Оптическая плотность образца гепатит

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2010, том 4(13), № 2, с. 173-181

КОНЦЕНТРАЦИЯ АФП В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С НЕОПРЕДЕЛЕННЫМ РЕЗУЛЬТАТОМ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

Кожно-венерологический клинический диспансер № 1ДЗ, Москва, Россия;

ГОУВПОРоссийский государственный медицинский университет Росздрава,

Поступила: 23.03.2010. Принята: 13.04.2010

Ключевые слова: ВГС-инфекция, концентрация АФП, анти-ВГС антитела

Проблема своевременного распознавания вирусного гепатита С (ГС) —широко распространенного заболевания [1], прогрессирова-ние которого приводит к формированию цирроза печени и развитию гепатоцелюллярной карциномы (ГЦК), — вызвана как длительным отсутствием клинических признаков болезни, так и определенными проблемами лабораторной диагностики. В частности, выявление РНК вируса гепатита С (ВГС) имеет временные ограничения вследствие персистирую-щего характера виремии [2]. Основным критерием диагностики ГС в общей клинической практике являются маркеры специфического иммунного ответа — антитела к ВГС (анти-

Адрес: 630004, г. Москва, Ленинский пр., 17 КВКД № 1 ДЗ. E-mail: aapotapova@mail.ru

ВГС). Этот показатель инфицирования человека особенно надежен при выявлении в им-муноферментном анализе (ИФА) антител к нескольким антигенам ВГС с высокой оптической плотностью (ОП) [3]. Исследование так называемых низкопозитивных образцов (с низкой ОП в первичном скрининге) в подтверждающих планшетных иммуноферментных тест-системах (плИФТС) различных производителей и/или в плИФТС с разным спектром определяемых антител довольно часто приводит к противоречивым результатам [4 — 6]. Кроме того, в литературе имеются сведения о том, что иммуноблоты (ИБ) для исследования анти-ВГС (так же, как ИБ для исследования антител к другим инфекциям) отличаются от плИФТС меньшей чувствительностью [7]. При внедрении ИБ в практику лабораторий, которые проводят массовый скрининг сыворотки крови на наличие анти-ВГС (при

практически полном отсутствии сведений о пациентах), возникает необходимость критического сопоставления результатов, полученных в различных плИФТС и различных ИБ. Использование для решения этой задачи панелей образцов сыворотки, выпускаемых самими производителями диагностических систем, по-видимому, не во всех случаях способно обеспечить объективную оценку полученных данных.

В большинстве случаев течение заболевания, вызванного ВГС, сопровождается биохимическими признаками некроза печеночных клеток. В немногочисленных работах была исследована возможность дополнительного использования сывороточных маркеров, ассоциированных с вирусным заболеванием печени, для более точной лабораторной диагностики инфекции. В частности, было показано, что ВГС-инфекция на ранней стадии может быть выявлена по повышению сывороточного уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) прежде, чем количество анти-ВГС в крови станет достаточным для определения методом ИФА [8]. В динамике наблюдения за больными, инфицированными ВГС, было показано, что с патофизиологическими процессами в печени при ГС и его осложнениях коррелирует сывороточная концентрация а-фето-протеина (АФП), исследование которого имеет наиболее важное значение для выявления малигнизации клеток печени при гепатоцел-люлярной карциноме (ГЦК) [9]. Сведений об изменении концентрации АФП в сыворотке крови с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в доступной нам литературе не обнаружено.

Цель представленной работы — сопоставление концентрации АФП в образцах сыворотки крови мужчин с позитивным, неопределенным и негативным результатом определения анти-ВГС в ИБ, при неопределенном результате исследования всех проб в подтверждающих планшетных иммунофер-ментных тест-системах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Результаты были получены при исследовании образцов сыворотки крови мужчин в возрасте от 17 до 60 лет, направленных на исследование наличия маркеров вирусного гепатита С в клинико-иммунологическую лабораторию по диагностике ВИЧ-инфекции КВКД № 1 Департамента здравоохранения г. Москвы, в которой проводится массовый

скрининг крови на наличие маркеров вирусных гепатитов В и С. Обследование назначалось по общим показаниям, пациенты не относились к контингентам с высоким риском заражения ВГС.

Расчеты по определению критической оптической плотности (ОПкр) производились в автоматическом режиме во время регистрации результатов анализа. Значение коэффициента позитивности (КП) рассчитывали по отношению величины ОП исследуемого образца к величине ОПкр..

После исследований образцов сыворотки крови мужчин в возрасте от 17 до 60 лет на наличие анти-ВГС в плИФТС были выделены следующие группы: 1) образцы, не содержащие анти-ВГС в первичном скрининге (Ан-ти-ВГС-), 2) образцы, содержащие анти-ВГС с высоким КП в первичном скрининге и в подтверждающих исследованиях в плИФТС с раздельным определением анти-Core и анти-NS ВГС (Анти-ВГС+ ), 3) образцы с низким КП в первичном скрининге и с неопределенным результатом исследования в плИФТС с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-№4, анти-№5 ВГС (Анти-ВГС но).

В группе Анти-ВГС- средняя величина концентрации АФП составляла 4,37 ± 2,71 МЕ/мл (рис.), (min 1,07 МЕ/мл, max 13,04 МЕ/мл) или 5,46 ± 3,39 нг/мл.

Группа Анти-ВГС+ включала образцы, в которых в каждой из использованных плИФТС анти-ВГС обнаруживались с высокой ОП; соответственно величина КП каждого образца позволяла интерпретировать его как ан-ти-ВГС-содержащий. А именно, в первичном скрининге КП образцов в данной группе в среднем составлял12,58 ± 3,42 (min 5,5; max18). В подтверждении из 20 образцов 19 содержали анти-Core и анти-NS ВГС (КП > 10), один образец — только анти-Core (КП = 4,36). В группе анти-ВГС+ образцов средняя концентрация АФП была равна 12,64 МЕ/мл (рис.) или 15,8 нг/мл (min 2,28 МЕ/мл, max 96,05 МЕ/мл; v = 20,44 МЕ/мл).

Анти-ВГС- Анти-ВГС Анти-ВГС Анти-ВГС+ но/ИБ- но/ИБ негруппы

Рис. Концентрация АФП в группах образцов сыворотки крови с различным результатом исследования анти-ВГС

По оси абсцисс — группы образцов сыворотки крови:

Анти-ВГС- — не содержат анти-ВГС; Анти-ВГСно/ИБ- — с

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

ДРОНОВА В.М., КИРДЯШКИНА Н.П., КОВАЛЬЧУК Л.В., МАРКЕЛОВ М.Л., ПОТАПОВА А.А., ПОТЕКАЕВ Н.Н., ПУДОВА Е.А., ЧЕКАНОВА Т.А., ШИПУЛИН Г.А. — 2012 г.

АФАНАСЬЕВА Г.В., БЕЛЕЦКИЙ И.П., ГЛУХОВ А.С., ГЛУХОВА К.А., ЗАРИПОВ М.М., ПРУСАКОВА О.В., ТРИЗНА Ю.А. — 2015 г.

БУРКОВ А.Н., КУЩ А.А., ЛЕСНОВА Е.И., МАСАЛОВА О.В., ТУНИЦКАЯ В.Л., УЛАНОВА Т.И., ШИНГАРОВА Л.Н. — 2012 г.

РЕКОСЛАВСКАЯ Н.И., САЛЯЕВ Р.К., СТОЛБИКОВ А.С., ТРЕТЬЯКОВА А.В. — 2012 г.

Выявление антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в крови пациентов методом иммуноферметного анализа (ИФА), которое является первым шагом лабораторной диагностики ВГС-инфекции, наиболее эффективно при обследовании людей без иммунодефицитного состояния в фазу развернутой продукции антител. На раннем этапе заражения ВГС и после выздоровления [8], а также при патологических и физиологических, в частности, возрастных, иммунодефицитных состояниях результаты исследования анти-ВГС в ИФА могут быть позитивными, но с низкой оптической плотностью, или противоречивыми [6]. В то же время вследствие широкого распространения и социальной значимости ВГС-инфекции необходимость в правильной интерпретации результатов исследования возникает уже на этапе первичного скрининга. Развитие гепатита С сопровождается определенными биохимическими изменениями сыворотки крови, в частности, увеличением концентрации аланинаминотрансферазы и α-фетопротеина (АФП) [3, 9]. Некоторые из биохимических маркеров повреждения печени могут быть обнаружены в сыворотке крови с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в иммуноблоте [5]. В РФ в качестве подтверждающих тест-систем используются не только иммуноблоты, но и тест-системы для ИФА (ИФТС) в планшетном формате с раздельным определением антител к ряду антигенов ВГС. Относительно биохимической характеристики сыворотки крови с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в планшетных ИФТС в литературе имеются единичные данные [5].

Целью представленной работы было определение концентрации α-фетопротеина в сыворотке крови пациентов пожилого возраста с различным, в том числе неопределенным, результатом исследования анти-ВГС в подтверждающих тест-системах планшетного формата с раздельным определением антител к антигенам ВГС.

Материалы и методы

Результаты были получены при исследовании 82 образцов сыворотки крови пожилых людей, направленных на определение наличия в них маркеров вирусных гепатитов.

Полученные результаты

После исследования в образцах сыворотки крови наличия анти-ВГС были выделены следующие группы:

1) при отсутствии анти-ВГС в скрининговой тест-системе образцы были признаны не содержащими анти-ВГС (группа Анти-ВГС-);

2) при выявлении в первичной скрининговой и в подтверждающей тест-системе анти-ВГС с высокой оптической плотностью (ОП не менее 2,0, КП не менее 8) образцы были признаны анти-ВГС-содержащими (группа Анти-ВГС+).

Следующие две группы были выделены при дальнейшем исследовании позитивных образцов с низкой ОП в ИФТС для первичного скрининга (ОП менее 1,4, КП менее 5), а именно:

3) при выявлении анти-ВГС с низкой ОП и соответственно с низким КП в двух подтверждающих ИФТС разных производителей и определения низкой или высокой авидности анти-ВГС образцы признавались анти-ВГС-низкопозитивными (группа Анти-ВГС низк+);

4) при выявлении анти-ВГС только в одной из двух подтверждающих ТС либо при выявлении анти-ВГС в двух подтверждающих ТС разных производителей, но при отсутствии положительного результата в ЛИА и при определении авидности анти-ВГС, результат исследования анти-ВГС рассматривался как неопределенный в ИФТС, но отрицательный в ЛИА (группа Анти-ВГС но/-).

Группу Анти-ВГС- составили 16 образцов сыворотки крови пациентов (средний возраст 74,5 ± 7,45 лет), у которых отсутствовали указания на факторы высокого риска инфицирования ВГС. В группе анти-ВГС средняя величина концентрации АФП составляла 8,25 МЕ/мл (от 3,741 до 29,71 МЕ/мл, σ = 6,266 МЕ/мл).

Группу Анти-ВГС+ составили 30 образцов (средний возраст пациентов 73,6 ± 5,5 лет). Образец №8 был получен от пациента с заболеванием печени, образец №22 - от пациента с наркоманией. В 28 из 30 образцов в подтверждающей ТС были обнаружены анти-Core и анти-NS ВГС с ОП в первичной и подтверждающей ИФТС не менее 2, КП не менее 8. В образце №18 определялись только анти-Core с ОП 2,0 и КП 8,0, в образце №7 определялись только анти-NS с ОП 2,7 и КП 10,8. Во всех образцах данной группы анти-ВГС были высокоавидными. Средняя концентрация АФП в группе Анти-ВГС+ составляла 14,725 МЕ/мл (интервал от 3,804 до 111,815 МЕ/мл, σ = 22,02 МЕ/мл).

В группу Анти-ВГСнизк+ (11 образцов, средний возраст пациентов 71,5 ± 6,4 года) образцы были отобраны согласно ранее разработанному алгоритму: либо при обнаружении только анти-Core с КП менее 2; либо при обнаружении только анти-NS ВГС (табл. 1). Средняя величина КП анти-NS в каждой ИФТС не превышала 5, однако КП анти-NS в разных ИФТС могли отличаться (образец №2). В 8 из 11 образцов авидность анти-ВГС была высокой, в трех - низкой. В 6 из 11 образцов были обнаружены только высоко- или низкоавидные анти-NS4 ВГС. Указаний на наличие факторов высокого риска инфицирования ВГС не было ни у одного пациента. Среднее значение концентрации АФП в группе анти-ВГСнизк+ было равно 7,045 МЕ/мл (от 4,06 до 24,06 МЕ/мл; σ = 5,773 МЕ/мл).

Результаты исследования 25 образцов (средний возраст пациентов 75,4 ± 7,0 лет) в ИФТС планшетного формата были противоречивыми (табл. 2). Из 25 образцов в двух (№3 и №18) были обнаружены высокоавидные анти-ВГС, в шести образцах (№№ 1, 2, 6, 9, 16, 19) авидность анти-ВГС была низкой. Все вышеперечисленные образцы в ИФТС другого производителя и в ЛИА были определены как анти-ВГС-негативные (группа Анти-ВГСно/-). Средняя величина концентрации АФП в образцах Анти-ВГСно/- была равна 11,187 МЕ/мл (от 2,941 до 83,16 МЕ/мл, σ = 16,642 МЕ/мл).

При сравнении сывороточной концентрации АФП по критерию Манна-Уитни было обнаружено, что группа образцов, не содержащих анти-ВГС, не отличается ни от одной из исследованных групп. Различия по концентрации АФП были обнаружены:

1) между группами Анти-ВГС+ и Анти-ВГСнизк+ (p = 0,024);

2) между группами Анти-ВГС+ и Анти-ВГСно/- (p = 0,045).

Обсуждение и заключение

У пациентов пожилого возраста в г. Москве инфицирование вирусом гепатита С является наиболее частой причиной хронического гепатита (69,3% больных) [2]. При инфицировании ВГС в возрасте старше 50 лет цирроз печени формируется вдвое быстрее, чем у лиц, инфицированных до 50 лет. Осложнения ВГС-инфекции выявляются у пожилых в основном в далеко зашедших формах вследствие того, что длительная бессимптомная персистенция вируса и стертые клинические проявления заболевания приводят к позднему обращению больных к врачу [2]. Повышение специфичности лабораторной диагностики ВГС-инфекции как на раннем этапе инфицирования, так и при возрастной недостаточности иммунного ответа возможно при расширенных исследованиях анти-ВГС-позитивных образцов с низкой ОП в ИФА. Сравнивая результаты исследования проб пожилых людей с ранее полученными результатами исследования проб молодых мужчин [5], можно отметить следующее. Из общего количества образцов с неопределенными результатами исследования в ИФТС позитивными при дальнейшем исследовании признается не более 1/3 как в группе молодых мужчин, так и людей старше 65 лет. Различия между группами проявились, во-первых, в спектре выявляемых антител. В пробах, полученных от пожилых людей, в ИФТС с низкой ОП могли определяться анти-NS3, -NS4 и -NS5 раздельно и в различных сочетаниях; в ИБ/ЛИА наличие анти-ВГС в пробах данной подгруппы не подтверждалось. В пробах, полученных от молодых мужчин, практически во всех образцах с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в ИФТС выявлялись только анти-NS4 ВГС; в дальнейших исследованиях в иммуноблоте наличие анти-ВГС не подтверждалось. Во-вторых, различие между группами выявилось по авидности антител: анти-NS4 у пожилых пациентов могли быть как высоко-, так и низкоавидными, а при обнаружении в пробе молодого пациента только анти-NS4 авидность антител не определялась. В-третьих, согласно нашим данным, изменение концентрации АФП в зависимости от результата тестирования анти-ВГС (позитивного, негативного и неопределенного) в группах проб молодых и пожилых пациентов было различным. Концентрация АФП в анти-ВГС-негативных образцах сыворотки крови молодых мужчин была ниже, чем в анти-ВГС-позитивных образцах и в образцах с неопределенными в ИФТС и неотрицательными в иммуноблоте результатами. В двух последних подгруппах концентрация АФП не различалась [5], что подтверждает вывод Rios [10] об эпидемиологической близости групп с анти-ВГС-позитивными и неопределенными результатами. В отличие от этого, группа образцов пожилых людей с отрицательными результатами тестирования анти-ВГС была крайне гетерогенной по концентрации АФП, по-видимому, вследствие разнообразных приобретенных заболеваний и наличия иных, кроме ВГС, гепатотоксических факторов, вследствие чего не отличалась ни от одной из исследованных групп по концентрации АФП. Отмеченное превышение сывороточной концентрации АФП в анти-ВГС-высокопозитивных образцах над концентрацией АФП в анти-ВГС-низкопозитивных образцах может быть обусловлено длительностью инфекционного процесса, в течение которого наиболее выраженное повышение уровня АФП наблюдается на стадии тяжелого фиброза с последующим снижением при трансформации в цирроз печени (частом осложнении хронического гепатита С у пожилых людей) [3]. Кроме того, в низкопозитивных на наличие анти-ВГС-образцах отсутствие подъема концентрации АФП может быть обусловлено начальным этапом инфекционного процесса (с анти-ВГС низкой авидности) либо выздоровлением (с остаточными анти-ВГС высокой авидности) с нормализацией биохимических показателей. Образцы с противоречивыми в ИФТС, но отрицательными в иммуноблоте и в тесте на авидность результатами, по-видимому, проявляли в ИФТС ложную позитивность.

Таблица 1

Концентрация α-фетопротеина в образцах сыворотки крови пожилых людей,
содержащих высоко- и низкоавидные анти-ВГС (соответственно ВА и НА)
с низким коэффициентом позитивности (значение КП указано).

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Матиевская Н.В., Пашковец А.В., Стасюкевич А.К., Малышко Н.Г.

Цель работы: оценить информативность иммуноферментного анализа в диагностике ВГС-инфекции. Изучены показатели оптической плотности (ОП) сывороток крови при определении анти-ВГС методом ИФА 250 пациентов, не получавших противовирусную терапию гепатита С. Всем пациентам было выполнено определение РНК ВГС методом ПЦР. Установлено, что при ОП, равной 2,6 и более, диагностируется репликативная стадия ВГС-инфекции (РНК ВГС +), в то время как при ОП, равной или менее 0,7, исключается наличие репликативной стадия ВГС-инфекции (РНК-). Выводы: показатель ОП суммарных антител к ВГС в сыворотке крови может быть использован как дополнительный критерий диагностики ВГС-инфекции в условиях ограниченных возможностей проведения ПЦР.

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Матиевская Н.В., Пашковец А.В., Стасюкевич А.К., Малышко Н.Г.

DESCRIPTIVENESS OF ENZYME-LINKED IMMUNOADSORBENT ASSAY IN DIAGNOSIS OF HCV-INFECTION

Aim of study: to estimate descriptiveness of enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA) in diagnosis of HCV-infection. Methods. The optical density (OD) of total antibodies to HCV in the blood serum of 250 blood serum samples of antiHCV-positive patients who did not receive antiviral therapy against HCV . All patients were tested on RNA HCV by PCR. Results are presented as mean ± SD.Results. The OD 2,6 and more are associated with replicative stage of HCV-infection (RNA+), OD 0,7 and less is parameter for exclusion of replicative stage of HCV-infection (RNA-). Conclusions. Parameter of serum OD may be used like additional criteria for diagnosis of HCV-infection especially in setting with limited recourses for PCR

ИНФОРМАТИВНОСТЬ ИММУНОфЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В ДИАГНОСТИКЕ

Матиевская Н. В.(пЫатаИ@та'11.ги)/ Пашковец А. В.(hannapashkavets@gmaiLcom)/ 2Стасюкевич А. К. (hanna_stasiukevich@list.ru), 3Малышко Н. Г. (natagrd@tut.by)

Цель работы: оценить информативность иммуноферментного анализа в диагностике ВГС-инфекции. Изучены показатели оптической плотности (ОП) сывороток крови при определении анти-ВГС методом ИФА 250 пациентов, не получавших противовирусную терапию гепатита С. Всем пациентам было выполнено определение РНК ВГС методом ПЦР. Установлено, что при ОП, равной 2,6 и более, диагностируется репликативная стадия ВГС-инфекции (РНК ВГС+), в то время как при ОП, равной или менее 0,7, исключается наличие репликативной стадия ВГС-инфекции (РНК-). Выводы: показатель ОП суммарных антител к ВГС в сыворотке крови может быть использован как дополнительный критерий диагностики ВГС-инфекции в условиях ограниченных возможностей проведения ПЦР.

Ключевые слова: ВГС; ИФА; антитела к ВГС, диагностика

В настоящее время вирусный гепатит С (ВГС) является актуальной проблемой здравоохранения во всем мире в связи с его широкой распространенностью среди трудоспособного населения. По мнению экспертов ВОЗ, ежегодно в мире инфицируются ВГС 3-4 млн человек. Общее количество хронически инфицированных ВГС составляет 130-170 млн человек. По прогнозной оценке экспертов CDC, в мире в последующие 5 лет ожидается увеличение количества инфицированных ВГС до 400-450 млн. Ежегодно от связанных с гепатитом С болезней печени умирает примерно 350 000 пациентов [4].

Репликативная стадия ВГС-инфекции свидетельствует о наличии острой или хронической ВГС-ин-фекции и диагностируется при наличии у пациента положительного результата на РНК ВГС. В то время как отсутствие РНК ВГС у анти-ВГС позитивного пациента говорит либо о спонтанной ремиссии ВГС-инфекции, что встречается в 10-15% случаев при естественном течении заболевания, либо о ремиссии в ответ на противовирусную терапию [2, 4].

Определение анти-ВГС проводится при помощи широко распространенного твердофазного иммуноферментного анализа, результат которого представлен антителами общего класса - anti-HCV total, которые содержат иммуноглобулины М и G. Верификация положительного результата ИФА базируется на показателе оптической плотности (ОП) сыворотки крови. ОП отражает уровень концентрации суммарных антител в одной единице объема. Положительный результат на определение антител к ВГС может свидетельствовать о наличии у пациента как репликативной стадии ВГС, так и пер-систировании антител после перенесенной острой или хронической ВГС-инфекции (ремиссия) [2].

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

Заболеваемость ГС в по регионам РБ за 2014 и 2015 гг. представлена на рисунке 1.

Таблица 1 - Распределение образцов сывороток в зависимости от уровня оптической плотности и результатов ПЦР

Рисунок 1. - Распространённость впервые установленного хронического ГС и «носительства

Для оценки информативности ИФА в диагностике репликативной стадии ВГС-инфекции был выполнен сравнительный анализ показателей ОП сыворотки крови при положительных результатах ИФА в зависимости от результата качественной ПЦР на РНК ВГС. По результатам ПЦР РНК ВГС не выявлялась в 75 (30%) образцах плазмы крови. РНК ВГС была выявлена у 175 (70%). Уровень ОП у ВГС РНК-негативных был значительно ниже, чем у ВГС РНК-позитивных пациентов: 0,67±0,54(0,007-2,579) и 2,7±0,65 (0,986 - 3,896), соответственно (p 0,3

2,6 и более 104 (59,4%) 0 Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Как видно из представленной таблицы 1, среди РНК-ВГС+ пациентов в 59,4% случаев имела место высокая ОП (>2,6). У пациентов с таким уровнем ОП отсутствовали негативные результаты определения РНК. В то время как среди пациентов с негативными результатами на выявление РНК методом ПЦР в 65,3% случаев ОП была менее 0,7. Среди пациентов с РНК-ВГС+ уровень ОП менее 0,7 не был выявлен ни в одном случае, что подтверждает результаты ROC-анализа.

Группа пациентов с ОП более 0,7, но менее 2,6 была неоднородна по своему составу, так как в ней присутствовали пациенты как с наличием репликативной стадии ВГС (РНК-ВГС+) - 71 (40,6%), так и пациенты с отсутствием репликативной стадии ВГС (РНК-ВГС-) - 26 (33,75%). Представленные данные указывают на низкую информативность показателя ОП в пределах более 0,7, но менее 2,6 для диагностики или исключения репликативной стадии ВГС-инфекции.

Приводим клинические примеры, подтверждающие информативность представленных данных. Пациент Б., 43 г., диагноз: Хронический вирусный гепатит С, умеренной степени активности. Показатель ОП при определении анти-ВГС методом ИФА: 4,859 от 03.11.15. РНК-ВГС выделена от 12.11.2015. Таким образом, у данного пациента была диагностирована репликативная стадия ВГС-инфекции как по показателю ОП (уровень ОП >2,6), так и по результатам ПЦР-диагностики. Пациенту назначена противовирусная терапия ВГС-инфекции.

Пациент В., 38 л. Хронический гепатит С, ремиссия. Показатель ОП при определении анти-ВГС методом ИФА: от 07.12.15 составил 0,271. РНК-ВГС не выделена. У данного пациента была исключена репликативная стадия ВГС-инфекции как по показателю ОП (уровень ОП Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Aim of study: to estimate descriptiveness of enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA) in diagnosis of HCV-infection.

Methods. The optical density (OD) of total antibodies to HCV in the blood serum of250 blood serum samples of anti-HCV-positive patients who did not receive antiviral therapy against HCV. All patients were tested on RNA HCV by PCR. Results are presented as mean ± SD.Results. The OD 2,6 and more are associated with replicative stage of HCV-infection (RNA+), OD 0,7 and less is parameter for exclusion of replicative stage of HCV-infection (RNA-).

Conclusions. Parameter of serum OD may be used like additional criteria for diagnosis of HCV-infection especially in setting with limited recourses for PCR

Keywords: HCV; ELISA: Anti-HCV, diagnoses

Поступила: 02.09.2016 Отрецензирована: 06.09.2016

Иммуносорбент – смесь синтетических и рекомбинантных HCV-антигенов, сорбированных в лунках планшета для ИФА 96-луночные разборные или цельные планшеты для ИФА из прозрачного бесцветного полистирола, сорбированные HCV-антигенами
Конъюгат (х51 концентрат) - моноклональные антитела мыши против IgG человека, меченные пероксидазой хрена Прозрачная жидкость сине-зелёного цвета
К+ - контрольный положительный образец инактивированный Прозрачная жидкость красного цвета
К- - контрольный отрицательный образец инактивированный Прозрачная жидкость жёлтого цвета
РИП - разбавитель исследуемых проб Прозрачная жидкость сине-фиолетового цвета
ФСР-Т (х25 концентрат) - фосфатно-солевой буферный раствор с твином-80 Прозрачная или опалесцирующая жидкость бесцветная или жёлтоватого цвета, допускается выпадение бесцветного кристаллического осадка
ЦБ – цитратный буферный раствор, содержащий Н2О2 Прозрачная бесцветная жидкость
ТМБ (х5 концентрат) – раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в димексиде
Стоп-реагент – 1 М раствор кислоты серной
Набор №1 рассчитан на проведение 192 определений, набор №2 рассчитан на проведение 96 определений, включая контрольные.

Набор реагентов предназначен для выявления антител к вирусу гепатита С в сыворотке (плазме) крови человека и препаратах крови.
Принцип метода
В основе метода лежит принцип непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антител класса IgG к антигенам вируса гепатита С.
При внесении исследуемых или контрольных образцов в лунки планшета, антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС), в случае их наличия в образце, связываются с антигенами, иммобилизованными на твердой фазе, образуя иммунный комплекс антиген-антитело. Не связавшиеся антитела удаляют промыванием лунок. Внесение пероксидазного конъюгата моноклональных антител к IgG человека приводит к образованию комплекса антиген-антитело-конъюгат, на поверхности лунок планшета. Избыток конъюгата удаляют промыванием. Для выявления образовавшегося комплекса в лунки добавляют бесцветный субстратный раствор, в состав которого входит водорода перекись и хромоген (ТМБ). В результате
ферментативной реакции из водорода перекиси выделяется кислород, который переводит хромоген в окрашенную форму. Ферментативную реакцию останавливают внесением раствора кислоты серной. Измеряют оптическую плотность (ОП), величина которой зависит от концентрации анти-ВГС в образце.

