Пцр диагностика вирусов картофеля

Аскохитоз томата (Ascochyta lycopersici, син. Didymella lycopersici)

* - данные наборы производятся только по предварительному заказу

Еще два десятилетия назад методы диагностики инфекций у растений были довольно трудоемкими и занимали много вре­мени. Использование растений-индикаторов для идентификации вирусов, специальных сред для выявления бактерий и другие традиционные методы анализа занимали дни, а, в ряде случаев, недели и месяцы.

Основной прорыв произощел с внедрением в диагностику метода иммуно-ферментного анализа (ИФА), одним из наиболее распространенных вариантов которого является так называемый ELISA-тест (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). Ме­тод позволил не только увеличить чувствительность анализа, но и сократить время тестирования до нескольких часов. ELISA и по сей день является наиболее распространенным и широко используемым методом анализа растительного материала для диагностики и идентификации патогенов. При постановке ИФА тестов используется целый ряд технологий и модификаций с ис­пользованием биотиниликованных и конъюгированных с щелоч­ной фосфатазой или пирофосфотазой антител в так называемых прямом методе, двойном и тройном сандвичах и др.

Диагностика фитопатогенов методом ИФА хорошо зарекомендо­вала себя в широкомасштабных рутинных тестированиях раститель­ного материала, однако метод обладает не всегда удовлетворительной специфичностью, диагностируя зачастую не отдельные патогены, а целые группы и не позволяет четко идентифицировать конкретные изоляты и штаммы. Следует иметь в виду и тот факт, что от партии к партии качество и специфичность получаемых антител может до­вольно существенно разниться. В настоящее время специфичность ИФА в значительной степени увеличена за счет использования моно-клональных и рекомбинантных антител. Использование модифика­ции метода ИФА - процедуры иммуноферментного анализа отпечат­ков образцов растительных тканей на нитроцелдюлозной мембране (tissue print-ELISA) - также обеспечивает высокую специфичность, хотя чувствительность этого метода недостаточна для использования в случае детекции ряда латентных бактериальных инфекций.

Дрзтим серологическим методом, применяемым для диа­гностики фитопатогенов, в частности бактерий, является метод проточной фотометрии (Alvarez, 2001), хотя высокая стоимость используемой в этой процедуре аппаратуры существенно ограни­чивает его использование в реальной практике.

В настоящее время при анализе растительного материала возникает необходимость применения высокочувствительных и специфичных методов детекции, позволяющих диагностиро­вать патогены в низкой концентрации, что особенно важно в слу­чае контроля растительного материала на наличие карантинных патогенов. Поэтому в помощь, а сегодня все чаще на смену тра­диционным и серологическим методам, в практику контроля фи-тосанитарного состояния сельскохозяйственных растений и про­дуктов их переработки приходят молекулярные технологии. Это позволяет значительно повышать специфичность анализов и обеспечивать чувствительность, в 10 - 100 раз превышающую чувствительность ИФА.

Современный метод высокоэффективного тестирования па­тогенов, в том числе и фитопатогенов, основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Bartlett, Stirling, 2003). Простота, высокие чувствительность и специфичность, хорошая воспроизводимость результатов анализов быстро превратили этот подход в один из наиболее перспективных диагностических методов. В отли­чие от традиционных и серологических методов анализа, даю­щих только опосредованное свидетельство наличия инфекции (например, сведения о наличие белков-антигенов диагностируе­мых патогенов), метод ПЦР напрямую доказывает присутствие возбудителя инфекции, специфически выявляя наличие конкрет­ной последовательности нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) обнаруживаемого патогена. Кроме того, метод ПЦР, благодаря своей высокой чувствительности, позволяет выявлять единичные копии геномов патогенов, обнаруживая тем самым их наличие тогда, когда другими методами (иммунологическими, бактерио­логическими, микроскопическими) это сделать практически не­возможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто сущест­вующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях: ПЦР-технологии, как правило, позволяют избежать сложностей, свя­занных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Кроме того, использование метода ПЦР позволяет зна­чительно сократить время анализа образца. За счет автоматиза­ции процесс амплификации занимает всего 1 - 2 часа, а с учетом предшествующей пробоподготовки и регистрации результатов анализа, весь процесс занимает не более 4 часов. Помимо всего выше перечисленного, существенным достоинством метода яв­ляется возможность осуществлять количественное определение возбудителя в модификации метода ПЦР в реальном времени.

Высокая чувствительность ПЦР является как преимуществом, так и недостатком метода, создавая ряд проблем, одной из кото­рых является высокая вероятность появления ложноположитель-ных и ложноотрицательных данных. Кроме того, корректность проводимых ПЦР-тестов в значительной степени зависит от адек­ватности методов выделения нуклеиновых кислот из раститель­ного материала; чувствительность детекции зависит от влияния присутствующих в растительном материале ингибиторов ПЦР.

Все это усложняет процедуру ПЦР-детекции, требуя постановки дополнительных контрольных тестов или использования моди­фикаций метода ПЦР. При молекулярной диагностике фитопато-генных грибов, вирусов и бактерий применяют следующие моди­фикации ПЦР: метод конкурентной ПЦР (Mauchline et al., 2002), кооперативной ПЦР (Co-PCR) (Olmos et al., 2002), ПЦР-гибри-дизация in situ с использованием флуоресцентных зондов (Lopez et al., 2003), мультиплексная ПЦР (Rigotti, Gugerli, 2007), метод множественной (или групповой) мультиплексной ПЦР (multiplex nested RT-PCR) (Morris et al., 2001, Ciapina et al., 2004), метод ПЦР в реальном времени (real-time PCR) (Norman et al, 2002).

Наиболее перспективным для диагностических лабораторий, проводящих рутинные анализы, являются методы ПЦР в форма­те FLASH (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization) (Лаптинов, 2004) или в формате реального времени (Norman et al., 2002). Оба формата основаны на флуоресцентной детекции про­дуктов амплификации. Оба формата позволяют регистрировать результаты ПЦР непосредственно во время (ПЦР в формате ре­ального времени) или после проведения реакции (ПЦР в форма­те FLASH), без открывания пробирок, благодаря чему решается проблема контаминации помещения продуктами ПЩ', упроща­ются требования к организации ПЦР-лаборатории, значительно снижается трудоемкость и время проведения стадии детекции. Методы обеспечивают также возможность простой и эффектив­ной документации и хранения результатов ПЦР в компьютерной базе данньгх. Следует отметить, что ПЦР в формате реального времени требует довольно дорогого оборудования, тогда как сто­имость оборудования для ПЦР в формате FLASH сопоставима с оборудованием для гель-электрофореза и в 5 - 8 раз дешевле оборудования для ПЦР в реальном времени.

Другим примером применения молекулярных методов для диагностики фитопатогенов, основанных на ПЦР и включающих гибридизацию, является весьма перспективный, но пока только развивающийся метод биочипов (Schultz, 1996). Преимущества ис­пользования биочипов состоят в следующем: биочип дает возмож­ность проведения множественного параллельного исследования биологических объектов (тысячи ячеек на 1 см 2 ); он миниатюрен, что обеспечивает удобство эксплуатации, экономию реактивов и т д.; биочип универсален и дешев, так как одна технологическая схема обеспечивает производство различных микрочипов; в био­чипе можно использовать в качестве иммобилизованных зондов

фрагменты ДНК, РНК, белков (с сохранением ферментативных и антигенных свойств), а также клеток - биосенсоров.

Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что современ­ные, доступные для широкого круга потенциальных потребите­лей технологии диагностики и идентификации фитопатогенов базируются, в основном, на двух технологиях - ИФА и ПЦР, ко­торые постоянно совершенствуются в плане чувствительности, надежности и простоты применения. Кроме того, в настоящее время существует тенденция использования комплекса методов (ring tests), включающих как традиционные (микроскопия, изби­рательные среды, патогенность и т.п.), так и современные серо­логические и молекулярные тесты. Диагностика фитопатогенов, как собственно и любых других объектов, приобретает черты ди­намичной и постоянно эволюционирующей системы.

Вирусы вызывают одни из самых экономически значимых заболеваний картофеля и являются основной причиной снижения категорий семенного картофеля. Вирусы поражают как семенной, так и товарный картофель, вызывая потери в урожайности и снижение качества продукции. Заражённые растения не поддаются лечению.

В Российской Федерации семенной картофель традиционно исследуют на наличие 6 вирусов:

Вирус переносится тлёй, а также при механическом повреждении растений. Вирус вызывает существенное снижение урожайности ряда сортов картофеля. Симптомы заболевания и степень потерь урожая находятся в прямой зависимости от штамма вируса, устойчивости сорта и продолжительности воздействия вируса на растение.

Вирус переносится тлёй. Поражение приводит к серьёзным повреждениям растений, выражающимся в скручивании листьев и некрозах ткани, и значительному снижению урожайности.

Заражение картофеля этими вирусами может протекать бессимптомно и не приводить к заметному снижению урожайности, однако, совместное заражение растений с тяжёлыми вирусами (PVY, PLRV) приводит к существенному усилению проявления симптомов заболеваний и увеличению потерь урожайности.

Диагностика вирусов картофеля

Испытательная лаборатория ООО Независимая диагностическая лаборатория оказывает услуги по диагностике семенного картофеля на наличие вирусов с учётом требований соответствующего ГОСТ.

Уровень заражения семенного картофеля вирусами, а также методы отбора проб и определения качества семенного картофеля регламентируются ГОСТ 33996-2016 “Картофель семенной. Технические условия и методы определения качества”:

• наличие растений с проявлением симптомов тяжелых форм мозаики (YBK) и скручивания листьев картофеля (ВСЛК) в исходном материале не допускается (пункт 5.1.2; таблица 1)
• в оригинальном, элитном и репродукционном семенном картофеле допускается наличие растений с проявлением симптомов тяжелых форм мозаики (YBK) и скручивания листьев картофеля (ВСЛК) (в процентах по счёту) не более 0.4, 1 и 2%, соответственно (пункт 5.1.2; таблица 1)
• по результатам лабораторного тестирования в исходном материале наличие вирусов не допускается (пункт 5.1.11; таблица 2)
• по результатам лабораторного тестирования допускается наличие вирусов в семенном картофеле категорий ПП-1 и ССЭ (в процентах по счёту) не более 5% (YВК – не более 0.5%) и 10% (YВК – не более 1%), соответственно (пункт 5.1.11; таблица 2)
• для партий суперэлитного, элитного и репродукционного семенного картофеля лабораторное тестирование проводится по заявке производителя или поставщика семенного картофеля. Предельно допустимые нормы ограничения вирусной инфекции по результатам лабораторного тестирования клубневых проб могут устанавливаться в договорах (контрактах) на поставку семенного картофеля по договоренности сторон. Для партий категории ЭС предельный уровень ограничения YВК по результатам лабораторного тестирования не должен превышать 10%
• для проведения лабораторного тестирования на заражённость вирусной инфекцией отбирают 200 клубней для оригинального семенного картофеля и 100 клубней для элитного семенного картофеля (пункт 6.3.1; таблица 6)
• полимеразная цепная реакция (ПЦР) и иммуноферментный анализ (ИФА) являются методами лабораторного тестирования исходного материала, оригинального и элитного семенного картофеля (пункты 5.1.11, 7.3.1, 7.3.2).

Диагностика вирусов картофеля подразумевает определение процента клубней, инфицированных вирусами, относительно общего количества клубней. В Независимой диагностической лаборатории применяются два основных метода диагностики – иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени с зондами Taqman, совмещённая с реакцией обратной транскрипции.

Для проведения ИФА в лаборатории используются антитела и конъюгаты антител производства компании Bioreba AG (Райнах, Швейцария; ISO 9001 и ISO 17025) и SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture; Эдинбург, Шотландия; ISO 9001). Все процедуры выполняются в строгом соответствии с рекомендациями производителя антител.

Ключевые слова: вирусные болезни сельскохозяйственных культур, фитомониторинг, иммунострипы, растения-индикаторы.

The article discusses phytosanitary monitoring to detect viral diseases of crops Astrakhan region in 2015-2016. Detection and identification of viral phytopathogenes conducted on the basis of branch FGBI "Russian agricultural center" PCR, indicator and serological (immunochromatographic) methods on immunostrips. A clear definition of the virus allows us to improve the methods of combating viral infection and to develop measures for the protection of crops adapted to the conditions of our region.

Keywords: virus diseases of crops, fitomonitoring, immunostrips, indicator plants.

В Астраханском регионе много препятствий для аграриев: недостаточное увлажнение, чрезмерная жара, вредители,– все это мешает, а порой и делает невозможным, выращивание сельскохозяйственных культур. К этому набору можно еще прибавить и бесконтрольный ввоз семян и овощей, который не проходит вирусологическую экспертизу. Отсюда нередко складывается неудовлетворительная ситуация с качеством и количеством урожая. По старинке земледельцы привыкли к технологии смешивания пестицидов и удобрений. Но фермер от недостатка информации рискует создать смесь из несовместимых препаратов, которая не даст желаемого результата и погубит урожай. Все это приводит к логическому выводу: фермерам необходима профессиональная помощь. Каждое поле, каждый приусадебный участок имеет свою индивидуальную особенность. Важно провести исследование, выявить фенологию развития вредителей и болезней, учесть климатические особенности. И только потом можно выбирать те средства защиты и удобрения, которые гарантируют успех работы.

По результатам обследования в 2016 году зараженная вирусными болезнями площадь составляет 983 га (в т.ч. томаты 379 га, огурцы 150 га, бахчевые 84 га, картофель 370 га). Основные очаги инфекции фиксируются в Черноярском, Камызякском, Ахтубинском и Приволжском районах. Единичные случаи проявления вирусных заболеваний встречаются в Красноярском, Лиманском и Наримановском районах. Наличие вирусных болезней в частном секторе фиксируется повсеместно.

Защита растений от болезней, носящих природно-очаговый характер, значительно осложняется наличием неконтролируемых природных очагов. Полностью искоренить вирусные природные очаги вирусных болезней растений практически невозможно, так как среди растений-резерваторов инфекции могут быть не только сорняки, но и дикорастущие кустарники и деревья. Уничтожение множества дикорастущих растений, даже являющихся резерваторами вирусов, с точки зрения охраны природы недопустимо, в связи с чем, возрастает роль фитосанитарного мониторинга состояния природных очагов инфекции в регионе.

Одной из основных причин распространения фитопатогенных вирусов является несоблюдение севооборота. Однако севообороты практически не осуществляются, положение усугубляется уменьшением площадей зерновых и кормовых культур, складывающимися благоприятными для развития вирусных и микоплазменных заболеваний погодными условиями [1, 2, 5]. Неиспользуемые бросовые земли площадью около 100—150 тыс. га являются резерваторами развития болезней и вредителей [4].

Целью исследования являлось изучение вирусных болезней картофеля в Астраханской области методом ПЦР-диагностики в 2015 г. и 2016 г. для снижения вредоносности фитопатогенов.

Объекты и методы исследований

В связи с прогнозом массового развития вирусных болезней в 2017 г. и в целях недопущения гибели на посевах и посадках овоще-бахчевых культур и картофеля сельхозтоваропроизводителям рекомендуется проверка семенного материала на выявление скрытой зараженности фитопатогенами.

К каждой партии, присылаемой в филиал на анализ, должна быть приложена сопроводительная записка, содержащая:

- точное название вида растения, сорта или гибрида;

- фирма-производитель и год репродукции семян;

- сведения о проведении или отсутствии фитопатологической экспертизы семян;

- ФИО заказчика, название организации, контактные данные.

Срок проведения анализа, включая пробоподготовку и выдачу результатов исследования, 1 день. Стоимость диагностики договорная.

После проведения диагностики болезней растений сельхозтоваропроизводители получают рекомендации, адаптированные к полученным результатам, включающие профилактические рекомендации (индивидуально для каждого хозяйства) для снижения вредоносности вирусных болезней сельскохозяйственных культур.

При каждой экспертизе диагностировалось 10 клубней одного сорта от партии. По результатам исследований выданы протоколы испытаний с разработкой рекомендаций, составленных на основе полученных данных и адаптированных под требования заказчика.

В протоколах испытаний фиксировались качественный (рис. 1) и количественный (рис. 2) анализы, выявленных фитопатогенов, а также устанавливалось соотношение больных и здоровых клубней картофеля. Для партий картофеля одного сорта, в которых процент заражения вирусной инфекцией превышал 30 %, были выписаны рекомендации о непригодности для посадки и ликвидации данного семенного материала.

Рис. 1. Качественный анализ клубней картофеля методом ПЦР-диагностики

Рис. 2. Количественный анализ клубней картофеля методом ПЦР-диагностики

Результаты и обсуждение исследований

По данным протоколов испытаний подобные случаи за период работы ПЦР-лаборатории зафиксированы в 2015 г. 3 раза (15 % от общего числа проверенных клубней), в 2016 г. – 17 раз (19,5 % от общего числа проверенных клубней).

Результаты ПЦР-диагностики картофеля свидетельствуют о том, что наиболее распространенным и вредоносным возбудителем вирусной инфекции на территории Астраханского региона продолжает оставаться У-вирус картофеля. Потери урожая от развития данной инфекции достигают 60—90 %.

Анализ данных ПЦР-лаборатории по картофелю показал, что в 2015 г. из 200 шт. проверенных клубней только 5 шт. оказались здоровыми и свободными от вирусной инфекции, что составило 2,5 % от общего числа исследованных клубней. В 2016 г. из 870 шт. проверенных клубней здоровыми оказались лишь 15 шт. (1,7 %) (табл. 1).

Качественный анализ клубней картофеля методом ПЦР-диагностики

Количество клубней, зараженных фитопатогенами, шт

Фитосанитарный мониторинг посадок картофеля в фермерских хозяйствах Астраханской области выявил, что на раннем картофеле на площади 3,5 тыс. га с распространением от 30 до 50 % в мае 2016 г. вирусная инфекция проявлялась в виде мозаики, гофрированности и деформации листовых пластинок, некроза по жилкам, карликовости куста, уродливости клубней (рис. 3, 4). При обследовании посадок позднего картофеля вирусные болезни были выявлены на площади 5,8 тыс. га, с распространением 50—60 %.

Рис. 3 Морщинистость и деформация листьев (ориг., 2016 г.)

Рис. 4 Недоразвитость растений (ориг., 2016 г.)

Основные очаги фиксируются в Приволжском, Харабалинском, Черноярском, Лиманском районах, единичные случаи проявления вирусных заболеваний встречаются в Красноярском и Наримановском районах. Наличие симптомов вирусоносительства в частном секторе фиксируется повсеместно (табл. 2).

Информация о потребности, наличии и качестве семян картофеля на 1.06.2016 г.

Однако большая часть картофелеводов Астраханской области сознательно игнорирует услуги, оказываемые филиалом в области проверки семенного и растительного материала картофеля на предмет вирусоносительства, что влечёт за собой тяжелые последствия на полях области (заражение почвы, появление новых очагов резерваций), для избавления от которых потребуются годы, а то и десятилетия, при отсутствии соблюдения севооборотов.

В 2017 г. на посадках картофеля в Астраханской области прогнозируется массовая вспышка развития вирусных болезней, носящая характер эпифитотии.

Для предотвращения вредоносности вирусных болезней картофеля филиал настоятельно рекомендует сельхозтоваропроизводителям соблюдение следующих мероприятий:

1. Обязательная проверка семенного и растительного материала на скрытые симптомы заражения фитовирусами, бактериями и грибами;
2. Проведение комплекса профилактических обработок для повышения иммунного статуса растений и борьбы с вирусной инфекцией от семенного материала до уборки урожая (инновационная разработка филиала);
3. Проведение фитопрочисток для уничтожения резерваторов вирусной инфекции;
4. Борьба с насекомыми-переносчиками фитовирусов.

Сравнительный анализ полученных нами данных по составу сорной растительности (резерваторов вирусной инфекции) при маршрутных обследованиях хозяйств Астраханской области в 2016 г. с материалами исследований предыдущих лет, показал отсутствие изменений в составе сорной растительности на полях.

При определении видового состава возможных переносчиков вирусов был проведен сбор насекомых в хозяйствах Харабалинского и Лиманского районов [3]. Наиболее многочисленными по видовому составу являлись представители сем. Aphidoidea: люцерновая (A. craccivora), бахчевая (A. gossypii) и бобовая (A. fabae) тли, которые являются переносчиками многих вирусных заболеваний.

Специалисты филиала информируют всех сельхозтоваропроизводителей о риске появления массового развития вирусов в 2017 г. и предлагают услуги по предупреждению и предотвращению появления, а также сдерживанию развития вирусных и других болезней сельскохозяйственных культур. Корректировка защитных мероприятий в случае появления больных (с подозрением на вирусы) растений проводится нами только после идентификации патогена. Сельхозтоваропроизводители Астраханской области получили результаты (с выдачей рекомендаций) по диагностике и идентификации растительного материала с симптомами вирусоносительства также непосредственно в хозяйствах.

В результате анализа растительных образцов приведенными выше методами на предмет вирусоносительства из хозяйств Приволжского, Черноярского, Ахтубинского, Камызякского и Лиманского районов, свободными от вирусов оказались образцы лишь одного хозяйства в Лиманском районе. На всех остальных образцах выявлен возбудитель и характер вирусной инфекции. Результаты и рекомендации по предотвращению вирусной инфекции разосланы в районы и, непосредственно сельхозтоваропроизводителям.

На данном этапе мы выдаем результаты анализов и рекомендации сельхозтоваропроизводителям, консультируем их по способам предотвращения эпифитотийных и очаговых ситуаций в плане вирусной инфекции в Астраханской области.

Однако область по-прежнему нуждается в приобретении универсального оборудования, для четкой диагностики скрытой вирусной инфекции в семенном материале сельскохозяйственных культур.

Проведен анализ данных по распространению вирусных болезней, в котором установлена закономерность: высокая степень распространения (30—70 %) вирусных заболеваний наблюдается в тех хозяйствах, владельцы которых использовали непроверенные некондиционные семена. На проверенных кондиционных семенах отмечаются единичные случаи поражения вирусной инфекцией, связанные с нарушением агротехнологии возделывания культур.

Использование качественного посевного материала в значительной степени уменьшает возможность передачи инфекции, а также помогает избежать снижения урожайности и высокой концентрации вирусов в поле, что, также, касается непосредственно сельхозтоваропроизводителей, которые используют собственный семенной материал. О необходимости проверки семенного посадочного материала неоднократно направлялись письма в Министерство сельского хозяйства Астраханской области и главам районов.

Для улучшения фитосанитарной обстановки в области необходимо:

1. Обеспечить проверку всего посевного и посадочного материала на наличие вирусных болезней.

2. Строго проконтролировать научно-обоснованные севообороты и борьбу с резерваторами вирусной инфекции (сорная растительность, насекомые-переносчики).

3. Внедрить эффективные меры и препараты по сдерживанию и профилактике развития вирусных болезней с.-х. культур.

Таким образом, в результате проведенного исследования получены данные по развитию и распространению вирусных болезней картофеля в Астраханской области методом ПЦР-диагностики в 2015 г. и 2016 г.

Динамика борьбы по оздоровлению семенного картофеля за последние годы показывает, что своевременная экспертиза на наличие скрытых фитопатогенов картофеля даёт возможность предвидеть негативные последствия на поле для получения высокого и качественного урожая.

Список литературы

1. Тютюма Н. В., Кудряшова Н. И. Оптимизация уровня минерального питания томатов при капельном орошении в условиях севера Астраханской области // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2014. №2. – С. 17—18.
2. Тютюма Н. В., Туманян А. Ф., Щербакова Н. А., Кудряшова Н. И. Повышение эффективности производства томатов и картофеля в Астраханской области за счет внедрения новых сортов // Проблемы развития АПК региона. 2016. Т. 1. № 1-1 (25). – С. 86—91.
3. Фоминых Т. С., Богоутдинов Д. З., Иванова Г. П., Белых Е. Б., Уткина В. Ю. Рекомендации по защите томата и перца от вирусных и фитоплазменных болезней. Астрахань, 2010. – 56 с.
4. Шпаар Д., Шуманн П. Борьба с вирусными и вироидными болезнями // Защита и карантин растений. Выпуск 5. 2004. – С. 15—17.
5. Щербакова Н. А., Тютюма Н.В., Туманян А. Ф., Кудряшова Н. И. Элементы продуктивности овощных культур семейства пасленовых в зависимости от уровня минерального питания // Теоретические и прикладные проблемы агропромышленного комплекса. 2016. № 1 (26). – С. 43—52.

Bibliography

1. Tyutyuma, N. V., Kudryashova N. I. Optimization of the level of mineral nutrition of tomatoes during drip irrigation in the north of the Astrakhan region / Tyutyuma, N. V., Kudryashova N. I. // Zh .: Vestnik of the Russian Academy of Agricultural Sciences. -2014. - №2. -Р. 17-18.

2. Tyutyuma, N. V. Increasing the efficiency of tomato and potato production in the Astrakhan region through the introduction of new varieties / N. V. Tyutyuma, A. F. Tumanyan, N. A. Shcherbakova, N.I. Kudryashova // Problems of development of agro-industrial complex of the region. -2016. -T. 1.-No. 1-1 (25). -Р. 86-91.

3. Fominykh, T. S. Recommendations for the protection of tomato and pepper against viral and phytoplasmic diseases / T. S. Fominykh, D. Z. Bogoutdinov, G. P. Ivanova, E. B. Belykh, V. Yu. Utkina. - Astrakhan. - 2010. - 56 pp.

4. Shpaar, D. Fighting viral and viral diseases / D. Shpaar, P. Schumann // Protection and quarantine of plants. - Release 5. - 2004. - P. 15-17.

5. Shcherbakova, N. A., Elements of productivity of vegetable cultures of the Solanaceae family, depending on the level of mineral nutrition / N. А. Scherbakova, N. V. Tyutyuma, A. F. Tumanyan, N. I. Kudryashova // Theoretical and applied problems of the agro-industrial complex. -2016. - No. 1 (26). -С. 43-52.

Читайте также:

• Грипп с сильной болью в руке
• Коэффициенты антител к вирусам
• Есть ли вирусы на дисках-играх
• Растения для лечения гриппа
• Можно ли делать диаскинтест после гриппа

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.