Исследование мутаций гепатит в

БАРСЕЛОНА, Испания, 14 апреля 2016 / Москва, 5 мая 2016 — глобальная биофармацевтическая компания AbbVie (NYSE: ABBV) объявила результаты исследования среди пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХСГ) генотипа 1, получавших рекомендованную схему терапии Викейра Пак (омбитасвир/паритапревир/ритонавир в таблетках, дасабувир в таблетках) с или без рибавирина (РБВ), которые продемонстрировали достижение высокого уровня устойчивого вирусологического ответа на терапию через 12 недель после ее окончания (УВО12), несмотря на наличие исходных резистентных вариантов[1]. Эти недавно полученные результаты ретроспективного анализа пяти завершенных клинических исследований Фазы III представлены на Международном конгрессе по вопросам заболеваний печени 2016 в Барселоне (Испания).

По результатам исследований было выявлено, что, независимо от наличия или отсутствия определенных мутаций в регионе NS5A, 100% (n=148/148) пациентов с хроническим вирусным гепатитом С генотипа 1b, получавших Викейра Пак без рибавирина в течение 12 недель, достигли устойчивого вирусологического ответа (УВО12).1 Также результаты продемонстрировали, что 97% пациентов с хроническим вирусным гепатитом С генотипа 1a с или без исходных мутаций NS5A (n=57/59 и n=351/361 соответственно) достигли устойчивого вирусологического ответа УВО12 при лечении Викейра Пак с рибавирином.1 Полученные результаты исследований относятся как к пациентам, не проходившим терапию, так и ранее получавшим лечение пегилированным интерфероном/рибавирином (ПегИФН/РБВ), включая пациентов с компенсированным циррозом[1].

В результате репликации вируса гепатита С возникают мутации гена вирусного белка NS5A.2 Роль этих мутаций в достижении ответа на терапию, включая возможность развития резистентности к терапии или достижения устойчивого вирусологического ответа, еще полностью не определена[3].

Для исследования влияния резистентных вариантов на эффективность терапии было использовано секвенирование нового поколения с целью оценки образцов исходного уровня мутаций NS5A. Они были обнаружены у 11% пациентов с ХГС генотипа 1a и 19% пациентов с ХГС генотипа 1b с 15% порогом чувствительности.1 Был проведен ретроспективный анализ данных из пяти завершенных исследований Фазы III: [1] PEARL-IV (генотип 1а, пациенты ранее не получавшие лечение, n=90), SAPPHIRE-II (генотип 1a, пациенты, ранее получавшие лечение pegIFN/RBV, n=214), TURQUOISE-II (генотип 1a, пациенты с компенсированным циррозом – группа пациентов, получавших лечение в течение 24 недель, n=118), PEARL-II (генотип 1b, пациенты, ранее получавшие лечение pegIFN/RBV, n=89) и TURQUOISE-III (генотип 1b, пациенты с компенсированным циррозом, n=59). Пациенты, не достигшие устойчивого вирусологического ответа по причинам, не относящимся к вирусологической неудаче (к примеру, преждевременное завершение лечения или недостаточность данных об устойчивом вирусологическом ответе УВО12), были исключены из анализа.

Дополнительная информация о препарате Викейра Пак

Терапия Викейра Пак была исследована среди различных типов пациентов с хроническим вирусным гепатитом С 1-го генотипа, включая пациентов, которые ранее не получали терапию, а также пациентов, которые сложно поддаются лечению, такие как пациенты с компенсированным циррозом печени (легкая степень, класс А по Чайлд-Пью), пациенты с ко-инфекцией хронического гепатита С и ВИЧ-1, пациенты после трансплантации печени с нормальной функцией печени и умеренным фиброзом, а также те пациенты, которым ранее не помогло лечение пегилированным интерфероном и рибавирином. Викейра Пак противопоказан пациентам с умеренной и тяжелой печеночной недостаточностью (классы B и С по Чайлд-Пью) в связи с риском токсического воздействия.

Викейра Пак включает фиксированную комбинацию 25 мг омбитасвира (ингибитор NS5A), 150 мг паритапревира (ингибитор протеазы NS3/4A) и 100 мг ритонавира, применяемых один раз в сутки, а также 250 мг дасабувира (ненуклеозидный ингибитор полимеразы NS5B), который применяется два раза в сутки. Викейра Пак принимается на протяжении 12 недель, за исключением части пациентов с ХГС генотипа 1a и компенсированным циррозом печени, которым требуется терапия в течение 24 недель. Рибавирин принимается совместно с Викейра Пак для лечения пациентов с ХГС генотипа 1а, а также пациентов с циррозом печени или после трансплантации печени.

Паритапревир был обнаружен в ходе продолжающегося сотрудничества между компаниями AbbVie и Enanta Pharmaceuticals в области исследований ингибиторов протеаз вируса гепатита С и схем терапии, которые включают ингибиторы протеазы.

1 Саррацин и другие. Воздействие вариантов исходного уровня, обуславливающих устойчивость вирусологического ответа при 3D режиме лечения с и без рибавирина у пациентов с ВСГ генотипа 1a и 1b. Абстракт #LBP503; представлен на Международной конференции печени Европейской Ассоциации по изучению вопросов печени в Барселоне, 13-17 апреля, 2016 г.

Введение. Множество противоречий вызвало исследование, сфокусированное на соотношении мутаций, таких как Пре-S, базального промотора ядра (BCP), ЭнхансерII (EnhII) и, особенно, преядерных, в геноме вируса гепатита В (HBV) с риском развития гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). В связи с увеличением в последнее время генетических исследований роли вирусов гепатита в развитии ГЦК, для объективной оценки корреляции был проведен настоящий мета-анализ.

Методы. Был проведен поиск в обычно использующихся базах данных литературы на английском и китайском языках по источникам, опубликованным до 1 февраля 2012 года. Мета-анализ был проведен в основной и случайной эффективных моделях с использованием STATA 10.0. Погрешность была уменьшена методами Эггера и Бегга

Результаты. В общей сложности были изучены 85 контролируемых исследований с участием 16 745 HBV-инфицированных пациентов, из которых у 5781 развилась ГЦК. Статистически значимые корреляции наблюдались в преядерных мутациях G1896A (OR=1,46, 95% доверительный интервал [ДИ]=1.15-1.85, POR=0,002), G1899A (OR=3.13, 95% CI=2.38-4.13, PORВСР- двойной мутацией A1762T/G1764A, T1753V, C1653T и ГЦК. При анализе подгрупп выяснилось, что азиаты с генотипом C или HBeAg-положительные пациенты со сходными мутациями более склонны к развитию ГЦК. Кроме того, мутации G1896A и BCP-двойная мутации могут быть связаны с быстрым прогрессированием заболевания печени.

При разделении больных на две группы с четырьмя вариантами печеночной патологии: ГЦК и рак печени, хронический гепатит и бессимптомное носительств; было обнаружено, что при более серьезных заболеваниях печени выше частота мутаций вируса гепатита В. При BCP-двойной мутации было обнаружено 5,46-кратное увеличение риска развития злокачественной опухоли печени, при T1753V - 2,77-кратное и 2,59-кратное при C1653T. Преядерная мутация G1896A связана с прогрессирующими болезнями и коррелирует с 1,85-кратным увеличением риска более выраженной клинической картины заболевания. Кроме того, отмечена корреляции этих мутаций со скоростью прогрессирования болезни печени. На основании этого можно заключить, что эти мутации будут иметь накопительный эффект в развитии заболеваний печени и, следовательно, более высокую частоту встречаемости мутаций можно наблюдать при злокачественных опухолях печени. Таким образом, эти мутации могут способствовать прогрессированию заболевания печени, помимо их влияния на возникновение ГЦК.

Тем не менее, исследование имеет ряд ограничений. Во-первых, в анализ включили большое количество исследований, и неизбежно существуют неоднородности, которые нельзя легко устранить. Таким образом, была принята модель случайных эффектов. При выполнении анализа на чувствительность не было изменено соотношение случаев, что не повлияло на точность полученных результатов. Во-вторых, при настройке на гетерогенность, были исключены случаи по методу Гэлбрейта и в процессе исключения, могли иметь место дополнительные смещения. В-третьих, в анализе подгрупп участвовало только несколько исследований, и доказательства казались недостаточными и неубедительными. В-четвертых, поскольку лишь немногие исследования включали оценку комбинации эффектов этих мутаций на ГЦК, не суммировался общий эффект комбинации этих мутаций. Наконец, были использованы только данные, опубликованные на английском или китайском языках, и таким образом, имеет место потенциал смещения. Учитывая эти ограничения, следует с осторожностью интерпретировать результаты исследования.

Несмотря на эти ограничения, исследование показывает, что преядерные G1896A мутации в значительной степени связаны с увеличением риска развития ГЦК и прогрессированием заболеваний печени, особенно у выходцев из Азии. Кроме того, G1899A, Pre-S1 и Pre-S2 делеции, а также другие распространенные мутации, как BCP-двойная мутация A1762T/G1764A, T1753V и C1653T коррелируют с риском ГЦК. Анализ подгрупп все еще нуждается в больших масштабах и хорошо продуманных исследованиях. Причины развития гепатоцеллюлярной карциномы могут быть отнесены к нескольким факторам, известное является лишь верхушкой айсберга. Будущие исследования могут быть сфокусированы на взаимодействии эпигенетических влияний, а также генетических вариаций. Конечно, во внимание стоит принимать окружающую среду и другие внешние факторы.

Выводы. Преядерные мутации G1896A, G1899A, делеции в Пре-S зоне, а также другие часто встречаются мутации связаны с повышением риска развития ГЦК, особенно у азиатов, и может прогнозировать быстрое прогрессирование болезни печени.

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Елпаева Екатерина Александровна, Писарева Мария Михайловна, Никитина Олеся Евгеньевна, Кижло Светлана Николаевна, Грудинин Михаил Павлович

Целью исследования явилось определение распространенности генотипов вируса гепатита В , циркулирующих в Северо-Западном регионе России (Санкт-Петербурге, Ленинградской области и Республике Карелия), выявление мутаций, ответственных за развитие устойчивости к аналогам нуклеозидов/нуклеотидов, а также preS/S-мутаций , влияющих на синтез HBsAg и течение хронического гепатита В. Обследовано 579 больных ХГВ на наличие ВГВ в крови и/или ткани печени, генотип определен у 226 больных, секвенирование фрагмента гена полимеразы выполнено у 49 пациентов, особенности клинического течения ХГВ изучены у 67 больных у 26 с HBsAg и у 41 с серологическими признаками preS/S-мутаций . Вирусная ДНК выявлена у 323 (55,8 %) больных ХГВ, генотип D обнаружен у 183 (81,0 %), генотип А у 37 (16,4 %) и микст D+А у 6 (2,7 %) пациентов. Среди 49 пациентов первичные, вторичные и паттерн-мутации устойчивости к аналогам нуклеозидов выявлены у 14 (28,6 %) пациентов, данные мутации вызывали рецидив HBV-инфекции. PreS/S-мутации , ответственные за исчезновение HBsAg, выявлены у 2 (4,1 %) пациентов. PreS/S-мутантная вирусная инфекция при длительном течении ХГВ (>20 лет) вызывала прогрессирование некротически-воспалительного и фибротического процессов в печени и трансформацию гепатита в цирроз печени. Оценка генетической структуры вируса гепатита В имеет важное значение для диагностики, противовирусного лечения и прогнозирования клинического течения хронического гепатита В.

ROLE OF HEPATITIS B VIRLJS MIJTANT FORMS IN PROGRESSIVE COURSE OF CHRONIC HEPATITIS B

The aim of the study was to determine the prevalence of HBV genotypes in the North-West of Russia (St. Petersburg, Leningrad region, and Republic of Karelia), to identify mutations responsible for resistance to nucleotide/nucleoside analogs (AN), preS/Smutations, canceling the HBsAg synthesis, and to detect the preS/S-mutations influence on the CHB course. HBV was analysed in plasma and/or in the liver biopsy materials of 579 patients with CHB; the genetic type was revealed in 226 patients; sequence analysis of polymerase gen was performed in 49 patients; peculiarities of CHB clinical course were studied in 67 patients: in 26 with HBsAg and in 41 patients with serological marker of preS/S-mutations . Viral DNA was detected in 323 (55,8 %) CHB patients, D genotype was revealed in 183 (81,0 %), A genotype in 37 (16,4 %) and mixed D+А in 6 (2,7 %) patients. Primary, secondary and pattern-mutations of resistance to drugs (nucleotide/nucleoside analogs) were detected in 14 (28,6 %) from 49 patients. These mutations caused the HBV-infection relapse. PreS/S-mutations , responsible for the HBsAg disappearance, were revealed in 2 (4,1 %) patients. PreS/S-mutation viral infection caused progressive liver necroinflammation, fibrosis, and transformation of CHB in liver cirrhosis after more than 20 years of clinical course. The estimation of the viral genetic structure has special significance for diagnosis, antiviral treatment, and prognosis of chronic hepatitis B clinical course.

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ ПЕТРОЗАВОДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

Медицинские науки 2014

ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЕЛПАЕВА

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии, НИИ гриппа Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) elpaevak@gmail. com

МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ПИСАРЕВА

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии, НИИ гриппа Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) pisareva@influenza. spb. ru

ОЛЕСЯ ЕВГЕНЬЕВНА НИКИТИНА кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отделения экспериментальных научных исследований, НИИ гриппа Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) nikitina@influenza. spb. ru

СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА КИЖЛО зав. отделением, Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (Санкт-Петербург, Российская Федерация) skizhlo@yandex.ru

МИХАИЛ ПАВЛОВИЧ ГРУДИНИН

кандидат биологических наук, зав. лабораторией молекулярной вирусологии и генной инженерии, НИИ гриппа Минздрава России (Санкт-Петербург, Российская Федерация) grudinin@influenza.spb.ru

ОЛЬГА ПЕТРОВНА ДУДАНОВА доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней медицинского факультета, Петрозаводский государственный университет (Петрозаводск, Российская Федерация) odudanova@gmail.com

РОЛЬ МУТАНТНЫХ ФОРМ ВИРУСА ГЕПАТИТА В В ПРОГРЕССИРУЮЩЕМ ТЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА В

Целью исследования явилось определение распространенности генотипов вируса гепатита В, циркулирующих в Северо-Западном регионе России (Санкт-Петербурге, Ленинградской области и Республике Карелия), выявление мутаций, ответственных за развитие устойчивости к аналогам нуклеозидов/нуклеотидов, а также preS/S-мутаций, влияющих на синтез HBsAg и течение хронического гепатита В. Обследовано 579 больных ХГВ на наличие ВГВ в крови и/или ткани печени, генотип определен у 226 больных, секвенирование фрагмента гена полимеразы выполнено у 49 пациентов, особенности клинического течения ХГВ изучены у 67 больных - у 26 с HBsAg и у 41 - с серологическими признаками preS/S-мутаций. Вирусная ДНК выявлена у 323 (55,8 %) больных ХГВ, генотип D обнаружен у 183 (81,0 %), генотип А - у 37 (16,4 %) и микст D+А - у 6 (2,7 %) пациентов. Среди 49 пациентов первичные, вторичные и паттерн-мутации устойчивости к аналогам нуклеозидов выявлены у 14 (28,6 %) пациентов, данные мутации вызывали рецидив HBV-инфекции. PreS/S-мутации, ответственные за исчезновение HBsAg, выявлены у 2 (4,1 %) пациентов. PreS/S-мутантная вирусная инфекция при длительном течении ХГВ (>20 лет) вызывала прогрессирование некротически-воспа-лительного и фибротического процессов в печени и трансформацию гепатита в цирроз печени. Оценка генетической структуры вируса гепатита В имеет важное значение для диагностики, противовирусного лечения и прогнозирования клинического течения хронического гепатита В.

Ключевые слова: вирус гепатита В, генотипы, мутации лекарственной резистентности, preS/S-мутации, хронический гепатит В, секвенирование

Хронический гепатит В является одной из глобальных проблем мирового здравоохранения. В мире вирусом гепатита В (ВГВ) инфицированы около 350 миллионов человек, и около миллиона носителей вируса ежегодно умирает от печеноч-

ной недостаточности, цирроза печени и гепато-целлюлярной карциномы. Основные успехи в лечении хронического гепатита B (ХГВ) связаны с развитием знаний о молекулярно-биологических особенностях вируса [5], [8], [13]. Одним из на-

Е. А. Елпаева, М. М. Писарева, О. Е. Никитина, С. Н. Кижло, М. П. Грудинин, О. П. Дуданова

иболее важных факторов, влияющих на тяжесть течения болезни и эффективность противовирусного лечения, является генотип вируса и структура его генома, которая подвержена постоянным изменениям в результате мутаций [16].

В настоящее время выделяют десять генотипов ВГВ - A-J генотипы [6], [7], [12], [17]. Отмечается зависимость частоты носительства ВГВ, частоты хронизации гепатита, путей передачи вируса, клинического течения ХГВ и эффективности противовирусной терапии (ПВТ) от генотипов вируса [6]. Информации в литературе о распространенности различных генотипов ВГВ на территории Российской Федерации недостаточно, и данная проблема требует дальнейшего изучения [1], [2], [3], 4].

Генетическая гетерогенность вирусной популяции у пациента обусловлена двумя ключевыми факторами: противостоянием вируса иммунной системе хозяина и воздействием ПВТ. Так, под воздействием иммунного прессинга формируются ргеС/С и preS/S-мутации, приводящие к снижению и/или прекращению синтеза вирусных антигенов (HBeAg, HBsAg), а под влиянием противовирусных препаратов - аналогов нуклео-зидов/нуклеотидов (АН) - происходит возникновение мутаций в гене полимеразы и развивается лекарственная резистентность. В связи с этим чрезвычайную важность для верификации гепатита В, определения клинического течения заболевания и назначения своевременного лечения представляют данные о структуре генома ВГВ.

В последовательности полимеразы ВГВ содержится YMDD-мотив, замены в котором играют основную роль в формировании устойчивости вируса к АН - ламивудину (ЛАМ), адефовиру (АДФ), энтекавиру (ЭТВ), телбивудину (ТБВ). Ус -тойчивость к ламивудину связана с мутациями, приводящими к заменам в полимеразном белке М204У, L180M и др., устойчивость к адефовиру - к заменам N236T, A181V, к энтекавиру - I169T, M250V, T184G, S202I, к телбивудину - M204I/V [14], [15]. Данные изменения генетической структуры вируса не только снижают эффективность лекарственного контроля репликации вируса, но могут усиливать резистентность и изменять клиническое течение ХГВ.

Поскольку геном ВГВ имеет перекрывающиеся рамки считывания, мутации в полимеразном гене могут изменять свойства поверхностных белков. PreS/S-мутации, возникающие самостоятельно или сочетающиеся с полимеразными мутациями, также способны влиять на серологические и клинические особенности ХГВ. Они приводят к изменению структуры HBsAg, снижению или прекращению его секреции из гепатоцита, что, с одной стороны, затрудняет этиологическую верификацию ХГВ, а с другой -способствует развитию окислительного стресса, воспалению, ядерному увеличению числа цирку-

лярно замкнутых вирусных ДНК, развитию мутаций и раковой трансформации гепатоцитов на поздних стадиях ХГВ [9], [10], [11]. Клиническое значение preS/S-мутаций ВГВ остается неясным, в связи с чем данная проблема требует всестороннего изучения.

Целью исследования явилось определение распространенности генотипов ВГВ, циркулирующих в России на территории Санкт-Петербурга (СПб), Ленинградской области (ЛО) и Республики Карелия (РК) в период 2008-2013 годов, выявление мутаций, ответственных за развитие устойчивости к АН, а также preS/S-мутаций, влияющих на синтез HBsAg и течение ХГВ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Особенности клинического течения ХГВ изучены у 67 пациентов с ХГВ. Оценивались печеночные тесты: уровень аланинаминотрансфера-зы (АЛАТ), аспартатаминотрансферазы (АСАТ), альбумина, гамма-глобулинов, IgA, IgM, IgG, щелочной фосфатазы (ЩФ). Определялся индекс гистологической активности (ИГА) по Knodell с оценкой паренхиматозного повреждения (ПП) (1-4 балла), портального воспаления (ПВ) (1-4 балла), перипортальных некрозов (ПН) (1-10 баллов) и фиброз (Ф) по Metavir (0-4 балла).

Роль мутантных форм вируса гепатита В в прогрессирующем течении хронического гепатита В

Протокол исследования выполнялся согласно Хельсинкской декларации, от всех пациентов было получено информированное согласие на исследование. Оценивались t-критерий Стьюдента, тест Манна - Уитни, статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета Statistica 6.

Среди обследованных 579 пациентов хроническим гепатитом ВГВ был выявлен у 323 (55,8 %). У пациентов из СПб и ЛО ВГВ был определен у 256 (50 %) человек, кроме этого были выявлены случаи инфицирования несколькими гепатовирусами: у 21 (4 %) пациента - сочетанное инфицирование ВГВ и вирусом гепатита С, у 5 (1 %) - ВГВ и вирусом гепатита D. Уровень вирусной нагрузки у этих пациентов был преимущественно низкий: менее 104 копий/мл у 161 (62,9 %) больного, 104-106 - у 29 (11,3 %) и лишь у 40 (15,6 %) он составлял более 106 копий/мл. У пациентов из Карелии ВГВ был обнаружен у всех 67 (100 %) пациентов: у 26 - в сыворотке крови и ткани печени, вирусная нарузка у них составила 2,9 ± 0,8*104 копий/мл, у 41 пациента -только в ткани печени.

Генотип ВГВ был определен у 226 (70,0 %) пациентов: у 203 (79,3 %) из СПб и Ло и у 23 (34,3 %) из РК (табл. 1). Наиболее распространенным в СПб и ЛО оказался ВГВ генотипа D (у 163 (80,2 %) больных), для которого характерна более низкая вирусная нагрузка. В Карелии также преобладал ВГВ генотипа D - у 20 (87,0 %) пациентов. В целом доля генотипа D в структуре больных ХГВ составила 81,0 %, доля генотипа А была существенно ниже - 16,4 %.

Распределение генотипов вируса гепатита В среди больных ХГВ в Санкт - Петербурге,

Ленинградской области и Республике Карелия

Генотип / Регион D A A+D ни А, ни D Все- го, чел.

чел. % чел. % чел. % чел. %

Санкт-Петербург и Ленинградская область 163 80,2 35 17,2 5 2,5 0 0 203

Респуб- лика Карелия 20 87,0 2 8,7 1 4,3 0 0 23

Всего 183 81,0 37 16,4 6 2,7 0 0 226

Для определения мутаций устойчивости к АН методом секвенирования по Сенжеру у 49 человек (30 из СПб и ЛО, 19 - из РК) была определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена полимеразы. Полученные последовательности гена и предсказанные последовательности полимеразного и поверхностных белков сравнены с референсными из международной базы данных GenBank.

Мутация устойчивости rtM204I/V (rt - reverse transcriptase) была обнаружена лишь у одного человека. Интересно отметить, что у этого пациента было зарегистрировано изменение аминокислотной последовательности под воздействием терапии ламивудином. В 2006 году ему была проведена трансплантация печени с неверифицированным гепатитом, с 2007 года был выявлен HBsAg, в связи с чем он последовательно получал ламиву-дин и телбивудин. После приема в течение года ламивудина были выявлены замены rtM204I и rtN236K, еще через шесть месяцев лечения ламивудином были обнаружены замены rtM204V, rtL80I, rtL180M, rtA181V и rtN236K, после 14 месяцев лечения телбивудином были определены замены rtM204V, rtV173L, rtL180M, rtA181C. С 2012 года пациент получал 1 мг энтекавира, в результате чего выявлялась волнообразная вире-мия и лишь после добавления тенофовира вирусная нагрузка снизилась до уровня менее 300 копий/ мл. У других 13 пациентов также были выявлены первичные (приводящие к развитию лекарственной устойчивости) и вторичные (компенсаторные) мутации устойчивости к АН и паттерн-мутации устойчивости к противовирусным препаратам (табл. 2). Всего различные мутации в гене полимеразы были выявлены у 14 (28,5 %) пациентов.

Первичные и вторичные мутации гена полимеразы, потенциально ответственные за устойчивость к противовирусным

Аминокислотные замены Санкт- Петер- бург Респуб- лика Каре- лия Устойчи-вость к АН

Определение мутаций устойчивости вируса гепатита В к противовирусным препаратам

Лекарственная устойчивость (резистентность) – природная или приобретенная способность возбудителя болезни сохранять жизнедеятельность при воздействии на него лекарственных средств. Как правило, лечение ХГВ проводится с применением аналогов нуклеозидов/нуклеотидов – ингибиторов РНК-зависимой ДНКполимеразы (обратной транскриптазы), которая кодируется Р-геном ВГВ. Противовирусный препарат встраивается в вирусный геном в процессе обратной транскрипции, и конкурентно ингибирует вирусную репликацию, т. о. эти лекарственные препараты эффективно снижают вирусную нагрузку у больных ХГВ. При возникновении некоторых точечных мутаций в Р-гене ВГВ аналоги нуклеозидов/нуклеотидов теряют способность встраиваться в растущую цепь ДНК вследствие конформационного изменения локуса связывания обратной транскриптазы. Мутации лекарственной устойчивости подразделяются на:

основные (первичные) – мутации, снижающие чувствительность к противовирусному препарату;
компенсаторные (вторичные) – мутации, которые компенсируют функциональные дефекты активности полимеразы, связанные с появлением первичной мутации.

Мутации устойчивости определяются по номеру позиции аминокислоты в домене обратной транскриптазы, причем аминокислота дикого типа указывается слева от номера аминокислоты, вариант мутации устойчивости – справа. Например, M204I – замена метионина, аминокислоты дикого типа, в 204 положении домена обратной транскриптазы на аминокислоту изолейцин, наличие которой в данной позиции ассоциировано с возникновением мутации лекарственной устойчивости.

Информация о наличии мутаций лекарственной устойчивости в геноме ВГВ необходима при выборе препаратов противовирусной терапии у пациентов, ранее получавших аналоги нуклезидов/нуклеотидов.

Показания к обследованию

Исследование предназначено для больных ХГВ в определенных случаях перед началом противовирусной терапии и во время приема противовирусных препаратов (Табл. 8).

Критерии назначения исследований для определения устойчивости ВГВ к противовирусным препаратам

Стадия ПВТ	Характеристика пациента	Назначение исследования
До начала ПВТ	Пациент лечения ранее не получал	Нет
	Ранее прерванное лечение	Да
	Неудачное лечение	Да
Во время приема ПВП	Первичная резистентность (12 неделя ПВТ)	Да*
Во время приема ПВП	Вирусологичесий рецидив	Да

*Если пациент сохраняет приверженность к лечению.

Материал для исследования Плазма крови.

Методы лабораторных исследований

В клинической диагностике определение мутаций устойчивости вируса гепатита В к противовирусным препаратам включает ПЦР-амплификацию ревертазного домена Р-гена ВГВ и последующий анализ специфичных нуклеотидных последовательностей методами:

прямого секвенирования амплифицированного фрагмента. Данный метод способен выявлять мутации устойчивости, если доля популяции вируса с мутацией составляет более 20%. Метод позволяет идентифицировать все мутации, включая дополнительные потенциальные компенсаторные и новые неизвестные;

Особенности интерпретации результатов

В результате проведенного исследования врач получает информацию по каждой аминокислотной позиции, ассоциированной с мутацией лекарственной устойчивости, и клиническую интерпретацию результатов исследования:

ВГВ может быть устойчив к определенному противовирусному препарату, т. е. в ревертазном домене Р-гена ВГВ выявлены основные мутации устойчивости к этому препарату;
ВГВ может быть чувствителен к противовирусному препарату, т. е. мутации устойчивости не обнаружены;
у ВГВ возможно возникновение устойчивости к противовирусному препарату, т. е. выявлены только компенсаторные (вторичные) мутации устойчивости к этому препарату, основных мутаций не обнаружено.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

М.И. МИХАЙЛОВ, член-корреспондент РАЕН, профессор, руководитель лаборатории.
В соавторстве с Т.А. СЕМЕНЕНКО. Гепатит В - широко распространенная вирусная инфекция, в клинически выраженных случаях характеризуется симптомами острого поражения печени и интоксикации, отличается многообразием клинических проявлений и исходов заболевания (выздоровление, развитие хронического гепатита, цирроза и рака печени).

Для исследователя, занимающегося вирусными инфекциями человека, гепатит В представляет особый интерес. Отвечая на вопрос, почему это так, можно привести следующие основные доводы:
- вирус гепатита В (HBV) - самый изменчивый ДНК-содержащий вирус;
- разнообразие антигенов вируса и антител к ним позволяет проводить диагностику, предсказание характера течения и исходов заболевания и профилактику постгрансфузионного гепатита, при этом требуя новых, наиболее информативных тестов индикации;
- множественность путей передачи возбудителя, определяющих его глобальное, но неравномерное распространение, что вызывает повышенный интерес эпидемиологов;
- существующие параллели между гепатитом В и ВИЧ-инфекцией делают правомерным определение, сформулированное как "гепатит В - кузина ВИЧ", заставляя организаторов здравоохранения разрабатывать новые подходы в работе;
- HBV - этиологический агент первичного рака печени.

Кроме того, наличие эффективной вакцины против гепатита В и ее применение позволяют получить удовлетворение от работы, реально ощущая воможность защиты людей от этой страшной инфекции.

Вирус, его размножение и мутантные формы

HBV - основной представитель семейства гепаднавирусов, от "hepar" - печень; "dna" - ДНК. Помимо вируса гепатита В человека в это семейство входят вирусы гепатита сурков, земляных белок, сусликов, пекинских уток и других животных. Объединяющие характеристики этих вирусов: сходное строение; циркулярная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК); общая стратегия размножения вируса; преимущественное размножение в клетках печени; возможность длительной (иногда пожизненной) циркуляции вируса в организме; взаимосвязь с развитием первичного рака печени.

Частицы вируса гепатита В представляют собой сферические частицы размером 42 нм, имеющие ядро и оболочку, состоящую из поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Информация о вирусных антигенах и белках, необходимых для его существования, заключена в небольшой (всего 3200 нуклеотидов) двуцепочечной кольцевой молекуле ДНК. В ней выделяют 4 гена - несущих информацию о HBsAg (S-ген); ядерном антигене - НВсАд (С-ген), ферменте ДНК - полимеразе (Р-ген) и Х-белке (Х-ген).

Заражение гепатитом В происходит при непосредственном попадании вируса в кровь, через слизистые оболочки или поврежденные кожные покровы. Считается, что любой человек, не имеющий антител к HBsAg, может заболеть гепатитом В. Чрезвычайно высокая инфекционность вируса (некоторые образцы сывороток крови с наличием HBV могут вызвать заболевания в разведениях 10 -7 - 10 -8 и устойчивость к различным физико-химическим воздействиям определяют широкое распространение гепатита В. Достигая по кровеносным сосудам клеток печени, вирус адсорбируется на их поверхности. Изучение механизма адсорбции и проникновения в клетку позволило выявить несколько специфических рецепторов на HBsAg и гепатоците. Помимо рецепторов, информация о которых заложена непосредственно в ДНК вируса (Pre-S1 и Pre-S2), в процессе адсорбции принимает участие печеночный белок аннексии V. В последние два года определено, что процесс адсорбции и проникновения вируса гепатита В представляет собой сложный механизм, вовлекающий несколько клеточных белков. Кроме того, установлено, что размножение вируса гепатита В может происходить не только в гепатоцитах, но и в других клетках организма человека: клетках крови, селезенки, поджелудочной железы и др.

Из всех известных ДНК-содержащих вирусов человека вирус гепатита В имеет самый сложный цикл размножения. Для того, чтобы получить новые вирусные частицы, репликация ДНК включает в себя дополнительный этап, когда с ДНК синтезируется РНК и лишь только с нее считывается информация о ДНК-HBV. Этот дополнительный этап репликации, не свойственный для других ДНК-содержащих вирусов, приводит к возможному появлению мутантных форм вируса гепатита В.

Изучение изолятов вируса гепатита В, выявленных в различных регионах мира, позволило установить наличие 6 основных генотипов, обозначенных А, В, С, D, Е и F. Определено, что HBV генотип F чаще выявляется у больных с тяжелым течением заболевания. В последние годы интерес исследователей вируса гепатита В был сконцентрирован на мутантной форме, обозначенный как Pre Core мутант вируса гепатита В. Установлено, что эта мутация возникает из-за замены одной аминокислоты (гуанин) на другую (аденин) в участке С-гена. У носителей вируса это приводит к прекращению синтеза НВеАg, атаке иммунных клеток на пораженные клетки и ухудшению самочувствия пациента. В подавляющем большинстве случаев эти больные плохо поддаются лечению препаратами интерферона. Всесте с тем продемонстрировано, что применяемые вакцины против гепатита В защищают человека от заражения различными генотипами и Pre Core мутантом вируса гепатита В.

Более тяжелому течению острого гепатита В способствуют следующие факторы: сопутствующие заболевания, такие, как сахарный диабет, язвенная болезнь, системные заболевания крови, прием наркотиков, тяжелые физические нагрузки и др.

Заражение вирусом гепатита В приводит к развитию инфекции с острым или хроническим течением заболевания. Причем инфекция может протекать как в желтушной, так и безжелтушной форме, их соотношение 1:6 - 1:8. Считается, что поражение гепатоцитов в основном связано не с непосредственным действием вируса, а с иммунопатологическими процессами. Так, механизм разрушения гепатоцитов в самых общих чертах может быть описан следующим образом: попав в кровь, вирус вызывает активацию В- и Т-клеточного звена иммунитета человека. Т-киллеры взаимодействуют с антигенами вируса гепатита В и антигенами главного комплекса гистосовместимости, представленными на поверхности печеночной клетки, вызывая разрушение гепатоцитов.

Кроме этого, значительную роль в развитии патологического процесса гепатита В играют аутоиммунные реакции, т.е. реакции на собственные компоненты гепатоцитов (полиальбумин, липополипротеид, фрагменты мембран митохондрий и др.). При этом происходит разрушение не только зараженных, но и незараженных гепатоцитов. В данном случае HBV играет пусковую роль в развитии аутоиммунного компонента гепатита В. Определенную роль имеют и циркулирующие иммунные комплексы HBsAg с антителами к нему. Считается, что эти комплексы определяют внепеченочные поражения при гепатите В, такие, как гломерулонефрит, узелковый периартериит и др.

Гепатит В может иметь легкое, средне-тяжелое и тежелое течение заболевания, включая фульминантный гепатит, который в большинстве случаев заканчивается смертью больного. Летальность при гепатите В составляет 0,4-1%. Более тяжелому течению острого гепатита В способствуют следующие факторы: сопутствующие заболевания, такие, как сахарный диабет, язвенная болезнь, системные заболевания крови, прием наркотиков, тяжелые физические нагрузки и др. К утяжелению инфекции приводит одновременное заражение вирусами гепатитов А, С и D. Так, например, известно, что острый гепатит С в подавляющем большинстве случаев имеет легкое течение, однако при сочетании с гепатитом В он протекает тяжело, иногда с летальным исходом.

Особенностью гепатита В является возможное развитие хронического гепатита В, который регистрируется в 5-10% случаев, при этом, очевидно, большая часть из них ассоциирована с присоединением дельта вирусной инфекции. Причины развития хронического процесса окончательно не установлены. Считается, что прежде всего это может быть связано с наличием у больного нарушений в клеточном звене иммунитета и с низкой продукцией эндогенно синтезированного интерферона. При гепатите В существует общая закономерность - чем в более раннем возрасте человек инфицируется вирусом, тем больше вероятность развития хронического гепатита. Так, при перинатальном инфицировании новорожденных, чьи матери помимо HBsAg имели НВеАg, хронический гепатит формируется в 80-90% случаев. У 15-20% больных хроническим гепатитом В происходит постепенное (5-20 лет) прогрессирование в цирроз, а у части из них - в первичный рак печени.

Гепатит В - "кузина СПИД"

Пaраллели между этими заболеваниями очень велики. Наличие вируса специфического фермента - ДНК-полимеразы, обладающей функцией обратной транскриптазы, позволяет называть вирус гепатита В как скрытый ретровирус. Обращает на себя внимание общность многих эпидемиологических характеристик СПИДа и гепатита В. Они касаются, в первую очередь, способов передачи заразного начала при обеих инфекциях: половой контакт, контаминированные вирусами инструменты при парентеральных манипуляциях, контаминированная кровь и ее продукты; передача от матери плоду или новорожденному. Соответственно, СПИД и гепатит В имеют общие группы риска. В случаях заражения гепатитом В лиц, инфицированных ВИЧ, инфекция быстро переходит в активную форму.

Первичный рак печени

Исследования, проведенные в различных странах мира, выявили, что около 80% всех случаев первичного рака печени связано с вирусом гепатита В. Наиболее часто он возникает у лиц старше 40-50 лет, страдающих циррозом печени. Вместе с тем необходимо отметить тенденцию к более частой регистрации первичного рака печени среди лиц молодого возраста.

Теоретически предполагают несколько путей реализации онкогенного действия HBV. Это возможное наличие в ДНК HBV нуклеиновых последовательностей с онкогенной функцией, так называемых онкогенов. Обнаружение белков, кодированных Х-геном HBV, в крови больных с первичным раком печени косвенно свидетельствует о роли этого антигена в развитии рака. Кроме того, предполагают, что HBV имеет свойство биологического мутaгена, приводящего к развитию этой опухоли печени. Взаимосвязь вируса гепатита В и первичного рака печени позволила предположить, что вакцинация против гепатита В снизит заболеваемость и первичным раком печени.

Бессимптомное носительство вируса

О носительстве HBV судят по обнаружению HBsAg в течение более шести месяцев при отсутствии клинических, морфологических и биохимических признаков гепатита. В настоящее время носительство HBV однозначно рассматривается как патологическое состояние организма. Длительный синтез HBsAg, в ряде случаев в течение всей жизни, связан с интеграцией ДНК HBV в геном гепатоцитов. Впервые гипотеза об интегративной природе носительства HBV высказана В.М. Ждановым и С. Хиршманом в конце 70-х годов, в дальнейшем она была экспериментально подтверждена. Носители HBsAg составляют основной резервуар вируса гепатита В. В настоящее время на земном шаре проживает более 300 млн бессимптомных носителей вируса, из них около 5 млн - в нашей стране. Многочисленные исследования продемонстрировали повсеместное, но неравномерное распространение носительства HBsAg. В России частота выявления колеблется от 1,5% в европейской части страны до 4-5% в Якутии и на Дальнем Востоке.

Состояние носительства может длиться до 10 лет и более. Ежегодно 1-2% носителей HBsAg спонтанно эллиминирует антиген. Причины и механизмы этого явления до сих пор не выяснены. В настоящее время отсутствуют эффективные методы и средства, способные исключить из гепатоцита интегрированный геном ДНК HBV.

Вакцины против гепатита В

Создание вакцины против гепатита В - одно из важнейших завоеваний человечества. Основой вакцины служит поверхностный антиген вируса гепатита В, поскольку было установлено, что лица, имеющие антитела к нему, повторно не заболевают. Источником антигена являлись сыворотка или плазма крови носителей HBsAg. Антиген очищали, подвергали инактивации, адсорбировали на гидроокиси алюминия и использовали в качестве вакцинного препарата. По источнику получения антигена такие вакцины обозначали как "плазменные". Эти вакцины обладали высокой иммуногенностью и были эффективны, однако имели существенный недостаток. Несмотря на то, что не было зарегистрировано ни одного случая заражения гепатитом В от введения вакцины, существовал теоретический риск возможного попадания HBV в готовую серию вакцины, так как она изготавливалась из заведомо зараженного материала. Открытие ВИЧ добавило опасений, связанных и с этим вирусом. Кроме того, прогресс молекулярной биологии позволил приступить к созданию вакцин против гепатита В нового поколения - рекомбинантных. Общая схема их получения включает следующие этапы: из молекулы ДНК HBV выделяли ген, отвечающий только за синтез HBsAg, который вводили в дрожжевые клетки; они начинали синтезировать антиген, который очищали от балластных белков. Полученный антиген, обладающий чрезвычайно высокой степенью очистки (99,99%), адсорбировали на гидроокиси алюминия и использовали в качестве вакцинного препарата. Благодаря высокой иммуногенности и чрезвычайно низкой реактогенности рекомбинантные вакцины широко используются во всем мире.

Читайте также: