Организация генома вируса гепатита с

Несмотря на то, что не удается получить ВГС в количествах, позволяющих провести его исчерпывающее электронномикроскопическое и вирусологическое изучение, определены следующие характеристики вируса гепатита С: диаметр вириона— 50 нм (по данным различных исследователей от 30 до 60 нм);

чувствительность к действию хлороформа; наличие белковой оболочки, коэффициент седиментации — не менее 150 S. Исследование плавучей плотности ВГС, полученного in vivo и in vitro, установило различия в их коэффициентах седиментации. Вирус, выделенный из плазмы больного острым гепатитом С и экспериментально зараженной шимпанзе, имел плавучую плотность в градиенте сахарозы — 1,06 г/см 3 , тогда как плотность вируса полученного на культуре клеток,— 1,12 г/см 3 . Считают, что более низкая плавучая плотность ВГС, полученного in vivo, определяется его ассоциацией с липопротеинами низкой плотности, что может способствовать проникновению вируса в гепатоцит. Обнаружение в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С частиц с высокой плавучей плотностью 1,17 г/см 3 связывают с наличием комплекса ВГС с антителами.

ВГС инактивируется при температуре +60° С - в течение 30 минут, а при 100° С — за 2 минуты.

Геном ВГС представлен однонитевой линейной молекулой РНК положительной полярности протяженностью около 9400 нуклеотидов. Результаты клонирования и полного секвинирования РНК ВГС, а также физико-химические характеристики вируса позволили отнести ВГС к семейству Флавивирусов, выделив в отдельный род Гепацивирусов. Сравнительный анализ РНК ВГС с геномами других вирусов, входящих в данное семейство, выявил сходство с фрагментами геномов вирусов Денге второго типа и вируса пятнистости гвоздики (группа кариновирусов). Кроме того, зарегистрированы так называемые “локальные” гомологии (не более 16 нуклеотидов в регионе) с пестивирусами (вирус холеры свиней и вирус бычьей диареи). Наличие гомологии РНК ВГС и с геномами вирусов растений позволило предположить, что ВГС занимает промежуточное положение в эволюции вирусов между вирусами животных и растений.

Организация генома ВГС (рис. 7 ) подобна организации геномов других флавивирусов (например, вируса желтой лихорадки). В РНК ВГС выделяют зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки.

Гены, кодирующие структурные белки, расположены у 5' области генома вируса, а неструктурные — у 3' области. На концах РНК ВГС имеются некодирующие участки размером приблизительно 340 и 60 оснований. РНК ВГС содержит единственную открытую рамку считывания, несущую информацию о вирусспецифическом полипротеине, размером около 3000 аминокислотных остатков, который, благодаря действию нескольких протеолитических энзимов вирусного и клеточного происхождения, разделяется на отдельные белки.

Установлено, что 5' область генома ВГС, кодирующая структурные белки вируса, короче аналогичных областей флави- и пестивирусов. Считается, что эта зона контролирует синтез четырех белков: Кор-белка - негликолизированного гидрофильного протеида (р 19), считающегося нуклеокапсидным белком; двух оболочечных белков, кодированных зоной Е1 (р18 и gp33) и Е2, ранее идентифицированной как зона ВГС-NSl, (р38 и gp72) и небольшого белка с неустановленной функцией. Белки, синтезированные с участков гена Е1 и Е2, считают гликопротеидами внешней оболочки вируса гепатита С (Env). Они играют роль в прикреплении и проникновении вируса в клетку. Высказывается предположение, что белки, кодируемые структурной зоной РНК ВГС, могут быть мишенью для нейтрализующих и протективных антител, т. е. эти белки, возможно, будут использованы для изготовления вакцины против гепатита С.

Область РНК ВГС, кодирующая неструктурные белки, состоит из следующих участков: NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a и NS5b. Белки, синтезированные с зон NS2 (р 23) и NS4 (р10 и р27), предположительно связывают с клеточной мембранной функцией. Белок, кодированный NS4a зоной, — многофункциональный полипротеид. Он обладает стабилизирующей функцией и способствует протеиназной/хеликазной активности белка, кодированного зоной, NS3. Кроме того, он регулирует фосфорелирование белка (р70), кодированного зоной NS5a, который обладает функцией репликазы. Кристаллографический анализ ВГС - хеликазы продемонстрировал наличие трех доменов, необходимых для репликации вируса. Предполагают, что информация, полученная при изучении данных структур, может стать основой изготовления лекарственных препаратов, ингибирующих ВГС- репликацию. Зона NS5b несет информацию о белке (р56), функция которого окончательно не установлена, однако считается, что он представляет собой РНК-зависимую РНК- полимеразу, необходимую для репликации вируса.

На 5' и 3' — концах РНК ВГС расположены нетранслируемые регионы. На 3' конце он состоит приблизительно из 50 нуклеотидов — полипиримидиновый (или полипуриновый) тракт.

Особенностью ВГС является чрезвычайно высокая гетерогенность его генома. Сравнительный анализ РНК изолятов ВГС, вы деленных не только в различных странах или в пределах одного государства, но даже от одного и того же больного на протяжении инфекции, выявил их вариабельность. Отличия в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях определены в участках РНК, кодирующих как структурные, так и неструктурные белки. Вместе с тем установлено, что максимальная гетерогенность генома регистрируется в генах, кодирующих оболочечные белки вируса. Выделяют два гипервариабельных участка РНК ВГС. Первый из них протяженностью в 90 нуклеотидов, расположен на 5' конце Е2 гена (HVR1 - hypervariable region). Второй (HVR2) гипервариабельный участок РНК ВГС (21 нуклеотид) примыкает к 3' концу HVR1. Изучение последовательностей РНК ВГС у больных, чей организм ответил или не ответил на лечение препаратами интерферона, позволил выявить участок РНК в NS5a регионе, возможно отвечающим за резистентность к лечению (interferon-sensitivity determining region - ISDR).

Анализ последовательностей РНК многочисленных изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира, выявил существование основных групп вируса, обозначаемых типами или генотипами (с гомологией нуклеотидных последовательностей в РНК ВГС между ними менее 72%). Идентифицировано, как минимум, шесть основных генотипов вируса гепатита С, обозначаемых римскими цифрами от I до VI (по X. Окомото), или арабскими цифрами от 1 до 6 (по П. Симоне). Кроме того, исследования изолятов ВГС, полученных в Юго-Восточной Азии, позволили дополнительно выявить 5 генотипов (7—11). Сравнительный анализ гомологии РНК ВГС различных генотипов установил наличие более 100 субтипов (уровень гомологии между различными субтипами внутри генотипа - 72-86%). Кроме того, наличие различий в последовательностях в 1-14% определяет существование множественных вариантов вируса или квазивидов вируса. У инфицированного ВГС пациента одновременно могут находиться многие миллионы различных квазивидов ВГС. Их существование объясняют “ускользанием” вируса из-под иммунологического контроля организма, что определяет появление постоянно меняющихся антигенных структур вируса. Происходит постоянное соревнование между образованием новых антигенных вариантов и выработкой антигеннейтрализующих антител. Причем победителем постоянно оказывается вирус, а не иммунная система. Быстрое изменение вируса гепатита С лежит в основе длительного, возможно иногда и пожизненного, носительства ВГС.

Филогенетический анализ РНК ВГС позволил предположить, что разделение ВГС на генотипы могло произойти от 500 до 2000 лет назад, а разделение генотипа 1 на субтипы 1а и 1Ь более 300 лет назад.

При генотипировании ВГС, проведенном в различных регионах мира, установлено, что наибольшее распространение имеют генотипы Ia, Ib, 2a, 2b и За. Они доминируют в Европе, Северной Америке, Азии и Океании. В Европейских странах генотип Ib составляет — 50—91% (Германия—59%, Бельгия—65%, Венгрия—84%, Италия(Сицилия)—91%), а генотип Ia —не более 40% (Германия-32%, Дания-40%, Франция-35%). В США превалирует субтип 1а, который получил даже обозначение как “американский генотип ВГС”. Частота выявления генотипов 1а и Ib в США в среднем составляет 37% и 30% соответственно. Все остальные генотипированные вирусы представлены не более чем в 10%. В Японии, Тайване, Китае (особенно в Южном Китае), Сингапуре, Индонезии и Южной Корее наиболее часто типируют генотип Ib “японский генотип ВГС” (за исключением Филиппин, где частота генотипа 1а достигает-54,5%).

Генотипы 2a и 2b имеют более ограниченное распространение в мире, чем генотипы 1а и Ib , и имеют меньший удельный вес среди генотипов, представленных на данной территории. Наиболее часто 2 генотип представлен в странах Востока. Генотип 3 наиболее распространен в Таиланде (до 50%), Северной Европе (в Великобритании до 25%) и Австралии.

В странах Средней Азии, Северной и Центральной Африке широко представлен 4 генотип ВГС. Так, среди доноров носителей ВГС в Египте он представлен в 30-40%. Генотип 5а часто выявляется среди больных хроническим гепатитом в Южной Африке, а 6 генотип был идентифицирован в Гонконге.

В России доминирует генотип Ib , составляя в различных регионах Северной Евразии - 64,7%, на Дальнем Востоке - 80-83%, а в Центрально-Черноземном и Волго-Вятском регионах России - 50-56%. Генотип Ia наиболее часто типирован в Центральном, Северо-Западном, Волго-Вятском регионах — 11,2— 21,9%, в то время как на территории Восточной Сибири, Центрально-Черноземном районе и Урале его удается выявить крайне редко (до 5%). Генотипы За, 2а и 2Ь среди лиц с наличием ВГС в России также относят к редко выявляемым (За — 5,6—18,9%, 2а и 2b - 4,7-0,5%).

Применение генотипирования ВГС при изучении распространения гепатита С в различных группах населения продемонстрировало некоторые различия в частоте выявления того или иного генотипа в зависимости от пути инфицирования. Так например, в Европейских странах генотип 1а и За ассоциируется с заражением, произошедшим при внутривенном введении наркотиков, а 1Ь при переливании контаминированной ВГС крови или плазмы. В Италии установлено, что среди пациентов с ВИЧ-инфекцией чаще выявляется 1а генотип. Распространение того или иного генотипа ВГС связано с миграцией населения.

Косвенным показателем наличия того или иного генотипа ВГС может служить определение серотипа вируса. Обнаружение типоспецифических В-клеточных эпитопов, кодированных регионами NS4a и NS4b, делает возможным проведение серотипирования. Разработаны лабораторные и коммерческие варианты для серотипирования ВГС методом ИФА. Фирма Мюрекс (Murex Diagnostics, Dartford, UK) представила тест для определения серотипа ВГС с 1 по 6, используя для этого пептиды, кодированные NS4 зоной РНК ВГС. К сожалению, серотипирование не дает возможность разграничить субтипы ВГС (например, 1а и 1b ). При проведении серотипирования анти-ВГС необходимо помнить, что полученный результат может свидетельствовать как о текущей, так и о ранее перенесенной инфекции, вызванной ВГС, без наличия у данного пациента вируса.

Информация о репликации ВГС до сих пор крайне ограничена и в большинстве случаев носит противоречивый характер. Это положение можно объяснить частично крайне низкими концентрациями вируса в организме больных и носителей ВГС, а также отсутствием, до недавнего времени, доступной модели экспериментальной модели гепатита С. Однако исследования, проведенные в России (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского) и в других странах (Канада), позволили разработать доступные экспериментальные модели “in vivo” и “in vitro”. Продемонстрирована способность ВГС вызывать вирусспецифическую гибель новорожденных мышей, инфицированных в мозг. Репродукция ВГС получена в первичных культурах клеток головного мозга мышей-сосунков, а также в культуре клеток почки эмбриона свиньи. Другая модель “in vivo”, созданная в Канаде, основана на имплантации линии клеток гепатомы человека (Huh-7) в печень голых мышей. После заражения Huh-7 клеток ВГС удавалось найти последовательности РНК ВГС в клетках печени и сыворотках крови мышей.

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Калинина Ольга Викторовна

Многие годы вирусный гепатит С (ГС) является одной из наиболее актуальных инфекционных патологий человека. За последнее десятилетие число зарегистрированных больных хроническим гепатитом С в Российской Федерации увеличилось вдвое и достигло 40,9. Согласно современной классификации, вирус гепатита С (ВГС) представлен 6 генотипами и более 200 субтипами. При этом постоянно появляются сообщения о новых, ранее не выявлявшихся вариантах вируса. Основным фактором, обусловливающим генетическое разнообразие ВГС, является высокая частота мутирования. Рекомбинацию как механизм, участвующий в формировании генетического разнообразия вида, долгое время не принимали во внимание, полагая, что возможные природные рекомбинанты ВГС нежизнеспособны. В 2002 г. в Санкт-Петербурге впервые в мире был выявлен природный межгенотипный рекомбинант ВГС RF1_2k/1b с абсолютно новыми фенотипическими характеристиками: его структурные гены принадлежат к субтипу 2k, а неструктурные к субтипу 1b. С тех пор начались широкие исследования, посвященные поиску природных рекомбинантов ВГС. В данном обзоре представлены имеющиеся к настоящему времени сведения об организации генома вируса гепатита С и генома природного межгенотипного рекомбинанта ВГС RF1_2k/1b, а также сведения о его географическом распространении

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Калинина Ольга Викторовна

For many years, the viral hepatitis C is considered as one of the most actual infectious pathologies of human. During the last decade the number of registered cases of chronic viral hepatitis C in Russia increased two times and reached 40.9. According to the current virological classification, hepatitis C virus (HCV) is differentiated into 6 genotypes and more than 200 subtypes. At the same time, increasing number of publications report about novel genetic variants of HCV. A high mutation rate is considered to be a major factor behind HCV genetic diversity. Recombination as another mechanism for creating genetic variation was not recognized as important factor for generating the HCV diversity. For a long time it was believed that the natural recombinants of hepatitis C virus were not viable. The first inter-genotype HCV recombinant RF1_2k/1b was identified in 2002 in Saint-Petersburg. The structural genes of the recombinant strain were similar to those of the HCV subtype 2k, while its nonstructural genes (except for the part of the NS2 gene) belonged to the HCV subtype 1b. Since that time, many studies were initiated to indentify natural HCV recombinants. This review presents current data regarding the genomic organization of HCV and its natural inter-genotype recombinant RF1_2k/1b as well as information about circulation of this recombinant in the world.

Инфекция и иммунитет 2012, Т. 2, № 4, с. 677-686

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА И ГЕОГРАФИЯ ПРИРОДНОГО МЕЖГЕНОТИПНОГО РЕКОМБИНАНТА ВИРУСА ГЕПАТИТА С RF1_2k/1b

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург

Резюме. Многие годы вирусный гепатит С (ГС) является одной из наиболее актуальных инфекционных патологий человека. За последнее десятилетие число зарегистрированных больных хроническим гепатитом С в Российской Федерации увеличилось вдвое и достигло 40,9%еоо. Согласно современной классификации, вирус гепатита С (ВГС) представлен 6 генотипами и более 200 субтипами. При этом постоянно появляются сообщения о новых, ранее не выявлявшихся вариантах вируса. Основным фактором, обусловливающим генетическое разнообразие ВГС, является высокая частота мутирования. Рекомбинацию как механизм, участвующий в формировании генетического разнообразия вида, долгое время не принимали во внимание, полагая, что возможные природные рекомбинанты ВГС нежизнеспособны. В 2002 г. в Санкт-Петербурге впервые в мире был выявлен природный межгенотипный рекомбинант ВГС RF1_2k/1b с абсолютно новыми фенотипическими характеристиками: его структурные гены принадлежат к субтипу 2^ а неструктурные — к субтипу 1Ь. С тех пор начались широкие исследования, посвященные поиску природных рекомбинантов ВГС. В данном обзоре представлены имеющиеся к настоящему времени сведения об организации генома вируса гепатита С и генома природного межгено-типного рекомбинанта ВГС RF1_2k/1b, а также сведения о его географическом распространении.

Ключевые слова: природный рекомбинант ВГС RF1_2k/1b, организация генома, география распространения.

GENOME ORGANIZATION AND GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION OF THE NATURAL INTERGENOTYPIC RECOMBINANT OF HEPATITIS C VIRUS RF1_2k/1b Kalinina O.V.

Abstract. For many years, the viral hepatitis C is considered as one of the most actual infectious pathologies of human. During the last decade the number of registered cases of chronic viral hepatitis C in Russia increased two times and reached 40.9%oco. According to the current virological classification, hepatitis C virus (HCV) is differentiated into 6 genotypes and more than 200 subtypes. At the same time, increasing number of publications report about novel genetic variants of HCV. A high mutation rate is considered to be a major factor behind HCV genetic diversity. Recombination as another mechanism for creating genetic variation was not recognized as important factor for generating the HCV diversity. For a long time it was believed that the natural recombinants of hepatitis C virus were not viable. The first inter-genotype HCV recombinant RF1_2k/1b was identified in 2002 in Saint-Petersburg. The structural genes of the recombinant strain were similar to those of the HCV subtype 2k, while its nonstructural genes (except for the part of the NS2 gene) belonged to the HCV subtype 1b. Since that time, many studies were initiated to indentify natural HCV recombinants. This review presents current data regarding the genomic organization of HCV and its natural inter-genotype recombinant RF1_2k/1b as well as information about circulation of this recombinant in the world. (Infekc. immun., 2012, vol. 2, N 4, p. 677—686)

Key words: HCV natural recombinant RF12k/1b, genome organization, geographical distribution.

поступила в редакцию 10.06.2012 отправлена на доработку 13.06.2012 принята к печати 21.08.2012

Адрес для переписки:

Калинина Ольга Викторовна, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИЭМ имени Пастера

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, ФБУН НИИЭМ имени Пастера. Тел./факс: (812) 233-21-49.

Уже более 20 лет вирусный гепатит С (ГС) занимает одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека, что обусловлено частыми неблагоприятными исходами инфекции с развитием хронического гепатита, цирроза печени и гепатокарциномы. Согласно расчетным данным ВОЗ, во всем мире вирусным гепатитом инфицировано не менее 3% населения. Начиная с 2000 г., число зарегистрированных больных хроническим гепатитом С в Российской Федерации увеличилось вдвое и достигло 40,9 случаев на 100 000 населения [1].

Рекомбинацию как другой механизм, участвующий в формировании генетического разнообразия вида, долгое время не принимали во внимание, полагая, что возможные природные рекомбинанты ВГС нежизнеспособны [37, 45], тогда как именно генетическая рекомбинация играет наиболее значительную роль в эволюции вирусов, приводя к созданию генетических вариантов, с абсолютно новыми

фенотипическими характеристиками, и как следствие, к возникновению новых тяжелых инфекционных болезней.

В 2002 г. в Санкт-Петербурге впервые в мире был идентифицирован природный рекомбинант ВГС, названный RF1_2k/1b [11], после чего во всем мире начались широкие исследования, посвященные поиску природных рекомбинантов ВГС. К настоящему времени выявлено еще пять вариантов межгенотипных рекомбинантов ВГС: 2i/6p (Вьетнам), 2b/1b (Филиппины), 2/5 (Франция), 2b/6w (Тайвань), 2b/1a (США) [19, 20, 29, 47], каждый из которых представлен пока единичным изолятом. Однако широкое распространение получил только природный рекомбинант RF1_2k/1b, который начиная с 2005 г. официально внесен в классификацию ВГС, как RF 01_1b/2k (рекомбинантная форма), а с 2009 как CRF 01_1b/2k (циркулирующая ре-

комбинантная форма) [17, 38].

В данном обзоре представлены имеющиеся к настоящему времени сведения об организации генома ВГС и генома природного межге-нотипного рекомбинанта ВГС RF1_2k/1b, сведения о филогеографии выявленных изолятов этого рекомбинанта.

Организация генома и белки ВГС

Геном ВГС представлен (+)-цепью РНК длиной около 9600 нуклеотидов. Открытая рамка считывания (ORF) кодирует полипротеин, состоящий из 3011—3033 аминокислотных остатков согласно опубликованным последовательностям [3, 21, 30, 42]. На 5’-конце (5’UTR) ORF ограничена нетранслируемой высококонсервативной последовательностью длиной 341 нуклеотид, которая включает внутренний сайт связывания рибосомы IRES [39]. Гомология 5’UTR области внутри одного генотипа колеблется между 92—98%, тогда как между изолятами внутри субтипа достигает 98—99%. Поэтому данный район используется в лабораторной диагностике для определения РНК ВГС в клинических образцах. На 3’-конце (3’UTR) ORF находится нетранслируемая последовательность, состоящая из вариабельного участка длиной около 40 нуклеотидов, за которым следует polyU область (27—45 нуклеотидов), далее Х-РНК (98 нуклеотидов), который принимает участие в инициации репликации вирусного генома [16, 42].

Полипротеин в результате ко- и посттран-сляционного процессинга расщепляется вирусными и клеточными протеазами на структурные и неструктурные вирусные белки (рис. 1).

Первая треть генома кодирует структурные белки: капсидный белок (core) и два гликопро-теиновых белка оболочки (Е1 и Е2). Капсидный белок (21—23 kDa) участвует в морфогенезе вируса, способен взаимодействовать с различными регуляторными белками клетки [22, 33, 34].

Core E1 E2 p7 NS2 NS3 4A 4B NS5A NS5B

Рисунок 1. Организация генома вируса гепатита С (по B.D. Lindenbach и C.M. Rice, 2005)

Структурные гены (Structural) показаны темным прямоугольником, неструктурные гены (Nonstructural) - светлым. Альтернативная рамка считывания, кодирующая белок F, указана небольшим темным прямоугольником, расположенным над открытой рамкой считывания. Сайты расщепления полипротеина клеточной сигнальной пептидазой указаны темными кругами, клеточной сигнальной пептид пептидазой - светлым кругом. Стрелками отмечены сайты расщепления полипротеина вирусными протеазами. Название и функции белков полипротеина приведены в тексте.

Полагают, что он играет роль в развитие первичного рака печени у больных хроническим гепатитом С (ХГС) [22, 35]. Нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидный белок, также характеризуются высокой гомологией выше 81% внутри одного генотипа, благодаря чему область 5’UTR/core генома используется для генотипирования изолятов ВГС в лабораторной диагностике [31].

Гликопротеины Е1 (31 kDa) и Е2 (70 kDa) являются трансмембранными белками, основная их функция — связывание и проникновение вириона в клетку [4, 24]. Область генома, кодирующая гликопротеины Е1 и Е2, наиболее вариабельна. На N-конце Е2 находится гипер-вариабельный район (HVR1), высокая гетерогенность которого наблюдается даже между изолятами, выделенными от одного пациента в различные периоды заболевания [15]. Мутации в HVR1 способствуют формированию квазивидов и персистенции вируса. Кроме того, в экспериментах in vitro было показано, что гликопротеин Е2 изолятов ВГС субтипа 1b, имеет консервативный участок, состоящий из 12 аминокислотных остатков (названный PePHD домен), идентичный участку фосфорилирования в рибосомальном факторе инициации транскрипции (eIF2a), который может взаимодействовать с протеинкиназой R (PKR), ингибируя ее фосфолирирующую активность. Таким образом, Е2 может участвовать в формировании резистентности вируса к интерферону [43].

Недавно несколькими группами исследователей был описан новый белок (17 kDa) ВГС (названный F или core+1/ARFP белок), образующийся в результате —2/+1 сдвига рибосо-мальной рамки считывания или начала синтеза с внутреннего инициирующего кодона (AUG85 или AUG87), расположенного в гене, кодирующем капсидный белок С [44, 46]. До сих пор белок F не обнаружен ни в образцах сыворотки крови, ни в биоптатах пациентов, инфицированных ВГС, тогда как антитела к этому белку выявляются у некоторых больных ХГС [2, 46].

Предполагается, что белок F играет роль в вирусном морфогенезе и патогенезе инфекции.

Между структурными и неструктурными белками располагается небольшой белок р7, обладающий способностью образовывать ионные каналы в липидных мембранах [26].

Две трети генома ВГС кодируют неструктурные белки: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Белок NS2 (23 kDa) и аминоконцевой домен белка NS3 образуют цинк-зависимую ме-таллоавтопротеазу, которая обеспечивает про-теолитический процессинг NS2 и NS3 между 1026/1027 аминокислотными остатками [8, 9]. Гистидин в позиции 952 и цистеин в позиции 993 необходимы для каталической активности этого энзима [9]. Белок NS3 (70 kDa) — многофункциональный белок: N-концевой домен является сериновой протеазой, С-концевой домен — хеликазой и обладает нуклеозидтрифос-фатазной/РНК-хеликазной активностью [7]. Белок NS4A (8 kDa) играет роль кофактора се-риновой протеазы NS3, существенно повышая ее эффективность [32]. Комплекс NS3-NS4A влияет на клеточную защиту, ингибируя RIG-1 и TLR3 сигнальные пути активации интерферона, а также на ряд других клеточных функций [7, 25]. Функция белка NS4B (27 kDa) изучена недостаточно. Показано, что он оказывает влияние на репликацию ВГС; может связываться с некоторыми белками Ras семейства, обуславливающих трансформацию клетки; снижать экспрессию эндогенного интерферона I типа [23]. Белок NS5A (56 или 58 kDa) входит в состав реплика-ционного комплекса ВГС [4]. В данном белке имеется PKR-связывающий домен, в составе которого присутствует аминокислотная последовательность ISDR (IFNa sensitivity determining region), мутации в которой, как было показано в ряде исследований, влияют на чувствительность к терапии интерфероном-a в случае инфицирования пациентов ВГС субтипа 1b [6]. Белок NS5B (68 kDa) кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса, которая способна катализировать синтез РНК как по праймер-зависимому,

так и праймер-независимому механизму [21]. Нуклеотидные последовательности N85 области генома характеризуются вариабельностью аналогичной таковой полноразмерного генома ВГС (69% внутри одного генотипа), что позволяет использовать нуклеотидные фрагменты этой области при построении филогенетических деревьев не только для генотипирования, но и для установления генетических взаимоотношений между изолятами [17, 38].

Организация генома и белки природного рекомбинанта ВГС ЯР1_2к/1Ь

Геном природного рекомбинанта ЯБ1_2к/1Ь кодирует полипропротеин размером 3014 аминокислотных остатков со стандартным для ВГС порядком расположения белков: С 191 аа, Е1 192 аа, Е2-ИУЯ 367 аа, р7 63 аа, N82 217 аа, N83 631 аа, №4А 54 аа, №5В 261 аа, №5А 447 аа, N85B 591 аа (табл. 1) [13]. На 5’- и 3’-концах генома, также как и у нерекомбинантных изолятов, имеются нетранслируемые участки. Никаких инсерций или делеций на протяжении всего генома рекомбинантного изолята, включая область рекомбинации и нетранслируемые участки, не обнаружено. Анализ мозаичности полноразмерного генома рекомбинанта ВГС выявил единственный сайт рекомбинации в пределах N82 области генома. Несмотря на высокую схожесть нуклеотидных и аминокислотных последовательностей на этом участке генома, характерную для всех генотипов ВГС, сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей рекомбинантных изолятов с таковыми референсных изолятов к1-б2 субтипа 1Ь и УАТ-96 субтипа 2к позволило маркировать точку рекомбинации в кодоне Уаі/Ііе (949), расположенном сразу перед консервативным сай-

том, состоящим из четырех аминокислотных остатков Tyr-Asp/Asn-His-Leu (950—953), включая гистидин (His952), ассоциированный с энзиматической активностью NS2-NS3 протеазы [11]. Области генома рекомбинантного изолята N687 от 5’-UTR до рекомбинационного сайта внутри NS2 гена схожи с аналогичными областями генома изолята субтипа 2k, тогда как области генома от сайта рекомбинации до 3’-кон-ца генома подобны субтипу 1b (рис. 2).

Гликопротеин Е2 (367 аа) рекомбинантного изолята и изолятов субтипа 2а и 2k длиннее на четыре аминокислотных остатка, чем аналогичный белок (363 аа) изолятов субтипа 1b. При этом аминокислотный состав PePHD домена, расположенного внутри гена Е2 (участок гомологии сайта фосфорилирования PKR-eIF2a), рекомбинантного изолята N687 полностью идентичен таковому изолятов субтипов 2а и 2k, и отличается по двум (E652Q и L668H) из 12 позиций от аминокислотной последовательности PePHD домена изолятов субтипа 1b. Соответственно, PePHD домен природного рекомбинанта ВГС не имеет сродства к PKR и, следовательно, не может участвовать в формировании резистентности ВГС к интерферону.

ТАБЛИЦА 1. КОЛИЧЕСТВО АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ БЕЛКОВ, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГЕНОТИПА ИЗОЛЯТА ВГС

Область генома Количество аминокислотных остатков

Субтип 2а (HC-J6*) Субтип 2k (VAT-96) RF1_2k/1b (N687) Субтип 1b (k1-s2) Субтип 1b(N589)

Полный текст:

Резюме. Многие годы вирусный гепатит С (ГС) является одной из наиболее актуальных инфекционных патологий человека. За последнее десятилетие число зарегистрированных больных хроническим гепатитом С в Российской Федерации увеличилось вдвое и достигло 40,9‰. Согласно современной классификации, вирус гепатита С (ВГС) представлен 6 генотипами и более 200 субтипами. При этом постоянно появляются сообщения о новых, ранее не выявлявшихся вариантах вируса. Основным фактором, обусловливающим генетическое разнообразие ВГС, является высокая частота мутирования. Рекомбинацию как механизм, участвующий в формировании генетического разнообразия вида, долгое время не принимали во внимание, полагая, что возможные природные рекомбинанты ВГС нежизнеспособны. В 2002 г. в Санкт-Петербурге впервые в мире был выявлен природный межгенотипный рекомбинант ВГС RF1_2k/1b с абсолютно новыми фенотипическими характеристиками: его структурные гены принадлежат к субтипу 2k, а неструктурные — к субтипу 1b. С тех пор начались широкие исследования, посвященные поиску природных рекомбинантов ВГС. В данном обзоре представлены имеющиеся к настоящему времени сведения об организации генома вируса гепатита С и генома природного межгенотипного рекомбинанта ВГС RF1_2k/1b, а также сведения о его географическом распространении.

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

1. Вирусные гепатиты в Российской Федерации: Справочник / Под ред. Онищенко Г.Г., Жебруна А.Б. — СПб: НИИЭМ им. Пастера, 2010. — 204 с.

2. Budkowska A., Kakkanas A., Nerrienet E., Kalinina O., Maillard P., Horm S.V., Dalagiorgou G., Vassilaki N., Georgopoulou U., Martinot M., Sall A.A., Mavromara P. Synonymous mutations in the core gene are linked to unusual serological profile in hepatitis C virus infection // PLoS One. — 2011. — Vol. 6, N 1. — P. 1–12.

3. Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina-Selby R., Barr P.J. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1991. — Vol. 88, N 6. — P. 2451–2455.

4. De Francesco R. Molecular virology of the hepatitis C virus // J. Hepatolol. — 1999. — Vol. 31, Suppl. 1. — P. 47–53.

5. Demetriou V.L., Kyriakou E., Kostrikis L.G. Nearfull genome characterization of two natural intergenotypic 2k/1b recombinant hepatitis C virus isolates // Advances in Virology. — 2011. — Vol. 2011. — P. 1–7.

6. Enomoto N., Sakuma I., Asahina Y., Kurosaki M., Murakami T., Yamamoto C., Ogura Y., Izumi N., Marumo F., Sato C. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis C virus 1b infection // New Eng. J. Med. — 1996. — Vol. 334. — P. 77–81.

7. Gale M.Jr, Foy E.M. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus // Nature. — 2005. — Vol. 436. — P. 939–945.

8. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M., Rice C.M. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products // J. Virol. — 1993. — Vol. 67, N 3. — P. 1385–1395.

9. Hijikata M., Kato N., Ootsuyama Y., Nakagawa M., Shimotohno K. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1991. — Vol. 88, N 13. — P. 5547–5551.

10. Kalinina O., Norder H., Vetrov T., Zhdanov K., Barzunova M., Plotnikova V., Mukomolov S., Magnius L. Shift in predominating subtype of HCV from 1b to 3a in St. Petersburg mediated by increase in injecting drug use // J. Med. Virol. — 2001. — Vol. 65. — P. 517–524.

11. Kalinina O., Norder H., Mukomolov S., Magnius L. A natural intergenotypic recombinant of hepatitis C virus identified in St. Petersburg // J. Virol. — 2002. — Vol. 76. — P. 4034–4043.

12. Kalinina O., Norder H., Thcakharian V., Zhdanov K., Kislii P., Vetrov T., Mukomolov S., Magnius L. More recombinant HCV strains recovered in St. Petersburg // 9th International Meeting on HCV and Related Viruses. — San-Diego, USA, 2002. — P. 225.

13. Kalinina O., Norder H., Magnius L. Full-length open reading frame of a recombinant hepatitis C virus strain from St. Petersburg: proposed mechanism for its formation // J. Gen. Virol. — 2004. — Vol. 85. — P. 1853–1857.

14. Kalinina O., Jern C., Tallo T., Thcakharian V., Gusev D., Znoiko O., Isaguliants M., Mukomolov S., Norder H., Magnius L. Spread of the natural hepatitis C virus recombinant outside Russia // 12th International symposium on viral hepatitis and liver disease. — Paris, 2006. — P. 189.

15. Kato N., Ootsuyama Y., Ohkoshi S., Nakazawa T., Sekiya H., Hijikata M., Shimotohno K. Characterization of hypervariable regions in the putative envelope protein of hepatitis C virus // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1992. — Vol. 189, N 1. — P. 119–127.

16. Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M. Identification of a highly conserved sequence element at the 3’ terminus of hepatitis C virus genome RNA // J. Virol. — 1996. — Vol. 70, N 6. — P. 3363–3371.

17. Kuiken C., Simmonds P. Nomenclature and numbering of the hepatitis C virus // Methods Mol. Biol. — 2009. — Vol. 510, Hepatitis C, part II. — P. 33–53.

18. Kurbanov F., Tanaka Y., Chub E., Maruyama I., Azlarova A., Kamitsukasa H., Ohno T., Bonetto S., Moreau I., Fanning L.J., Legrand-Abravanel F., Izopet J., Naoumov N., Shimada T., Netesov S., Mizokami M. Molecular epidemiology and interferon susceptibility of the natural recombinant hepatitis C virus strain RF1_2k/1b // J. Infect. Dis. — 2008. — Vol. 198, N 10. — P. 1448–1456.

19. Lee Y.M., Lin H.J., Chen Y.J., Lee C.M., Wang S.F., Chang K.Y., Chen T.L., Liu H.F., Chen Y.M. Molecular epidemiology of HCV genotypes among injection drug users in Taiwan: Full-length sequences of two new subtype 6w strains and a recombinant form_2b/6w // J. Med. Virol. — 2009. — Vol. 82. — P. 57–68.

20. Legrand-Abravanel F., Claudinon J., Nicot F., Dubois M., Chapuy-Regaud S., Sandres-Saune K., Pasquier C., Izopet J. New natural intergenotypic (2/5) recombinant of hepatitis C virus // J. Virol. — 2007. — Vol. 81, N 8. — P. 4357–4362.

21. Lindenbach B.D., Rice C.M. Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function // Nature. — 2005. — Vol. 436. — P. 933–938.

22. Lu W., Lo S.Y., Chen M., Wu K., Fung Y.K., Ou J.H. Activation of p53 tumor suppressor by hepatitis C virus core protein // Virology. — 1999. — Vol. 264. — P. 134 –141.

23. Macdonald A., Crowder K., Street A., McCormick C., Saksela K., Harris M. The hepatitis C virus nonstructural NS5A protein inhibits activating protein-1 function by perturbing ras-ERK pathway signaling // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278, N 20. — P. 17775–17784.

24. Matsuura Y., Harada T., Makimura M., Sato M., Aizaki H., Suzuki T., Miyamura T. Characterization of HCV structural proteins expressed in various animal cells // Intervirology. — 1994. — Vol. 37, N 2. — P. 114–118.

25. Melyan E., Curran J., Hofmann K., Moradpour D., Binder M., Bartenschlager R., Tschopp J. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and istargeted by hepatitis C virus // Nature. — 2005. — Vol. 437. — P. 1167–1172.

26. Mizushima H., Hijikata M., Tanji Y., Kimura K., Shimotohno K. Analysis of N-terminal processing of hepatitis C virus nonstructural protein 2 // J. Virol. — 1994. — Vol. 68, N 4. — P. 2731–2734.

27. Moreau I., Hegarty S., Levis J., Sheehy P., Crosbie O., Kenny-Walsh E., Fanning L.J. Serendipitous identification of natural intergenotypic recombinants of hepatitis C in Ireland // Virol J. — 2006. — Vol. 3. — P. 1–7.

28. Morel V., Descamps V., Franois C., Fournier C., Brochot E., Capron D., Duverlie G., Castelain S. Emergence of a genomic variant of the recombinant 2k/1b strain during a mixed hepatitis C infection: a case report // J. Clin. Virol. — 2010. — Vol. 47. — P. 382–386.

29. Noppornpanth S., Lien T.X., Poovorawan Y., Smits S.L., Osterhaus A.D., Haagmans B.L. Identification of a naturally occurring recombinant genotype 2/6 hepatitis C virus // J. Virol. — 2006. —Vol 80, N 15. — P. 7569–7577.

30. Okamoto H., Mishiro S. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus // Intervirology. — 1994. — Vol. 37, N 2. — P. 68–76.

31. Okamoto H., Kobata S., Tokita H., Inoue T., Woodfield G.D., Holland P.V., Al-Knawy B.A., Uzunalimoglu O., Miyakawa Y.,Mayumi M. A second-generation method of genotyping hepatitis C virus by the polymerase chain reaction with sense and antisense primers deduced from the core gene // J. Virol. Methods. — 1996. — Vol. 57, N 1. — P. 31–45.

32. Raghwani J., Thomas X.V., Koekkoek S.M., Schinkel J., Molenkamp R., Thijs J. van de Laar, Takebe Y., Tanaka Y., Mizokami M., Rambaut A., Pybus O.G. Origin and Evolution of the unique hepatitis C virus circulating recombinantform 2k/1b // J. Virol. — 2012. — Vol. 86, N 4. — P. 2211–2220.

33. Roohvand F., Maillard P., Lavergne J.P., Boulant S., Walic M., Andréo U., Goueslain L., Helle F., Mallet A., McLauchlan J., Budkowska A. Initiation of hepatitis C virus infection requires the dynamic microtubule network: role of the viral nucleocapsid protein // J. Biol. Chem. — 2009. — Vol. 284, N 20. — P. 13778–13791.

34. Santolini E., Migliaccio G., La M.N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis C virus core protein // J. Virol. — 1994. — Vol. 68, N 6. — P. 3631–3641.

35. Schwer B., Ren S., Pietschmann T. Kartenbeck J., Kaehlcke K., Bartenschlager R., Yen T.S., Ott M. Targeting of hepatitis C virus core protein to mitochondria through a novel C-terminal localization motif // J. Virol. — 2004. — Vol. 78. — P. 7958–7568.

36. Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F., Irvine B., Beall E., Yap P.L., Kolberg J., Urdea M.S. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region // J.Gen.Virol. — 1993. — Vol. 74, N 11. — P. 2391–2399.

37. Simmonds P. Viral heterogeneity of the hepatitis C virus // J. Hepatol. — 1999. — Vol. 31, Suppl. 1. — P. 54 – 60.

38. Simmonds P., Bukh J., Combet Ch., Delґeage G., Enomoto N., Feinstone S., Halfon Ph., Inchauspґe G., Kuiken C., Maertens G., Mizokami M., Murphy D.G., Okamoto H., Pawlotsky J.-M., Penin F., Sablon E., Shin T., Stuyver L.J., Thiel H.J., Viazov S., Weiner A.J., Widell A. Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes // Hepatology. — 2005. — Vol. 42, N 4. — P. 962–973.

39. Spahn C.M., Kieft J.S., Grassucci R.A., Penczek P.A., Zhou K., Doudna J.A., Frank J. Hepatitis C virus IRES RNA-induced changes in the conformation of the 40s ribosomal subunit // Science. — 2001. — Vol. 291. — P. 1959 –1962.

40. Tallo T., Norder H., Tefanova V., Krispin T., Schmidt J., Ilmoja M., Orgulas K., Pruunsild K., Priimagi L., Magnius L. Genetic characterization of hepatitis C virus strains in Estonia: fluctuations in the predominating subtype with time // J. Med. Virol. — 2007. — Vol. 79, N 4. — P. 374–382.

41. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. — 2011. — Vol. 28. — P. 2731–2739.

42. Tanaka T., Kato N., Cho M.J., Sugiyama K., Shimotohno K. Structure of the 3’ terminus of the hepatitis C virus genome // J. Virol. — 1996. — Vol. 70, N 5. — P. 3307–3312.

43. Taylor D.R., Shi S.T., Romano G.N., Lai M.M. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein // Science. — 1999. — Vol. 285. — P. 107–110.

44. Vassilaki N., Mavromara P. Two alternative translation mechanisms areresponsible for the expression of the HCV ARFP/F/core+1 coding openreading frame // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278. — P. 40503–40513.

45. Viazov S., Widell A., Nordenfelt E. Mixed infection with two types of hepatitis C virus is probably a rare event // Infection. — 2000. — Vol.28, N 1. — P. 21–25.

46. Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., Branch A.D. Evidence for a new hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame // RNA. — 2001. — Vol. 7. — P. 710–721.

47. Yamamura J., Ichimura H. A natural intergenotypic (2b/1b) recombinant of hepatitis C virus in the Philippines // J. Med. Virol. — 2006. — Vol. 78. — P. 1423–1428.

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.