Подготовка реагентов для ИФА
Все компоненты перед использованием выдержать не менее 30 мин при температуре от 18 до 25 °C. В случае выпадения кристаллов солей в ФСР-Т (х25 концентрат), прогреть его при температуре 37 °C до полного растворения осадка. Растворы готовить в зависимости от количества используемых стрипов иммуносорбента в соответствии с таблицей.
Рабочий раствор ФСР-Т хранить при температуре от 2 до 8 °C не более 3 сут. Рабочий раствор конъюгата и субстратный раствор готовить непосредственно перед применением. Не хранить. К+, К-, РИП и Стоп-реагент готовы к использованию.
После отбора необходимого количества оставшиеся концентраты реагентов и неиспользованные стрипы хранить плотно закрытыми в пакете в течение срока годности при температуре от 2 до 8 °C.

Подготовка к исследованию препаратов крови
Лиофилизированные препараты крови перед исследованием растворить в дистиллированной воде (если иное не указано в ФСП на препарат) и довести объем до номинального.
Все препараты иммуноглобулинов перед исследованием дополнительно развести рабочим раствором ФСР-Т до конечной концентрации белка:
- 10+1 мг/мл (для иммуноглобулинов внутривенного введения),
- 5+0,25 мг/мл (для иммуноглобулинов внутримышечного введения),
- 5+0,4 мг/мл (для иммуноглобулинов энтерального применения).
Растворенные препараты крови хранению не подлежат.

Проведение ИФА
Иммуносорбент перед использованием промыть 2 раза рабочим раствором ФСР-Т, заполняя лунки до краёв и удаляя промывающий раствор в ёмкость с дезинфицирующим раствором.
Во все лунки внести по 100 мкл РИП, добавить по 20 мкл контрольных или исследуемых образцов и перемешать пипетированием. При этом цвет раствора в лунках (за исключением К+) должен измениться с сине-фиолетового на сине-зеленый. При использовании 1 стрипа иммуносорбента контрольные образцы вносить каждый в 1 лунку. При использовании большего количества стрипов контрольные образцы внести не менее чем в 2 лунки каждый.
Планшет закрыть липкой лентой или крышкой и инкубировать при температуре 37 °C в течение 30-40 мин, затем промыть 5 раз как описано выше.
Во все лунки внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата, планшет закрыть липкой лентой или крышкой и инкубировать при температуре 37 °C в течение 30-40 мин, затем промыть 5 раз как описано выше.
Во все лунки внести по 100 мкл субстратного раствора, выдержать в течение 10-15 мин при температуре от 18 до 25 °C в защищённом от света месте, затем добавить по 50 мкл стоп-реагента и не позднее чем через 5 мин учесть результаты ИФА.

Учет и интерпретация результатов

Провести измерение оптической плотности (ОП) раствора в лунках иммуносорбента с помощью анализатора иммуноферментного при двух длинах волн. Тест-фильтр – 450 нм, референс-фильтр – 620-680 нм. Допускается одноволновое измерение при 450 нм.
Результаты оценивать, если среднее значение ОП в лунках с К- (ОПср.К-) не превышает 0,150, в лунках с К+ - не менее 1,000.
Исследуемые образцы, ОП которых не выше критического значения ОПкрит., оценивать как отрицательные. Образцы, ОП которых выше ОПкрит., оценивать как положительные. Значение ОПкрит. вычислять по формуле:
ОПкрит. = ОПср.К- + 0,150

Входящие в набор реагентов контрольные образцы инактивированы. Однако исследуемая сыворотка и плазма крови людей, а также растворы, оборудование и материалы, находящиеся с ними в контакте представляют собой потенциально инфекционный материал, и обращаться с ним следует осторожно: при работе использовать резиновые перчатки; оборудование, находившееся в контакте с биологическими образцами и реагентами, дезинфицировать до и после работы спирта этилового раствором 70 %; все использованные материалы обеззараживать водорода перекиси раствором 6 % или хлорамина Б раствором 3 % в течение 2 ч, или автоклавированием при (2,0±0,1) кгс/см2 ((0,20±0,01)МПа), температуре (132±2) °C в течение 60 мин; при работе с растворами ТМБ и кислоты серной не использовать пипетки с металлическими частями и избегать попадания этих растворов на кожный покров. Загрязненные участки кожи и слизистые оболочки обильно промывать водой.