видов трансгенных продуктов.

В настоящее время в Российской Федерации полный объем необходимых исследований прошли 15 видов пищевой продукции растительного происхождения, полученных с применением методов современной биотехнологии и разрешенных для использования в пищевой промышленности (табл. 6.1).

Генетически модифицированные источники пищи, выпускаемые в мире в промышленных объемах и зарегистрированные в Федеральном Реестре Российской Федерации

Производитель, торговая фирма

Кукуруза линии Bt-11

устойчивость к зерновому точильщику и глю- фосинату аммония

Читайте также: