Методы культивирования вирусов индикация и идентификация вирусов

Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур.

Тканевые культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня.

Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

Более 80 курсов для обучения Всего 20 минут в день на занятия Персональный преподаватель

Индикация вирусов – лабораторный процесс установления присутствия неидентифицированных вирусов в исследуемом материале или в системе культивирования вирусов. Осуществляется путем электронной микроскопии, выявления цитопатического действия (ЦПД) и образования включений, реакциями гемагглютинации, гемадсорбции, гемолиза, присутствия бляшек на ХАО КЭ и кре клеток под агаровым покрытием, признаков экспериментальной инфекции.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.

Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) – принцип контролируемого умножения копий ДНК искомого микроорганизма

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.

Лизис (от греч. λύσις) — растворение, разрушение клеток и их систем, в том числе микроорганизмов, под влиянием различных агентов, например ферментов, бактериолизинов, бактериофагов, антибиотиков. Также, в медицинской практике может обозначать период постепенного и медленного падения температуры при инфекционных заболеваниях; антоним термину кризис.

Нуклеи́новые кисло́ты (от лат. nucleus — ядро) — высокомолекулярные органические соединения, биополимеры (полинуклеотиды), образованные остатками нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты ДНК и РНК присутствуют в клетках всех живых организмов и выполняют важнейшие функции по хранению, передаче и реализации наследственной информации.

Але́ксис Карре́ль (фр. Alexis Carrel) (28 июня 1873, Сент-Фуа-ле-Лион — 5 ноября 1944, Париж) — французский хирург, биолог, патофизиолог и евгенист, лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1912 году.

Для индикации вирусов в инфекционном материале могут быть использованы следующие методы и критерии:

Микроскопический: обнаружение вирусных включений в препаратах, окрашенных но Муромцеву, Морозову, Романовскому, Пигаревскому, Павловскому, обработанные флюорохромами.

Вирусологическое выделение вирусов в культурах клеток, в развивающихся куриных эмбрионах, на лабораторных животных (состояние, симптомы).

В культуре тканей: реакция гемаглютинации (РГА), реакция гемадсорбции (РГадс), цитопатогенное действие (ЦПД), цветная проба, метод бляшек.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью серологических (иммунологических) методов:

реакция торможения гемагглютинации (РТГА),

реакция торможения гемадсорбции (РТГадс),

реакция связывания комплемента (РСК),

реакция нейтрализации цитопатогенного действия (РН),

реакция иммунофлюоресценции прямая и непрямая (РИФ, РНИФ),

реакция преципитации в геле (РП),

реакция нейтрализации цветной пробы.

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

Берут 7-11 дневные куриные эмбрионы, проверяют их жизнеспособность на овоскопе, на нем же у эмбриона простым карандашом обводят воздушную камеру - главный ориентир для последующих манипуляций.Стерильным тампоном с йодом протирают верхнюю (тупую) часть яйца, затем 60° спиртом.

Заражение невскрытого эмбриона

А) В хорион аллантоисную полость: Делают по границе воздушной камеры яйца под углом 45° к его поверхности на глубине 0,3-0,5 см. После введения вирусного материала отверстие заливают расплавленным парафином, и эмбрион в специальных лотках помещают в термостат-инкубатор приt° +40; +42С° и влажности в 60 %.

Б) В амнион и куриный зародыш:Инфицируют толстой тупой иглой для спинномозговыхпункций. Манипуляцию выполняют в темной комнате под контролем глаза, осторожно упираясь в эмбрион.

После заражения отверстие парафинируют, а инкубацию эмбриона продолжают.

Заражение вскрытого эмбриона:

Выполняют после снятия изогнутыми ножницами крышки яйца над его воздушной камерой, которую снимают очень осторожно.

А) Заражение в амниотический мешок выполняют после его подтягивания стерильным пинцетом.

Б) Заражение в желточный мешок проводят также.

В) обоих случаях дефект в скорлупе яйца закрывают: либо возвращением снятого тупого конца скорлупы, либо крышечкой от стеклянного бюкса. Их края для приданиягерметичности заливают парафином. Помещают в термостат-инкубатор.

Контрольные наблюдения ведут по критериям:

подвижность эмбриона, как показатель жизнеспособности;

появление на оболочках эмбриона бляшек с просяное зерно из внутриклеточных вирусных включений;

общепринятая индикация и идентификация вируса (Приложение 3).

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ С РАЗНЫМ ГЕНОМОМ

ДНК- геномные цитоплазматические (вирус натуральной оспы)

Адсорбция на клетке- виропексис

Депротеинизация, освобождение генома

Стратегия вирусного генома (СВГ)

Все этапы в цитоплазме клетки

Репродукция ДНК (с участием эндорепликазы)

Трансляция на рибосомы

Выход из клетки

Синтез вирусного белка

Эндогенная (вирусная) транскриптаза

Транскрипция

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки-хозяина

ДНК -геномные ядерные (вирус герпеса)

Адсорбция на клетки -виропексис

Депротеинизация. Освобождение генома

СВГ

Редупликация ДНК в ядре клетки хозяина

Разобщенный (дизъюнктивный) синтез

Репродукция ДНК в ядре клетки с участием экзорепликаз

Сборка вириона в цитоплазме

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки

Экзогенная транскрипция (клеточная)

И-РНК транскрипция

Трансляция на рибосомы

Итак, синтез идёт по схеме: ДНК РНК белок

РНК-геномные минуснитевые (вирус гриппа)

Адсорбция на клетке- виропексис

Депротеинизация. Освобождение генома

СВГ

Редупликация ДНК

И-РНК

Экзогенная транскриптаза

М-РНК

М-РНК + репликативная форма

Синтез вирусного белка на рибосоме

+РНК

Сборка вириона

+РНК выполняет функции И- РНК

Трансляция на рибосомы

Синтез вирусного белка

Итак, синтез идет по схеме РНК РНК белок

РНК геномные + нитевые

Адсорбция

Депротеинизация

СВГ

Функции И-РНК выполняет +РНК нить

+РНК

Трансляция на рибосомы

Синтез вирусной репликазы (эндорепликазы)

Матрица для образования +нитей ДНК

Синтез вирусного белка

Итак, синтез идет по схеме: РНК белок

ДНК онкогенные вирусы

Адсорбция

депротеинизация

Интеграция в геном ДНК клетки хозяина

Редупликация ДНК

И-РНК

Белок вирусный

Итак, синтез идет по схеме: ДНК РНК белок

РНК онкогенные вирусы (обратная транскрипция)

Адсорбция- виропексис

Депротенизация

РНК (одна нить)

В вирионе формируется РНК зависимая ДНК полимераза

Синтез двунитчатой ДНК (провирус)

СВГ

Редупликация ДНК

Сборка вириона созревание на мембранах клетки

Трансляция ДНК (провируса при участии РНК- полимеразы клетки)

Для индикации вирусов в инфекционном материале могут быть использованы следующие методы и критерии:

Идентификация вирусов осуществляется с помощью серологических (иммунологических) методов:

реакция торможения гемагглютинации (РТГА),

реакция торможения гемадсорбции (РТГадс),

реакция связывания комплемента (РСК),

реакция нейтрализации цитопатогенного действия (РН),

реакция иммунофлюоресценции прямая и непрямая (РИФ, РНИФ),

реакция преципитации в геле (РП),

реакция нейтрализации цветной пробы.

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

Берут 7-11 дневные куриные эмбрионы, проверяют их жизнеспособность на овоскопе, на нем же у эмбриона простым карандашом обводят воздушную камеру - главный ориентир для последующих манипуляций. Стерильным тампоном с йодом протирают верхнюю (тупую) часть яйца, затем 60° спиртом.

Заражение невскрытого эмбриона

Б) В амнион и куриный зародыш: Инфицируют толстой тупой иглой для спинномозговых пункций. Манипуляцию выполняют в темной комнате под контролем глаза, осторожно упираясь в эмбрион.

После заражения отверстие парафинируют, а инкубацию эмбриона продолжают.

Заражение вскрытого эмбриона:

А) Заражение в амниотический мешок выполняют после его подтягивания стерильным пинцетом.

Б) Заражение в желточный мешок проводят также.

В) обоих случаях дефект в скорлупе яйца закрывают: либо возвращением снятого тупого конца скорлупы, либо крышечкой от стеклянного бюкса. Их края для придания герметичности заливают парафином. Помещают в термостат-инкубатор.

Контрольные наблюдения ведут по критериям:

подвижность эмбриона, как показатель жизнеспособности;

появление на оболочках эмбриона бляшек с просяное зерно из внутриклеточных вирусных включений;

общепринятая индикация и идентификация вируса (Приложение 4).

ВОПРОСЫ ТЕСТОВОГО КОНТРОЛЯ

1.. Аденовирусы являются:

.2. Рабдовирусы являются:

4. Ретровирусы являются:

5. Пикорнавирусы являются:

6. Гепатовирус В является:

6. Гепатовирусы А, С, D являются:

7. Герпесвирусы являются:

9. Каким из перечисленных признаков должна отвечать культура клеток:

а) способность к быстрой пролиферации

б) являться низкодифференцированными

в) все выше перечисленное

10. Какая из перечисленных стадий не характерна для последовательности репродукции вирусов?

б) проникновение генома

в) проникновение (виропексис)

г) депротеинизация, освобождение генома

д) репродукция генома, синтез белка

е) сборка вирионов

ж) высвобождение вирионов из клетки

11. Каким образом можно выявить наличие вируса в зараженной культуре клеток?

а) по цитопатическому эффекту (деструкция)

б) по способности цитоплазматической мембраны инфицированных клеток адсорбировать эритроциты

в) по рН и цвету культуральной среды (цветная проба)

г) по всем критериям

12. Имеет ли смысл выращивать бактерии в культуре ткани? а) да

13. Можно ли культивировать вирусы на простом МПА, кровяном MIIA, МПБ? а) да

14. Выбрать эффективный способ обезвреживания вирусов:

в) стерилизация в автоклаве

д) простое кратковременное кипячение

е) все названные методы и средства

Методическая разработка по теме.

Мотавкина Н.С., Артемкин В.Д. Атлас по микробиологии и вирусологии. М., 1976. С. 170-227.

Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология. М., 2005.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. С-Пб, 2002. С. 239-253.

Медицинская микробиология. Под ред. Покровского В.И., Поздеева O.K. М., 1999. С.659-697.

Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования (пол ред. Биргера М.О.). М., 1982. С. 23-30, 98-114, 121-126.

3. Райкис Б.Н., Пожарская В.О., Казиев А.Х. Общая микробиология с вирусологией и иммунологией. М., 2002. С.27-39.

4. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под ред. Воробьева А.А., Быкова А.С. М., 2003. С.99-103.

5. Медицинская микробиология. Под ред. Королюка А.М., Сбойчакова В.Б. С-Пб, 2002. С. 7-46.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8

Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УНИВЕРСИТЕТ им. Х. М.БЕРБЕКОВА

ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ

Методические рекомендации по организации самостоятельного

Для специальности 020201.65 – Биология

кандидат биологических наук,

старший преподаватель кафедры микробиологии, гигиены и санитарии

В методических рекомендациях представлены современные методы исследования вирусов. Описываются особенности работы с вирусами, методы их культивирования, индикации и идентификации.

Рекомендовано РИС университета

государственный университет, 2010

Вирусология – медико-биологическая наука, изучающая вирусы: их строение, биохимию, систематику, генетику, а также значение в жизни человека.

В результате изучения вирусологии студенты должны знать особенности вирусов, овладеть практическими навыками и умениями в заборе материала для вирусологических исследований, проведении лабораторных методов диагностики заболеваний и в оценке их результатов. При изучении вирусологии используются знания, полученные студентами при прохождении общей биологии, гистологии, биохимии, генетики, физиологии.

Существующие учебники и практические руководства не отражают всех вопросов, затрагиваемых в этом курсе. Настоящие методические рекомендации разработаны по темам соответствующим лабораторным занятиям и содержат методы не представленные в лабораторном практикуме.

Основное внимание уделено современным методам применяемым в вирусологии, вместе с тем студенты знакомятся с фундаментальными принципами и нюансами вирусологических методов исследования.

В данное издание включены разделы: 1 – культивирование вирусов; 2 – индикация и идентификация вирусов. Собраны: описание подготовки материала для вирусологических исследований, методы обработки вируссодержащего материала, выделение и культивирование вирусов различными способами, методы индикации и идентификации вирусов и молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций. К каждому разделу даётся перечень контрольных вопросов, тематика докладов о результатах самостоятельной работы и список рекомендуемой литературы.

Раздел 1. Культивирование вирусов

1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований

1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории

В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению штаммов вирусов, их идентификации и культивированию, выполняются различные научные исследования. При работе с вирусами необходимо прежде всего:

1. Не допустить загрязнения штаммов вирусов посторонней микрофлорой;

2. Обеспечить безопасность работающего персонала от возможного заражения вирусами;

3. Обеспечить безопасность окружающего населения от заражения вирусными инфекциями через сточные воды, трупы экспериментальных животных и т. п.

Методы исследования, применяемые в вирусологии отличаются значительной сложностью, что связано прежде всего с абсолютным внутриклеточным паразитизмом вирусов и их малыми размерами.

При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы:

· Методы электронной и в меньшей степени световой микроскопии;

· Методы выделения и культивирования вирусов в культурах клеток;

· Методы выделения и культивирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах и в организме чувствительных экспериментальных животных;

· Выявление вирусов по их гемагглютинирующей способности;

· Различные серологические методы исследования: традиционные и экспресс-методы;

· Молекулярно-генетические методы исследования – молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция.

1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях

При взятии инфекционного материала от людей и животных необходимо учитывать тропизм вирусов к определённым тканям и органам, пути выделения вируса во внешнюю среду и особенности патогенеза той или иной вирусной инфекции.

Различают пневмотропные, энтеротропные, гепатотропные, лимфотропные, нейротропные и дермотропные вирусы. В зависимости от тропизма исследованию подвергают различные материалы. Например, исследуют слизь из зева, мокроту и т. п., если виру пневмотропный; испражнения – при энтеротропных вирусах; жидкость из визикул или пустул, корочки – если вирус обладает дермотропностью и т. д.

1.1.3. Обработка вируссодержащего материала

Инфекционные материалы, взятые с учётом тропизма вирусов и с соблюдением асептики, помещают в стерильную посуду, тщательно закупоривают её и направляют в лабораторию, поместив в термос со льдом.

Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы быстро инактивируются. Сохранению вируса способствует помещение исследуемого материала (в 50%-ном растворе глицерина) в холодильник при температуре не выше 5оС. Но самый надёжный способ – это хранение в замороженном состоянии при температуре -45оС и ниже; в таких условиях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время.

Обработка плотного материала, содержащего вирусы, начинается с растирания его в ступке или измельчения в специальных аппаратах – гомогенизаторах. Затем готовится 10%-ная взвесь в солевом растворе, которую центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-30 минут для осаждения крупных частиц. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию.

Жидкий вируссодержащий материал непосредственно центрифугируют и также получают надосадочную жидкость.

Если есть сомнения в бактериологической стерильности исследуемой вируссодержащей надосадочной жидкости, к ней добавляют антибиотики, чтобы уничтожить посторонние микроорганизмы. Антибиотики не влияют на вирусы, и они сохраняют свою жизнеспособность.

1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии

Электронноскопические препараты готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражённых вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плёнки-подложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-подложки должны быть очень тонкими (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными, например, коллоидийно-угольные. Плёнки наносят на поддерживающие сеточки из меди (диаметром 2-3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами.

Методы напыления металлами применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на вируссодержащий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла.

Метод негативного контрастирования основан на том, что при обработке препарата некоторыми солями тяжёлых металлов, например, 1-2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, создаётся более плотный слой, не пропускающий электроны, а котором хорошо видны более электроннопрозрачные исследуемые объекты.

Метод ультратонких срезов в сочетании с негативным контрастированием является наилучшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этапов взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиболее сложен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодержащего материала фиксируют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обезвоживают путём последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной 10-20 нм на специальном микротоме, Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Приготовленные вышеописанными способами препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0,2-0,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюаресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Получаемые увеличения: ×100000-×400000.

Сканирующая электронная микроскопия осуществляется с помощью сканирующего электронного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, проходя через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изображение объекта на флюоресцирующем экране.

Читайте также: