Контроль специфической активности вируса

Содержимое (Table of Contents)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья определяет основные требования к биологическим методам испытаний препаратов интерферона с использованием клеточных культур и распространяется на субстанции и лекарственные формы интерферона человеческого всех типов природного и генно-инженерного происхождения.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Биологические методы с использованием клеточных культур применяют для определения следующих показателей качества препаратов интерферона:

Специфическая активность
Подлинность

Методы определения специфической активности и подлинности основаны на способности интерферона подавлять цитопатическое действие индикаторного вируса в культуре клеток в сравнении со стандартным образцом интерферона (СО). Испытания проводят с использованием соответствующих линий клеток, чувствительных к определенному типу интерферона и к индикаторному вирусу.

Наиболее часто используют следующие комбинации клетка/вирус:

линия клеток карциномы легкого человека А-549, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия клеток карциномы гортани человека Нер-2с, линия клеток фибробластов мыши L-929/ вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV);
клетки бычьих почек Madin-Darby MDBK, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия лимфоидных клеток человека Л-41, линия клеток карциномы легкого человека А-549, линия клеток фибробластов мыши L-929, линия клеток амниона человека WISH/ вирус везикулярного стоматита (VSV);
клетки фибробластов человека/ вирус леса Семлики (SFV), вирус Синдбис (virus Sindbis) или иные.

В качестве СО может быть использован международный стандартный образец активности интерферона соответствующего типа или стандартный образец, откалиброванный в Международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту.

Испытания проводят в асептических условиях.

Подготовка к испытаниям

Требования к клеточным линиям (общие условия культивирования и пересева клеток, пассаж, на котором клетки проявляют оптимальную эффективность при проведении испытания, допустимый предел жизнеспособности клеток при пересевах и при взятии клеточной суспензии в испытание, процент сформированного монослоя) указывают в нормативной документации.

Пробоподготовку испытуемых образцов проводят в соответствии с указаниями, приведенными в нормативной документации. Для некоторых лекарственных форм препаратов интерферона (суппозитории, мази, гели и т.д.) при пробоподготовке необходимо экстрагирование активного вещества (интерферона) в раствор, с соблюдением следующих условий: используемые реагенты не должны оказывать токсического действия на культуру клеток в разведениях, необходимых для исследования; использование реагентов для экстрагирования должно быть обоснованным.

Суспензию индикаторного вируса готовят в соответствии с указаниями в нормативной документации на лекарственное средство, содержащее интерферон. Титр вируса должен быть не менее 10 5 ТЦД/мл.

К составу питательных сред, предназначенных для культур клеток животных и человека, предъявляют определенные требования. Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Возможно использование стандартных коммерческих сред для ведения культур клеток: Игла MEM, МЕМ, DMEM (двойная модификация среды Игла), среды 199 , среды RPMI и др. Для стимуляции роста, прикрепления и деления клеток обычно добавляют 5 – 10 % инактивированной сыворотки коров/крупного рогатого скота. В среду для разведений интерферона добавляют 2 – 5 % сыворотки. Для обеспечения бактериологической стерильности в питательные среды вводят антибиотики: пенициллин (натриевая соль), стрептомицин (хлоркальциевый комплекс) из расчета 100—200 ЕД каждого на 1 мл среды , микостатин (нистатин) из расчета 20—25 ЕД на 1 мл или гентамицин (конечная концентрация 10 мкг/мл). Содержание L-глютамина в питательной среде должно быть около 292 мг/л.

В качестве поддерживающей среды обычно используют питательную среду без сыворотки с добавлением антибиотиков и L-глютамина.

Постоянство рН среды является одним из главных условий культивирования. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток.

Оценить количество жизнеспособных клеток возможно при помощи красителей: метиленового синего, кристаллического фиолетового, тиазолинового синего (МТТ), Аламара голубого и других.

Раздел 1. Специфическая активность

Противовирусную активность интерферона определяют путем сравнения защитного действия испытуемого препарата (ИП) с аналогичным действием стандартного образца активности интерферона (СО).

Определение специфической активности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток, полученном при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ в лунках 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов.

Количество клеток, вносимых в каждую лунку планшета, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя при вышеуказанных условиях культивирования в течение 24-48 ч.

Готовят серию разведений испытуемого препарата в среде для разведений интерферона с содержанием 2 – 5 % сыворотки (на 4 разведения выше и ниже предполагаемого титра активности). Параллельно готовят такие же разведения СО в среде для разведения интерферона. Рабочие разведения ИП и СО должны быть указаны в нормативной документации.

Из лунок планшетов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения ИП и соответствующего СО, используя на каждое разведение не менее 4-х лунок с культурой клеток.

Возможно внесение ИП и СО в лунки планшета до внесения культуры клеток. В этом случае клеточный монослой будет формироваться с внесённым интерфероном.

Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток – 4 лунки. В эти 20 лунок вносят поддерживающую среду.

96-луночные планшеты с культурой клеток, разведениями ИП и СО инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂. Затем в каждую лунку с ИП и соответствующим СО вносят вирусную суспензию, содержащую рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса — 100 ТЦД₅₀. В лунки контроля клеток вносят такой же объем поддерживающей среды.

Определение дозы индикаторного вируса начинают с установления его активности.

Для определения активности вируса-индикатора готовят десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде (от 10 -1 до 10 -8 ). Из лунок 96-луночного планшета с клеточным монослоем удаляют ростовую среду. После этого вносят в лунки планшета, используемые для определения дозы вируса, поддерживающую среду в объеме, равном объему испытуемого образца. Затем вносят приготовленные разведения индикаторного вируса (не менее, чем по 4 лунки на каждое разведение) в объеме, равном объему внесенной до этого поддерживающей среды. 96-луночный планшет с разведениями вируса инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂. За титр (активность) вируса принимают величину, обратную разведению вируса, при котором клеточный монослой в 50 % лунок оказался полностью пораженным цитопатическим действием. Титр вируса выражают в тканевых цитопатических дозах – ТЦД₅₀/мл.

Активность вируса вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:

Lg ED₅₀ – десятичный логарифм титра вируса;

D_max – десятичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100 % гибель клеток (+);

d — десятичный логарифм интервала между разведениями (=1,0);

n — число лунок, приходящееся на каждое разведение вируса (=4);

р — число лунок, давших гибель (+) в разведении, ниже которого произошла 100 % гибель клеток, и последующих разведениях.

После установления активности вируса производят подсчёт дозы для последующего внесения в лунки с испытуемым препаратом (100 ТЦД₅₀).

Одновременно с внесением вируса-индикатора осуществляют контроль взятой дозы вируса на 16-ти лунках с культурой клеток (по 4 лунки на каждое разведение вируса).

Вносят вирус, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД₅₀, и до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД₅₀ с коэффициентом разведения равным 10.

Лунки с культурой клеток для оценки состояния монослоя клеток остаются интактными.

После внесения индикаторного вируса в дозе 100 ТЦД₅₀ 96-луночный планшет инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ до появления первых признаков цитопатических изменений в клеточном монослое с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД₅₀. Монослой в лунках с 0,1 ТЦД₅₀ индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.

Учёт активности интерферона осуществляют через 24-48 ч при выполнении следующих условий:

доза внесённого вируса соответствует 100 ТЦД₅₀;
в лунках с клетками и минимальными концентрациями ИП и СО, зараженными индикаторным вирусом, наблюдается практически полный цитопатический эффект (80 -100 %);
в лунках с контролем клеток отсутствуют признаки дегенерации.

Учёт активности интерферона осуществляют визуально или инструментально.

производится микроскопически при 100-кратном увеличении через 24-48 ч после внесения индикаторного вируса. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50 % лунок полностью защищена от цитопатического действия вируса.

Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:

D_max – двоичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100 % защита (-);

d — двоичный логарифм интервала между разведениями (=1,0);

n — число лунок на каждую дозу (=4);

р — число лунок, давших защиту (-) в разведении, ниже которого произошла 100 % защита, и последующих разведениях.

Противовирусную активность интерферона (А_х) в исследуемом образце в МЕ вычисляют по формуле:

А_со — противовирусная активность СО интерферона в МЕ;

Инструментальный учет активности интерферона предполагает селективное окрашивание живых клеток, защищенных интерфероном от действия вируса, элюирование красителя, фотометрирование оптической плотности элюата и статистическую обработку результатов с помощью метода параллельных линий.

Как правило, результаты исследования снижения цитопатического эффекта соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ: зависимость значений оптической плотности элюата ИП и СО от логарифма их разведения.

При расчете активности интерферона по сигмоидальным кривым ИП и СО должны быть соблюдены следующие условия:

Измеренные оптические плотности для ИП и СО должны находиться в одном диапазоне оптических единиц, ограниченном значениями оптической плотности, измеренными в лунках контроля клеток и вируса;
Полученные данные должны отвечать требованиям к параллельности, линейности и величине угла наклона кривых доза-ответ для СО и ИП, указанным в нормативной документации.

Используя линейный участок графика, рассчитывают титр ИП и СО, а затем рассчитывают активность интерферона по формуле:

А_со — противовирусная активность СО интерферона в МЕ;

а_х — титр ИП, то есть разведение ИП, в котором наблюдается 50 %-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом;

а_со — титр СО, то есть разведение СО, в котором наблюдается 50 %-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом.

Описание инструментального метода приводят в нормативной документации.

Раздел 2. Подлинность

Подлинность препаратов интерферона определяют путем нейтрализации противовирусной активности ИП моно- или поликлональными антителами против соответствующего типа интерферона, предусмотренными в нормативной документации на препарат. Реакцию нейтрализации противовирусной активности ИП проводят в культуре клеток, чувствительных к данному типу интерферона, в присутствии индикаторного вируса.

Определение подлинности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток.

Количество клеток, вносимых в каждую лунку 96-луночных культуральных планшетов, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя в условиях культивирования при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ в течение 24-48 ч.

Нейтрализующие антитела разводят средой для разведения до концентраций, указанных в нормативной документации.

Для приготовления нейтрализованной смеси подготовленные разведения антител объединяют в равных объемах с рабочими дозами ИП и СО. Полученную смесь инкубируют при температуре (37±1) о С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ в течение 1 ч.

Из лунок 96-луночного планшета с монослоем культуры клеток удаляют ростовую среду, вносят в лунки планшета нейтрализованную смесь, не менее чем по 4 лунки на каждое разведение антител.

Нейтрализованную смесь допустимо вносить в лунки 96-луночного планшета как до внесения культуры клеток, так и после него.

Для оценки качества монослоя клеток в процессе постановки реакции нейтрализации (контроль) оставляют не менее 4 лунок, в которые не вносят нейтрализованную смесь. В этих лунках заменяют ростовую среду на поддерживающую.

Для контроля защитного действия интерферона также оставляют по 4 лунки на рабочие разведения СО и ИП без нейтрализующих антител.

Индикаторный вирус в дозе 100 ТЦД₅₀ вносят во все лунки 96-луночного планшета, кроме 4 лунок, предназначенных для контроля монослоя клеток.

После внесения индикаторного вируса в лунки с культурой клеток планшеты инкубируют при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД₅₀ (обычно в течение 24-48 ч). Монослой в лунках с 0,1 ТЦД₅₀ индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.

Учёт результатов осуществляют при выполнении следующих условий:

доза внесённого вируса соответствует 100 ТЦД₅₀;
отсутствуют признаки дегенерации в контроле клеток и в лунках с рабочими разведениями СО и ИП без нейтрализующих антител.

Нейтрализация активности испытуемого образца анти-интерфероновыми антителами в сравнении с СО в аналогичном разведении свидетельствует о том, что в испытуемом образце содержится интерферон соответствующего типа.

Подробное описание проведения реакции нейтрализации приводят в нормативной документации.

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вакцина оспенная живая ФС.3.3.1.0033.15

Взамен ГФ Х, ст.727

ФС 42-3133-95

Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину оспенную живую, применяемую в качестве иммунобиологического лекарственного препарата (ИЛП). Вакцина представляет собой лиофилизат, содержащий вирус осповакцины, выращенный на скарифицированной коже телят, частично освобожденный от бактериальной флоры обработкой хлоргексидина биглюконатом. Одна прививочная доза должна содержать не менее 10 6 ООЕ (оспообразующих единиц). Вакцина выпускается с растворителем — 50 % раствором глицерина, стабилизатор — пептон в конечной концентрации 5 — 10 %. Вакцина не содержит антибиотиков.

Вакцина предназначена для профилактики натуральной оспы по эпидемическим показаниям, вакцинации лиц, работающих с вирусами осповакцины и оспы животных, патогенными для человека.

ПРОИЗВОДСТВО

Все этапы производства вакцины должны быть валидированы в соответствии с установленными требованиями к правилам организации производства и контроля качества лекарственного препарата, гарантирующих его качество и безопасность для человека.

Этапы производства оспенной вакцины включают: получение оспенного соскоба с кожи телят; очистку оспенного соскоба от белка кожи телят центрифугированием; освобождение от микрофлоры путем обработки хлоргексидина биглюконатом; приготовление жидкой вакцины и внесение стабилизатора; розлив и герметизация ампул в атмосфере азота. В процессе производства обязательным является испытание качества исходных материалов, вакцинного штамма, ляпиновакцины I, II и III генераций посевного вируса. Также обязательным является определение содержания патогенных анаэробных микроорганизмов в 1 мл вакцины, которое необходимо проводить на производстве на этапе контроля готовой нерасфасованной продукции, до ее маркировки. Культивирование патогенных анаэробных микроорганизмов проводят в анаэробных условиях. Испытание должно проводиться с использованием питательных сред, пригодных для культивирования патогенных анаэробных микроорганизмов.

Определение проводят методом посева образцов вакцины на среду Тароцци с созданием анаэробных условий. Для испытания используют не менее 5 образцов препарата. Содержимое каждой ампулы с вакциной растворяют в 0,2 мл стерильного 0,004 М буферного фосфатно-цитратного раствора (ФЦБ) Мак-Илвейна.

Приготовление ФЦБ раствора Мак-Илвейна 0,004М (рН 7,2 – 7,4). Готовят растворы 1 и 2.

Раствор 1: Лимонная кислота – 2,1 г; Вода очищенная — 100 мл.

Раствор 2: В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяют 28,4 г натрия гидрофосфата безводного или 35,6 г натрия гидрофосфата дигидрата, или 71,6 г натрия гидрофосфата додекагидрата, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Смешивают 2 мл раствора 1 и 18 мл раствора 2 в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Полученный раствор должен иметь рН 7,2 – 7,4. Если рН полученного раствора более 7,4, его доводят до нормы раствором 1. В случае, если рН полученного раствора меньше 7,2, приготовление раствора повторяют. Буферный раствор стерилизуют при температуре (120 ± 1) °С и давлении (0,1 ± 0,01) МПа в течение 8 – 30 мин (в зависимости от объема) или фильтруют через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм и хранят при температуре от 2 до 8 °С. Срок хранения от 10 до 30 сут в зависимости от способа укупорки флаконов (способ укупорки флаконов должен быть указан в нормативной документации).

Гидролизат мяса (по Хоттингеру) а) – 250 мл;
Ликадекс ПФ декстрозы моногидрат – 5 г;
Натрия хлорид – 5 г;
Агар микробиологический – 1 г;
Фарш говяжий – 200 г;
Вода очищенная – 1000 мл.

рН готовой среды (7,3 ± 0,2).

Готовую среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при давлении (0,1 ± 0,01) МПа, температуре (120 ± 1) °С в течение 15 мин. Хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 мес.

а) Гидролизат мяса (по Хоттингеру):

Панкреатин 45 ед. – 20 г;
Фарш говяжий – 500 г;
Вода очищенная – 1000 мл.

Стерилизуют при давлении (0,1 ± 0,01) МПа, температуре (120 ± 1) °С в течение 15 мин. Хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 мес.

б) Фарш говяжий (на 1 кг).

Вырезка говяжья – 1,05 кг.

Хранению не подлежит.

Используемая питательная среда для культивирования патогенных анаэробных микроорганизмов должна обеспечивать рост соответствующих тест-штаммов. Обязательным условием при производстве препарата является определение посторонних примесей — хлоргексидина биглюконата, который используют в виде 0,5 % раствора для обработки шкур телят с оспенным детритом. Содержание примеси хлоргексидина биглюконата определяют в полуфабрикате на стадии получения оспенного соскоба. Содержание хлоргексидина биглюконата в полуфабрикате не должно превышать 0,05 % при определении спектрофотометрическим методом.

В качестве продуцентов для производства оспенной вакцины и посевного материала используют телят крупного рогатого скота в возрасте от 6 до 18 мес любой породы, предпочтительно светлой масти. Животные должны поступать из хозяйств, благополучных в отношении инфекционных агентов, в том числе прионовой природы. Каждая партия животных должна сопровождаться ветеринарным свидетельством, подтверждающим отсутствие инфекционных заболеваний. Все поступившие телята должны пройти 30-дневный карантин.

В качестве вакцинного штамма используют вирус осповакцины, штамм Л-ИВП, полученный путем накожных пассажей на кроликах и телятах вакцины, изготовленной из штамма Lister института Листера (Великобритания). Штамм Л-ИВП хранится в коллекции производственных штаммов на предприятии-изготовителе. Для поддержания стабильных свойств штамма проводят 1 пассаж исходного штамма на коже кролика. Материалом исходного штамма служит ляпино-вакцина III генерации. В результате пассирования исходного штамма на кроликах получают ляпину. Посевной вирус I генерации получают в результате пассажа ляпины на коже теленка. Посевной вирус II генерации получают путем пассажа посевного вируса I генерации на коже теленка. Для приготовления вакцины используют только ляпиновакцину III генерации. Взвесь посевного вируса должна отвечать следующим требованиям:

— может содержать суммарно не более 50 посторонних микроорганизмов в 1 мл, в том числе аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и грибов;
— не должна содержать бактерий семейства Enterobacteriaceae и вида Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, а также патогенных анаэробных бактерий;
— быть генетически однородной: допускается образование на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов (ХАО КЭ) не более 10 поражений поверхностного диффузного типа на 1000 типичных оспин (от 0,5 до 3 мм);
— на скарифицированной коже кроликов образовывать типичные вакцинальные поражения (оспины);
— не вызывать некрозы при внутрикожном введении кроликам 10 4 ООЕ/0,1 мл (ООЕ – оспообразующие единицы);
— не вызывать гибель кроликов при введении в мозг 10 4 ООЕ/0,1 мл;
— быть безвредной для морских свинок при введении подкожно 1 мл посевного вируса и для белых мышей при введении 0,2 мл посевного вируса подкожно;
— иметь специфическую активность не менее 1 10 9 ООЕ/мл.

Производственный штамм контролируется при получении каждой генерации посевного вируса.

ИСПЫТАНИЯ

Пористая масса от бело-серого до светло-желтого цвета, гигроскопичная.

Вакцина должна вызывать на хорионаллантоисных оболочках (ХАО) 12-дневных куриных эмбрионов образование белых плотных поражений диаметром от 0,5 до 3 мм (испытания проводят одновременно с испытанием специфической активности оспенной вакцины). Вызывать типичные вакцинальные поражения (оспины) при накожном введении кроликам. Испытание проводят на 2 белокожих кроликах породы Шиншилла массой от 2,5 до 3,5 кг. На предварительно депиллированные и скарифицированные участки кожи кроликов площадью около 5 см 2 наносят по 0,1 мл вакцины в разведениях 10 -3 , 10 -4 и 10 -5 . Для разведения используют 0,9 % раствор натрия хлорида. Испытания осуществляют параллельно со стандартным образцом активности специфичности и некротической активности оспенной вакцины.

Через 5 – 7 сут у животных обеих групп на зараженных участках кожи должны образовываться типичные вакцинальные поражения (оспины).

При неудовлетворительных результатах контроль повторяют, как при первичном испытании. При получении неудовлетворительных результатов при повторном испытании серию препарата бракуют.

Должна растворяться в 0,3 мл 50 % раствора глицерина в течение 1 мин при перемешивании стеклянной палочкой. После растворения вакцина должна представлять собой опалесцирующую жидкость от беловато-серого до светло-желтого цвета без осадка и посторонних включений. Определение проводят визуально.

Вакцину растворяют до первоначального объема, указанного на ампуле, стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида и вводят подкожно морским свинкам в объеме 1 мл, белым мышам в объёме 0,2 мл. Наблюдение за животными проводят в течение 7 сут. Все животные должны оставаться живыми, признаки интоксикации и уменьшение массы тела должны отсутствовать. В случае гибели или появления признаков интоксикации или снижения массы тела у 1 животного испытание повторяют.

Вакцина выдерживает испытание, если ни 1 животное из второй группы не погибнет, не появятся признаки интоксикации и не будет отмечено уменьшение массы тела.

Примечание. Куриные эмбрионы получают из хозяйств, свободных от вирусных и других возбудителей, патогенных для человека.

Контроль специфической активности вакцины проводят одновременно с определением специфической активности стандартного образца активности, специфичности и некротической активности оспенной вакцины.

Подготовка куриных эмбрионов. Проводят овоскопию куриных эмбрионов в затемненном помещении. Каждый эмбрион просматривают в направленном пучке света. Свет должен падать сверху на тупой конец яйца. Яйцо с погибшим эмбрионом, или имеющее кровоизлияние под оболочкой, бракуют. В центре воздушного мешка на тупом конце яйца и на боковой поверхности яйца на участке между сосудами и их ответвлениями карандашом делают отметку. В местах отметок с соблюдением правил асептики пропиливают бормашиной с абразивным диском отверстия (щели) длиной 3 – 4 мм и шириной 1,5 мм, не повреждая оболочки. Яйцо укладывают так, чтобы отверстие на боковой стороне было обращено вверх. Подскорлупную оболочку в центре воздушного мешка прорывают плоской полукруглой хирургической иглой. Затем на отверстие, расположенное на боковой поверхности, вносят 0,1 мл 0,004 М стерильного ФЦБ раствора Мак-Илвейна, подогретого до температуры (50 ± 5) °С, и той же иглой осторожно продавливают подскорлупную оболочку. После этого практически вся капля раствора проходит под подскорлупную оболочку и частично отслаивает ХАО.

Из отверстия в центре воздушного мешка резиновой грушей осторожно отсасывают воздух до полного опускания ХАО и создания искусственного воздушного мешка под боковой щелью. Для контроля наличия и величины искусственного воздушного мешка вновь проводят овоскопию и бракуют эмбрионы, имеющие кровоизлияния, воздушные мешки под ХАО или без искусственных воздушных мешков. Яйца с опущенной ХАО помещают на лотки отверстием вверх и выдерживают 2 ч в термостате при температуре (37 ± 1) °С. Затем проводят овоскопию повторно и бракуют эмбрионы с воздушными мешками под ХАО, без искусственных воздушных мешков и эмбрионы с кровоизлияниями.

Приготовление десятикратных разведений. Для приготовления разведений используют стерильный ФЦБ. Готовят 7 десятикратных разведений: в штатив устанавливают 7 пробирок, которые маркируют от 10 -1 до 10 -7 . В первую пробирку вносят 4 мл ФЦБ. В последующие 6 пробирок вносят по 4,5 мл ФЦБ. Вскрывают 2 ампулы с вакциной и растворяют их содержимое в 0,5 мл ФЦБ, взятом из первой пробирки с маркировкой 10 -1 . Полученный раствор из 2 ампул переносят пипеткой в пробирки с маркировкой 10 -1 . Этой же пипеткой тщательно перемешивают раствор в пробирке и переносят 0,5 мл в пробирку с маркировкой 10 -2 , не касаясь пипеткой жидкости, после чего меняют пипетку. Аналогичным образом готовят последующие разведения до разведения 10 -7 , меняя пипетки после каждого разведения.

Постановка основного опыта. Для заражения эмбрионов используют разведения вакцины 10 -6 и 10 -7 . Каждое разведение вируса вводят на ХАО 6 куриных эмбрионов по 0,1 мл в отверстие на боковой поверхности яйца. Круговым вращением яйца вирус равномерно распределяют по ХАО. Инокулированные эмбрионы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 42 – 48 ч. Затем эмбрионы вскрывают, разрезая скорлупу по длинной оси яйца, визуально определяют жизнеспособность куриного эмбриона. Изолируют пинцетом ХАО, промывают в воде и подсчитывают число оспин на каждой ХАО. Среднеарифметическое количество типичных оспин, развившихся на ХАО в учетном разведении, должно быть не менее 10. Специфическую активность вируса выражают в оспообразующих единицах в 1 мл (ООЕ/мл) и вычисляют по формуле:

среднее арифметическое число оспин на ХАО

объем инфицирующей дозы разведение вируса

Результат испытания серии вакцины принимают к учету при получении удовлетворительного результата определения специфической активности стандартного образца.

При получении неудовлетворительных результатов контроля серии вакцины проводят повторное испытание на удвоенном количестве образцов вакцины: разведение 10 -1 получают растворением содержимого 4 ампул вакцины в 8 мл ФЦБ.

При получении неудовлетворительных результатов при повторном испытании серию препарата бракуют.

Вакцина в дозе 10 4 ООЕ/0,1 мл не должна вызывать некрозы при внутрикожном введении кроликам. Испытание проводят на 2 белокожих кроликах породы Шиншилла массой от 2,5 до 3,5 кг. Шерсть на боках в местах предполагаемых прививок удаляют. Для проведения испытания вакцину разводят стерильным ФЦБ до содержания 10 3 ; 10 4 и 10 5 ООЕ в 0,1 мл. Каждое разведение вакцины вводят кролику внутрикожно по 0,1 мл в 2 участка. Для проверки чувствительности кроликов к вирусу осповакцины тем же кроликам аналогичным образом на другом боку вводят по 0,1 мл растворы стандартного образца активности, специфичности и некротической активности оспенной вакцины с концентрацией 10 3 ; 10 4 и 10 5 ООЕ/0,1мл. Наблюдение за животными проводят в течение 4 — 5 сут.

Учет результатов. В местах инъекций вируса в дозе 10 4 ООЕ/0,1 мл не должны образовываться некрозы. Допустимо наличие ограниченных инфильтратов розового цвета. При появлении некрозов в дозе 10 4 ООЕ/0,1 мл хотя бы у 1 кролика и их отсутствие при введении стандартного образца испытание повторяют. При развитии некрозов после повторного испытания хотя бы у 1 кролика вакцину бракуют. При наличии некрозов в опыте со стандартным образцом активности, специфичности и некротической активности оспенной вакцины контроль повторяют.

При получении неудовлетворительных результатов при повторном испытании серию препарата бракуют.

Примечание. При необходимости экстренного контроля допускается прогревание вакцины при температуре (61 ± 1) °С в течение 5 ч.

Растворитель, выпускаемый в комплекте с препаратом

Растворитель – 50 % раствор глицерина, готовят из глицерина на 0,004 М ФЦБ растворе Мак – Илвейна .

Прозрачная бесцветная сиропообразная жидкость без запаха.

Должен давать характерную реакцию на трехатомный спирт. К 3 мл растворителя прибавляют 10 капель 10 % раствора меди сульфата и 0,2 мл 10 % раствора натрия гидроксида, должно появиться синее окрашивание, не изменяющееся при кипячении.

При температуре от 2 до 8 °С. Допускается однократное кратковременное транспортирование при температуре от 9 до 20 °С (не более 24 ч).

Читайте также: